INSTITUTO POLITÉNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

BIOQUÍMICA GENERAL
Bitácora de la práctica: Determinación de aminoácidos terminales con grupo
alfa amino libre: Método de Sanger
Alumnos: Reyes Nathan Ulises y Bautista Bautista Maria Guadalupe
“DR. GUILLERMO CARVAJAL SANDOVAL”
Grupo: 3OM4 Sección: Fecha de entrega: 03-09-2021

3. Metodología

1. Introducción a. Agregar en un tubo de 30g de

El primer método útil para determinar el
N-terminal de los polipéptidos fue
descrito por Frederick Sanger, quien
diseño un método, el cual consiste en el
marcaje del amino terminal a través del
uso de DNFB. La determinación de la
estructura primaria de una proteína
suele denominarse secuenciación. El
dinitrofluorobenceno (DNFB) es un
compuesto químico de color amarillo
que reacciona con los grupos libres en
condiciones ligeramente básicas
formando los dinitrofenil derivados
(DNP-aa), también reaccionará con los
grupos imidazol, fenólicos
epsilonamino, lo que dará una
dinitrofenilación en la cadena lateral de
la tirosina, histidina y lisina.
2. Objetivos
Identificar mediante el método de
Sanger el aminoácido alfa-amino
terminal que se encuentra en las
cadenas de la molécula de
hemoglobina.
Conocer el fundamento del método
Sanger.
Interpretar adecuadamente la
cromatografía.
hemoglobina y 2.4 ml de
NaHCO3 al 4.2%.
b. Añadir 2 ml de DNFB al 1%,
agitar constantemente por una
hora y mantener el pH entre 8 y
9, si es necesario NaHCO3 al
4.2%.
c. Ajustar el pH por debajo de 3 con
12 gota de HCl 3N.
d. Extraer 4 veces la suspensión
con volúmenes iguales con 5 ml
de éter saturado con solución
acuosa de FeSO4.
e. Evaporar los residuos de éter en
baño maría
y f. Centrifugar a 3000 rpm durante
15 min y eliminar el
sobrenadante.
g. Añadir 5 ml de HCl 6N y calentar
en autoclave 3 horas a 15 Ib de
presión.
h. Calentar los extractos etéreos y
enfriar. Añadir 0.5 ml de acetona
o alcohol absoluto y disolver.
i. Realizar la cromatografía en
papel.
a) Cortar una tira de papel
Whatman No. 1 de 22 x
50 cm, trazar tres líneas
paralelas de 2.5, 6.0 y 8.0
cm, doblar en abanico
cada medida.
b) Sobre la línea 8.0 cm
marcar 5 puntos
equidistantes y un círculo
de 5mm de diámetro.
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“DR. GUILLERMO CARVAJAL SANDOVAL”
Grupo: 3OM4 Sección: Fecha de entrega: 03-09-2021

c) En los 4 primeros puntos

colocar 7 a 9 aplicaciones
de los derivados
dinitrofenilados de los
aminoácidos. Al último
punto colocar 40 a 50
aplicaciones de la
muestra.
d) Secar después de cada
aplicación.
e) Colocar el cromatograma Tabla 1. Cromatografía en papel y valores de
es una cámara saturada Rf.
con solvente de ácido Resultados del cromatograma, del
cítrico y citrato de sodio problema 2.
0.1 M a pH de 6.4 por dos
horas.
f) Desarrollar en forma
descendente con el
mismo solvente en un
tiempo de 4 a 5 horas.
g) Sacar los cromatogramas
de la cámara y marcar
con el lápiz el frente del
disolvente, dejar secar.
h) Someter a vapores de
amoníaco. Tabla 2. Cromatografía en papel y valores de
i) Calcular los valores de Rf. Rf.

Se confirma que la muestra 2 es la

4. Resultado valina y el amino terminal es DNP-Val.

Los resultados que se obtuvieron a 5. Discusión

partir de la cromatografía realizada
fueron los siguientes:
Con la ayuda del método de Sanger se
identificó el grupo α-amino terminal
de la hemoglobina, destacando la
coloración amarilla característica de la
prueba, esto debido al proceso
intermedio llamado Dinitrofenilación
(donde se adiciona el grupo Dinitrofenil
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al amino terminal de la proteína). Para Terminales Con Grupo Alfa Amino

el proceso de identificación se realizó
una cromatografía en papel, donde se
agregó cada uno de los derivados
dinitrofenilados de los aminoácidos tipo
DNP-Phe, DNP-Val, DNP-Ala, DNFB,
solución problema. En los resultados se
hallaron similitudes entre la solución
problema y la solución de valina, que
despues al realizar los cálculos de Rf
confirmamos la similitud entre la
mancha 2 de la solución problema y
valina, ya que arrojaron datos muy
cercanos, revelando así al aminoácido
que contiene el grupo alfa-terminal de
la proteína de la hemoglobina.
Libre. Método De Sanger. Disponible
en:
https://es.scribd.com/document/26696
4620/DETERMINACION-DE-
AMINOACIDOS-TERMINALES-CON-
GRUPO-ALFA-AMINO-LIBRE-
METODO-
DE-SANGER (Consultado el 22 de
agosto del 2021).
Nelson D. L. y COX M.M. 2014.
Principios de bioquímica de Lehninger.
6ª. Ed. Editorial Artmed, Pp 170.

6. Conclusión
1. Preguntas extra
Por lo obtenido en la cromatografía y
los resultados de Rf podemos concluir
que el aminoácido que corresponde al
grupo amino terminal de la
hemoglobina es la valina.

7. Referencias

Programa Educativo Por Qué De los siguientes aminoácidos indicar:

Biotecnología. (2021). El Cuaderno.
Por Qué Biotecnología. ¿Qué aminoácido es?
https://www.porquebiotecnologia.com.
R= Triptófano
ar/el-cuaderno
¿Qué nombre tienen su grupo R?
BOHINSKI R. Bioquímica. 1976.
Fondo Educativo Interamericano. R= Grupos R aromáticos

El grupo R ¿podría reaccionar con el

Lopez-Ramirez S. y Mendoza-Garces DNFB durante la reacción de marcaje?
D. Determinación De Aminoácidos
R= Si, si podría.
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alfa amino libre: Método de Sanger
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¿Qué aminoácido es? ¿Qué aminoácido es?

R= Lisina. R= Dinitrofluorobenceno

¿Qué nombre tienen su grupo R? ¿Qué nombre tienen su grupo R?

R= Aminoácido N-terminal de los

R= Grupos R cargados positivamente.
polipéptidos.
El grupo R ¿podría reaccionar con el El grupo R ¿podría reaccionar con el
DNFB durante la reacción de marcaje? DNFB durante la reacción de marcaje?

R= No, no podría. R= Si, si podría, pero para pueda

reaccionar debe desprotonarse y para
ello se utiliza un medio básico como el
bicarbonato.

¿Qué aminoácido es?

R= Histidina.

¿Qué nombre tienen su grupo R?

R= Grupos R cargados positivamente.

El grupo R ¿podría reaccionar con el

DNFB durante la reacción de marcaje?

R=No, no podría.