3FV1 SECCIÓN 2. ZAMORA M. CESAR O. /ALFARO P. KAREN I.

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIÓNAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA

PRACTICA 1.- DETERMINACION DEL AMINO TERMINAL

DE LA HEMOGLOBINA POR EL METODO DE SANGER

INTRODUCCIÓN: Después de la hidrólisis, solo el derivado del grupo

amino terminal del aa original tendrá su grupo α-
La determinación de la estructura primaria (orden amino bloqueado. Así pues los DNP-α-aminoácidos
lineal de los aminoácidos presentes) de una proteína pueden separarse de otros (extracción simple). Con
suele denominarse secuenciación. Existen varias métodos cromatográficos se podrá identificar a los
maneras de determinar la secuencia de aminoácidos DNP-α-aminoácidos
(aa), el primero en lograr esto fue Frederick Sanger,
quien diseño un método el cual consiste en el RESULTADOS:
marcaje del amino libre a través del uso de DNFB.
Con la cual logro secuenciar la insulina. Tabla 1 Datos de rf
Compuesto Rf
La convención para la designación del orden, el
DNP-Asp 0.617
extremo N-terminal (es decir, el extremo que lleva el
DNP-Val 0.672
residuo con el grupo α-amino libre) está al extremo
DNP-Phe 0.634
izquierdo (y el aminoácido número 1) y el extremo C-
DNFB 0.485
terminal (es decir, el extremo con el residuo que
Muestra problema 0.403 y 0.661
contiene al grupo α-carboxilo libre) está a la derecha.

OBJETIVO:

El alumno deberá identificar el aminoácido alfa- Imagen de la cromatografía tomada en práctica de

amino terminal mediante el método de Frederick laboratorio donde se muestra el desplazamiento de
Sanger. los compuestos según su polaridad.

DISCUSION/INTERPRETACIÓN DE ANÁLISIS DE RESULTADOS:

METODOLOGÍA: En base a los resultados se puedo
1.- Dinitrofenilacion de la hemoglobina; 2.- observar, que el método de sanger
Eliminación de DNFB que no reacciono; 3.- Hidrolisis pudo ayudarnos a terminar el grupo
de la proteína dinitrofenilada; 4.-Identificación del aminoácido terminal de la
residuo amino-terminal por hemoglobina, esto gracias al
cromatografía. proceso intermedio llamado
dinitrofenilacion que es la adición
Si tenemos el 2,4-dinitrofenil- del grupo dinitrofenil al amino
péptido y lo hidrolizamos por terminal de la hemoglobina. En el
hidrólisis ácida, se hidrolizarán proceso de identificación que se
todos los enlaces peptídicos y llevo acabo en una cromatografía
obtendremos el dinitrofenil del 1er Ilustración 3
donde se adicionaron diferentes
aa de la secuencia, el –NH2 Cromatografía
aminoácidos terminales (DNP-Asp,
terminal, más el resto de los aa DNP-Val, DNP-Phe y DNFB) así
disgregados en el medio.
como la muestra problema, se puedo observar una
En esta reacción, el núcleo Ilustración 1 gran similitud entre la muestra problema y el
coloreado de dinitrobenceno se Diferencia de fases aminoácido DNP-Val, la cual los datos obtenidos en el
une al átomo de nitrógeno del aa Rf la valina fue el aminoácido mas cercano.
para producir un derivado amarillo
(2,4-dinitrofenil o DNP-aa). CONCLUSIÓN:

El compuesto DNFB reaccionara con
el grupo amino libre del extremo
amino de un polipéptido, así como
también con los grupos amino de los
aa libres. El enlace C–N que se forma
es más estable que un enlace
peptídico. Asi reacciona un
polipéptido intacto con el DNFB,
hidrolizando la proteína en ácido y
aislando los DNP-aa coloreados, Ilustración 2
puede identificarse el grupo amino Suspensión etérea y
terminal del aa en una cadena acuosa
polipeptídica.
El método de Sanger es muy preciso y fiable para
determinar aminoácidos alfa-amino terminal de las
cadenas de las moléculas de proteínas, aun que una
de las desventajas es que es un método tardado.
BIBLIOGRAFÍA:
 Lehninger, Albert, Nelson, David L. (1993).
Principios de Bioqumica. Segunda Edición,
Ediciones Omega, Barcelona, España.