UNIVERSIDAD AUTÓNOMA BENITO JUÁREZ DE OAXACA

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO

CLAVE DE LA
CARRERA PLAN DE ESTUDIOS NOMBRE DE LA ASIGNATURA
ASIGNATURA
QFB 2009 BIOQUÍMICA

PRÁCTICA FECHA Y
NOMBRE DE LA PRÁCTICA
NÚMERO DURACIÓN
45 Determinación de colesterol total por método enzimático 1 sesión
1 INTRODUCCIÓN
El colesterol es una sustancia grasa presente en todas las células del organismo. El hígado produce
naturalmente todo el colesterol que necesita para formar las membranas celulares y producir ciertas
hormonas. La determinación del colesterol es una de las herramientas más importantes para el
diagnóstico y clasificación de las lipemias. El aumento del nivel de colesterol es uno de los principales
1,2
factores de riesgo cardiovascular .
El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

2 OBJETIVOS
Realizar la cuantificación de colesterol total en suero sanguíneo por el método enzimático.

3 FUNDAMENTO
Tanto el colesterol libre como el esterificado presentes en la muestra originan, según las reacciones
3,4
acopladas descritas a continuación, un complejo coloreado que se cuantifica por espectrofotometría .

Colesterol esterasa
Colesterol esterificado + H2O Colesterol + Ácidos grasos

Colesterol oxidasa
Colesterol + O2 + H2O Colestenona + H2O2

Peroxidasa
H2O2 + 4-Aminoantipirina + fenol Quinonaimina + H2O

La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de colesterol total presente en la

muestra ensayada.

4 PROCEDIMIENTO
A EQUIPO, MATERIAL Y REACTIVOS NECESARIOS MATERIAL DE APOYO
Material común de laboratorio.
REACTIVOS:

Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado

analítico, cuando se indique agua, debe entenderse agua destilada.

− Reactivo de colesterol total (Pipes 35 mmol/L, colato sódico

0,5 mmol/L, fenol 28 mmol/L, colesterol esterasa > 0,2 U/mL,
colesterol oxidasa > 0,1 U/mL, peroxidasa > 0,8 U/mL, 4-
aminoantipirina 0,5 mmol/L, pH 7,0).
− Estándar de colesterol total 200 mg/dL (2,26 mmol/L). Patrón
primario acuoso.
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− Alcohol etílico.
− Agua destilada.

MATERIALES:

− Tubos primarios al vacío para toma múltiple con gel

separador.
− Torundas.
− Torniquete.
− Agujas para extracción sanguínea múltiple.
− Tubos de ensaye de 13X100.
− Pipeta automática de 10-100 μL.
− Pipeta automática de 100-1000 μL.
− Puntas amarillas para pipeta automática.
− Puntas azules para pipeta automática.
− Celdas para espectrofotómetro.

MATERIAL BIOLÓGICO:

− Suero sanguíneo humano.

− Suero control de origen humano de concentración “normal”.
− Suero control de origen humano de concentración
“patológica”.

APARATOS E INSTRUMENTOS

Los aparatos que a continuación se indican deben estar

calibrados y ser ajustados antes de su operación:

− Espectrofotómetro.
− Centrifuga.

B DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA.

1. Extracción de una muestra de sangre venosa.

a. El paciente deberá cumplir con un ayuno de 12 horas para poder realizar la extracción
de una muestra de sangre total por punción venosa en un tubo con gel separador. Esta
muestra será el tubo primario.
b. Esperar 15 minutos para que la muestra coagule completamente.
c. Centrifugar la muestra durante 5 minutos a 2500 r.p.m.
d. Concluido el proceso de centrifugación verificar que el gel separador se encuentre entre
las dos fases de la sangre total y que el suero sea transparente y no presente hemólisis.
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PROCEDIMIENTO.

Preparación del reactivo de trabajo.

2. El reactivo de trabajo viene listo para su uso.

Determinación y cuantificación de colesterol total.

3. Rotular 5 tubos de ensaye y pipetear en cada uno de ellos el volumen de muestras que se
indica.

Número de tubo 1 2 3 4
Volumen en µL de
solución estándar de
0 10 0 0
colesterol total 200.0
mg/dL
Volumen en µL de
muestra de suero 0 0 10 0
sanguíneo humano
Volumen en µL de suero
0 0 0 10
control “normal”

4. Enseguida, adicionar a todos los tubos 1 mL de reactivo de colesterol total, mezclar e incubar 10
min a temperatura ambiente.

5. Leer la absorbancia (A) a 500 nm contra el blanco de reactivo. El color es estable durante dos
horas. Anotar las lecturas.

6. Hacer los cálculos para determinar la concentración de las muestras y controles.

C EXPRESIÓN DE RESULTADOS E INFORME DE LA PRUEBA.

MÉTODO DE CÁLCULO.
A de la muestra Concentración
Concentración de colesterol = X del estándar
A del estándar

INFORME DE LA PRUEBA

1. Elaborar una tabla con los datos obtenidos por su equipo y por el resto de los estudiantes, tanto
para las muestras como para los controles.
2. Comparar los datos obtenidos con los esperados para los controles comerciales (normal y
patológico).

5 INTERPRETACIÓN Y CONCLUSIONES
Se elaboraran de acuerdo a los resultados obtenidos y la importancia diagnóstica de la prueba.
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6 ANEXOS
CUESTIONARIO.
1. ¿Qué entendemos por riesgo aterogénico?
2. ¿Cuál es la importancia diagnóstica de la determinación del colesterol total?
3. ¿Existe alguna diferencia en los valores de referencia entre hombres y mujeres? ¿por qué?

7 REFERENCIAS
1. Burtis A et al. Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3rd ed AACC 1999.
2. Tietz N W et al. Clinical Guide to Laboratory Tests, 3rd ed AACC 1995.
3. Allain CC, Poon LS, Chan CSG, Richmond W and Fu PC. Enzymatic determination of total serum
cholesterol. Clin Chem 1974; 20: 470-475.
4. Meiattini F, Prencipe L, Bardelli F, Giannini G and Tarli P. The 4-hydroxybenzoate/4-
aminophenazone chromogenic system used in the enzymic determination of serum cholesterol.
Clin Chem 1978; 24: 2161-2165.

8 MECANISMO DE EVALUACIÓN
Puntualidad y asistencia 40%
Bitácora 20%
Reporte 20%
Conocimientos previos 20%

9 MEDIDAS DE SEGURIDAD Y SALUD OCUPACIONAL

1. Se deberá utilizar antifaz de seguridad, guantes, cubrebocas y gorro.
2. Se deberá tener el cuidado respectivo al manejo de material a altas temperaturas.
3. Al pesar o medir reactivos evite tirarlo o derramarlos en el sitio donde se encuentre, en caso de
hacerlo limpiar perfectamente el lugar.
4. Al medir las muestras biológicas evite tirarlas o derramarlas y sigue los procedimientos
generales de manipulación para evitar cualquier riesgo biológico.
5. Cubrir las medidas de seguridad básicas para el laboratorio.

En caso de accidente (por pequeño que este sea) debe comunicarse de inmediato al maestro
responsable del laboratorio.

10 DISPOSICIÓN DE DESECHOS QUÍMICOS, FÍSICOS Y BIOLÓGICOS.

1. Los recipientes que tengan residuos de naturaleza lipídica, se limpiarán con papel absorbente
antes de lavarlos en la tarja y estos papeles se tirarán en el bote de basura del laboratorio.
2. Los RPBI se desecharán en los contenedores destinados para ello.

Elaboró: M.C. Juan Antonio Ambrosio Girón.