Está en la página 1de 2

4QM1 SECCION 1

4QM1 SECCION 1 *LOPEZ RAMIREZ STEPHANY *MENDOZA GARCES DANIA FERNANDA INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE

*LOPEZ RAMIREZ STEPHANY

*MENDOZA GARCES DANIA FERNANDA

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA

DR. GUILLERMO CARVAJAL SANDOVAL

4QM1 SECCION 1 *LOPEZ RAMIREZ STEPHANY *MENDOZA GARCES DANIA FERNANDA INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE

PRACTICA N°1: DETERMINACION DE AMINOACIDOS TERMINALES CON GRUPO ALFA AMINO LIBRE. METODO DE

SANGER

*INTRODUCCION

En el procedimiento para establecer la secuencia

aminoácido, son muy importantes los métodos usados

para identificar los restos aminoácidos terminales. El

primer método útil para determinar el N-terminal de los

polipéptidos fue descrito por Sanger, quien encontró que

el grupo alfa amino libre de los péptidos, que no han

captado protones, reaccionan con el 2,4-

dinitrofluorobenceno (DNFB) y forma derivados 2,4-

dinitrofenilados. Cuando tales derivados de un péptido se

someten a hidrolisis con HCl 6 N, todos los enlaces

peptídicos se hidrolizan, pero el enlace entre el grupo

2,4-dinotrofenilo y el grupo alfa amino del aminoácido N-

terminal es relativamente estable frente a la hidrólisis

ácida. Por lo consiguiente, el hidrolizado del péptido

dinitrofenilado contiene todos los restos aminoácidos de

la cadena peptídica en forma de aminoácidos libres, a

excepción del resto N-terminal, el cual aparece como

derivado 2,4-dinitrofenilado, de color amarillo. Este resto

marcado puede separarse

fácilmente de los aminoácidos no sustituidos e

identificarse por comparación cromatografía con los

derivados dinitrofenilados conocidos de los diferentes

aminoácidos.

*OBJETIVOS

-El alumno utilizara el método de Sanger para identificar

los aminoácidos del grupo alfa-amino terminal de la

hemoglobina.

*METODOLOGIA

  • 1. Agregar en un tubo 30g de Hemoglobina y 2.4 mL de

NaCO 3 4.2%.

  • 2. Añadir 2 mL de DNFB al 5%. Agitar por una hora y

mantener un pH de entre 8-9.

  • 3. Ajustar el pH por debajo de 3 con 12 gotas de HCl 3N.

  • 4. Extraer 3 veces la suspensión con 7 mL de éter

saturado con solución acuosa de FeSO 4.

  • 5. Evaporar los residuos de éter en baño maría.

6, Centrifugar a 3000 rpm durante 15min. Eliminar el

sobrenadante.

  • 7. Añadir 5 mL de HCl 6 N y calentar en autoclave 3h a

15 lb por pulgada cuadrada de presión.

8. Recoger el contenido del tubo con 5 mL de agua en un

vaso de pp. Extraer 3 veces el hidrolizado con 7 mL de

éter. Pasar a un vaso de pp.

9. Calentar los extractos etéreos y enfriar. Añadir 0.5mL

de acetona y redisolver

10. Realizar cromatografía.

*INTERPRETACION DEL PROCEDIMIENTO

Determinación del aminoácido N-terminal de la

proteína.

ON DEL DNFB QUE NO no se I AC elimina el DNFB REACCIONO 4) Al extraer
ON DEL DNFB QUE NO
no
se
I
AC
elimina el DNFB
REACCIONO
4)
Al extraer la fase etérea (paso
DINITROFENILIZACI
HIDROLISIS DE LA DNP-
PROTEINA
que
reacciono con el N-terminal.
ELIMIN

La hidrolisis se lleva acabo con el HCl 6N, el cual rompe

todos los enlaces peptídicos. Pero se mantiene el enlace

entre el dinitrofenilo y el grupo amino. Todo esto bajo las

condiciones de la autoclave (3 h y 15 lb de presión) por

qué se necesita más energía para romper dichos

enlaces.

IDENTIFICACION DEL RESIDUO

N-TERMINAL

POR CROMATOGRAFIA EN PAPEL.

*RESULTADOS

COMPUESTO

Rf

DNP-Asp

0.689

DNP-Val

0.656

4QM1 SECCION 1

*LOPEZ RAMIREZ STEPHANY

*MENDOZA GARCES DANIA FERNANDA

DNP-Glu

0.712

DNFB

0.423

PROBLEMA

0.620 y 0.420

*CONCLUSIONES

*ANALISIS DE RESULTADOS

En base a lo realizado en la práctica, la reacción de

sanger nos ayudó a identificar el grupo α-amino terminal

de la hemoglobina, poniendo en evidencia la coloración

amarilla característica de esta prueba, esta gracias al

proceso intermedio llamado Dinitrofenilacion, que es la

adición del grupo Dinitrofenil al amino terminal de la

proteína. El proceso de identificación consto de en una

cromatografía en papel, colocando en él, cada uno de los

derivados dinitrofenilados de los aminoácidos tipo DNP-

Asp, DNP-Val, DNP-Glu, DNFB, solución problema,

notando una similitud entre la solución problema y la

solución de valina, la cual se confirmó con cálculos de

Rf, donde la valina fue el dato más cercano al del

problema denotando así a este aminoácido como el que

contiene el grupo alfa-terminal de la proteína de la

hemoglobina, igualmente se observó la aparición de una

mancha que por medio de Rf que indico la presencia de

DNFB que no reacciono lo cualquier decir que los

lavados no se hicieron correctamente.

El método de Sanger es muy útil para identificar solo un

aminoácidos alfa amino terminal de las cadenas de las

moléculas de las proteínas, en este caso dela

hemoglobina. Es muy método muy preciso y confiable

pero tiene la desventaja de ser muy tardado, si se

comprar con los métodos de identificación actuales

resulta ser un poco obsoleto. La cromatografía revelo la

afinidad que tienen diferentes aminoácidos y el DNFB

con la hemoglobina.

*BIBLIOGRAFIA

*Lehninger, Albert, Nelson, David L. (1993). Principios de

Bioquímica´. Segunda Edición, Ediciones Omega,

Barcelona, España.

4QM1 SECCION 1 *LOPEZ RAMIREZ STEPHANY *MENDOZA GARCES DANIA FERNANDA DNP-Glu 0.712 DNFB 0.423 PROBLEMA 0.620