INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

BIOQUÍMICA GENERAL
Bitácora de la práctica: “Determinación de aminoácidos terminales
con grupo alfa amino libre. Método de sanger”
Hernandez Anguiano Javier Grupo: 3IV2

INTRODUCCIÓN
Un aminoácido es una pequeña molécula orgánica que contiene, al menos, un
grupo amino (-NH2), de naturaleza básica, y un grupo carboxilo (-COOH), de
carácter ácido. Aunque los seres vivos sintetizan para distintos propósitos diversos
tipos de aminoácidos, sin duda los más importantes son los que forman parte de
las proteínas, todos los cuales pertenecen al grupo de los - aminoácidos. Los -
aminoácidos se caracterizan por presentar el grupo carboxilo y el grupo amino
unidos al mismo átomo de carbono. Un aminoácido terminal se refiere al extremo
de una proteína o polipéptido que finaliza con un aminoácido que posee un grupo
amino libre.
En 1943 Frederick Sanger comenzó a trabajar con proteínas, estudió los grupos
terminales de la molécula porque había descubierto que esta abundaba en grupos
terminales α-amino libres, lo que indicaba la presencia de grupos αamino libres en
el extremo de cadenas cortas. (La insulina era una proteína de gran interés
médico debido al descubrimiento de Banting y Best,) Sanger utilizó un reactivo
llamado dinitrofluorobenceno o 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno de coloración amarilla
que reaccionar con los grupos alfa-amino libres y con los grupos imidazol,
fenólicos y épsilon-amino.
OBJETIVOS
1. Identificar el aminoácido alfa-amino terminal de las cadenas de la molécula de
hemoglobina mediante el método de Sanger.
2. Utilizar la técnica de cromatografía para separar e identificar los aminoácidos
dinitrofenilados
3. Determinar los valores de Rf, como parámetros de identificación.
 METODOLOGÍA

A. preparación del derivado dinitrofenilado de la hemoglobina

Colocar 30mg de la Adicionar 2.4 mL de

bicarbonato de sódio ( Disolver la proteína.
hemoglobina en un tubo
con tapón de rosca. Na HC O 3 ¿ al 4.2%.

Ajustar el pH debajo de 3 Verificar pH con Agitar por 1 hora y Añadir 2 mL de

con 12 gotas de HCl 3N. papel indicador. mantener un pH de 8.9. DNFB al 1%.

Extraer 4 veces la
Agitar hasta Centrifugar a
suspensión en el tubo, con Colocar el tubo con la
evaporar los 3000 rpm por 15
5 mL de éter saturado y 5 proteína en baño María
residuos de éter minutos
mL de sulfato de fierro.

Realizar 3 lavados Agregar al contenido Rotular el tubo y calentar

Añadir 5 mL de
con 5 mL de éter del tubo 5 mL de en autoclave 3 horas a 15
HCl 6N.
cada vez. H2O destilada. libras de presión.

Calentar los Enfriar y disolver el Realizar la

Colocar las fases étereas
en un vaso de precipitado.
Al finalizar, desechar la
fase acuosa.
extractos etéreos residuo en 0.5 mL cromatografía en
en una parrilla de acetona o papel del derivado
casi a sequedad. alcohol absoluto. dinitrofenilado de la
hemoglobina.
 B. Cromatografía en papel de los aminoácidos dinitrofenilados tipo y la
muestra problema
Trazar con lápiz, a lo Doblar sobre la Sobre la línea
Cortar una tira ancho del papel, tres primera línea hacia el de 8.0 cm (línea
de papel líneas paralelas a 2.5, 6.0 frente y la segunda de aplicación)
Whatman No. 1 y 8.0 cm en total a partir de línea hacia atrás.
de 22 x 50 cm uno de los extremos.

Marcar con lápiz 5

Tipo: DNP-Phe, Colocar de 7 a 9 puntos equidistantes
En los primeros
DNP-Asp, DNP-Val aplicaciones de los y un círculo de 5 mm
4 puntos
y DNFB, derivados dinitrofenilados de diámetro sobre
respectivamente. de los aminoácidos. cada punto.

Colocar el cromatograma en Dejarlo

En el punto faltante
colocar 40 a 50
aplicaciones de la
muestra problema.
Secar después de cada
una cámara previamente saturar
aplicación. (Los Dinitrofenilados
saturada con el solvente de mínimo 2
pueden variar dependiendo de la
ácido cítrico y citrato de horas.
disponibilidad).
sodio 0.1 M a pH de 6.4
 Desarrollar en forma
Circunscribir el lugar donde se Marcar con Sacar los descendente con el
encuentran las manchas de lápiz el frente cromatogramas mismo solvente (ácido
los derivados dinitrofenilados del solvente y de la cámara e cítrico-citrato de sodio)
tipo, del DNFB y de la dejarlos secar; inmediatamente. por un tiempo de 4.5 a 5
muestra problema. horas, aproximadamente.

Para intensificar el color

amarillo de los derivados Medir las distancias
dinitrofenilados se correspondientes
puede someter la hoja a para calcular los
vapores de amoníaco. valores de Rf.

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