RE-10-LAB-047 ENSAYOS BIOLOGICOS DE MEDICAMENTOS v3

GUIAS DE PRÁCTICA CIENCIAS DE LA SALUD QUIMICA
Código de registro: RE-10-LAB-047 Versión 3.0
UNIVERSIDAD DEL VALLE

LABORATORIO DE ENSAYOS BIOLOGICOS DE MEDICAMENTOS
Práctica No. 1
VALORACIÓN MICROBIOLÓGICA DE ANTIBIÓTICOS
1. CONOCIMIENTO TEORICO REQUERIDO.-
La valoración de antibióticos en la Industria Farmacéutica constituye una especialidad que

requiere de muchas disciplinas, como: bacteriología, farmacología, estadística, etc. Existen
varios métodos biológicos de valoración, así tenemos, el método de excavación, el método
mediante cilindros, el método de discos y el método turbidimétrico.
El método para valorar Amoxicilina es un ejemplo típico descrito en las Farmacopeas. Cada
antibiótico requiere de una cepa de bacterias, un medio de cultivo especial y un conjunto de
normas bien establecidas.
AGAR MÜLLER-HINTON
El agar Müller-Hinton es un medio de cultivo microbiológico utilizado comúnmente para realizar

la prueba de susceptibilidad a antibióticos. También es usado para aislar y mantener especies
de Neisseria y Moraxella.
Contiene:
• 2g de extracto de carne
• 17,5g de hidrolizado de caseína
• 1,5g de almidón
• 17g de agar
Disueltos en 1L de agua destilada, a un pH ajustado de 7,3±0,1 a 25ºC
También puede añadirse un 5% de sangre de oveja y NAD cuando se realiza la prueba de

susceptibilidad en especies de los géneros de Streptococcus o Campylobacter.
Tiene varias propiedades que lo hacen ideal para el uso de antibióticos sobre él. En primer
lugar es un medio no selectivo y no diferencial, lo que significa que prácticamente todos los
microorganismos cultivados crecerán en su superficie. Por otra parte, es un agar suelto, lo que
permite una mejor difusión de los antibióticos (a diferencia de otros con mayor proporción de
agar), por lo que se observarán las zonas de inhibición verdaderas. Además, contiene almidón,
que absorberá las toxinas liberadas por las propias bacterias, de modo que no interfieran con
los antibióticos
AMOXICILINA
La amoxicilina es un antibiótico semisintético derivado de la penicilina. Se trata de una

aminopenicilina. Actúa contra un amplio espectro de bacterias, tanto Gram positivas como
negativas. Por esta razón se emplea a menudo como primer fármaco de elección en infecciones
de diferente gravedad, tanto en medicina humana como veterinaria. Se usa por vía oral.
A pesar de su amplio espectro, no es estable frente a beta lactamasas, por lo que no debe
usarse frente a infecciones con bacterias productoras de las mismas. Sin embargo, hay
preparados comerciales con la adición de ácido clavulánico o sulbactam, que aumentan su
estabilidad y amplían su espectro en estos casos.
Como todas las penicilinas puede provocar reacciones alérgicas seberas o efectos secundarios
como fiebre, náuseas, vómitos o diarrea.
Mecanismo de acción
Como las demás penicilinas, la amoxicilina impide la correcta formación de la pared celular en
las bacterias. Concretamente inhibe la conexión entre las cadenas peptidoglicáneas lineares
que forman la mayor parte de las paredes de los microorganismos Gram-positivos. Al impedir
que la pared celular se construya correctamente, la amoxicilina ocasiona, en último término, la
muerte del microorganismo.
Es absorbida rápidamente en el intestino delgado (disponibilidad de aproximadamente el 80%)

tanto en ayunas como tras la ingesta de alimentos. Es eliminada con la orina sin ser
metabolizada.
Indicaciones
La amoxicilina está indicada en el tratamiento de infecciones sistémicas o localizada causadas

por microorganismos Gram-positivos y Gram-negativos, y algunos anaerobios sensibles, en el
aparato respiratorio, tracto gastrointestinal o genitourinario, de piel y tejidos blandos y
odontoestomatológicos. También está indicado en la enfermedad o borreliosis de Lyme, en el
tratamiento de la infección precoz localizada (primer estadio o eritema migratorio localizado) y
en la infección diseminada o segundo estadio. Tratamiento de erradicación de Helycobacter
pylori en asociación con un inhibidor de la bomba de protones y en su caso a otros antibióticos.
Prevención de endocarditis bacterianas en paciente de riesgo, tejidos blandos u
odontoestomatológicos.
ESCHERICHIA COLI
Es una bacteria Gram-negativa con forma de bacilo de la familia de las enterobacterias que se
encuentra en el tracto gastrointestinal de humanos y animales de sangre caliente.
E. coli es la bacteria anaerobia facultativa comensal más abundante de la microbiota; asimismo,

es uno de los organismos patógenos más relevantes en el humano, tanto en la producción de
infecciones gastrointestinales como de otros sistemas (urinario, sanguíneo, nervioso).
La E. coli, en su hábitat natural, vive en los intestinos de la mayor parte de los mamíferos sanos.
Es el principal organismo anaerobio facultativo del sistema digestivo. En individuos sanos, es
decir, si la bacteria no adquiere elementos genéticos que codifican
2. COMPETENCIAS.-
El estudiante es capaz de realizar un antibiograma para demostrar la adtividad de 2

amoxicilinas de diferente marca y así compararlas, de esta manera también comprueba la
actividad del fármaco.
3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.-
EQUIPOS y MATERIALES
Ítem DENOMINACIÓN Cantidad Unidad Observaciones
1 Cajas petri 45 Pieza
2 Autoclave 1 Equipo
3 Gotero 5 Pieza
4 Matraz Erlenmeyer 500ml 5 Pieza Se formarán 5 grupos,
5 Espátula 5 Pieza los cuales se
6 Balanza Analítica 1 Equipo repartirán los
7 Estufa 1 Equipo materiales de forma
8 Asas bacteriológicas 5 Pieza equitativa
9 Probeta 100ml 5 Pieza
10 Espectrofotómetro 1 Equipo
11 Tubos de ensayo Pieza
INSUMOS
1 Muestras de Amoxicilina de distintas marcas 5 Unidad
2 Agar Müller-Hinton 5 g Las cantidades de los
3 Agar nutritivo 5 g reactivos son para el uso
4 E. coli Aislado 5 ml de todos los grupos de
5 Solución fisiológica 1000 ml forma equitativa
6 Agua destilada c.s.p. ml
4. TECNICA Ó PROCEDIMIENTO.-
PRIMERA PARTE:
• Esterilizar los materiales

• Realizar la activación de la bacteria, aislando en tubos con agar nutritivo a nuestra
muestra de E. coli, para lo cual se repica 2 veces y se obtiene una muestra pura.
• Se pesa 32g por 1000ml del agar Müller-Hinton, se hace ebullir y se lleva al autoclave
a 121ºC por 15 minutos
• Diluir el patrón de E. coli activada en solución fisiológica, homogeneizar y llevar a
estectrofotómetro utilizando filtro 6, obtener una absorbancia de 0,4.
• Colocamos nuestra solución de bacteria en las cajas Petri, colocar encima el agar,
esperar que se agarice para realizar el antibiograma.
SEGUNDA PARTE:
• Realizar diluciones de las muestras de antibiótico y utilizar un estándar de entre las

muestras.
• Se realiza la preparación de 9 cajas Petri con agar
• Utilizar un cuadro latino 6x6 para observar la resistencia o sensibilidad del antibiótico.
• Realizar las diluciones de la amoxicilina: dilución alta 0,0468mg/ml; dilución media
0,0234mg/ml; dilución baja 0,0117mg/ml
• Realizar 4 huevos en el agar y colocar con cuidado una gota del antibiótico
correspondiente de acuerdo al sistema 6x6
• Luego se deja incubar por una semana a 36ºC y se observa si existen halos de
inhibición provocados por los antibióticos
• Finalmente se mide el diámetro de cada halo.
5. TIEMPO DE DURACION DE LA PRÁCTICA.-
300 minutos.
6. MEDICIÓN, CALCULOS Y GRAFICOS.-
Buscar el sistema latino 6x6
7. CUESTIONARIO.-
• ¿Qué es un diseño experimental?

• ¿A qué se denomina actividad antibiótica?
• ¿Cuál es la equivalencia de actividad de la penicilina en UI/L?

Práctica No. 2
DOSIFICACIÓN DE HEPARINA
La heparina es un glicosaminoglicano muy sulfatado, se utiliza

como anticoagulante inyectable, y tiene la densidad de carga más alta conocida de todas
las biomoléculas. También se puede utilizar para formar una superficie interior anticoagulante
en diversos dispositivos experimentales y médicos tales como tubos de ensayo y máquinas
de diálisis renal.
A pesar que su uso principal en medicina es como anticoagulante, su verdadero papel
fisiológico en el cuerpo permanece incierto, debido a que la anticoagulación de la sangre se
consigue principalmente mediante proteoglicanos de sulfatos de heparina derivados de las
células endoteliales. La heparina se almacena generalmente dentro de los gránulos secretores
de mastocitos y se libera en el sistema vascular sólo en los sitios de lesión de los tejidos. Se
ha propuesto que, en lugar de anticoagulación, el propósito principal de la heparina es la
defensa en tales sitios contra las bacterias invasoras y otros materiales extraños. Además, esto
se observa a través de un número amplio de diferentes especies, incluyendo algunos
invertebrados, que no tienen un sistema de coagulación de la sangre similar.
En la naturaleza, la heparina es un polímero con una cadena de tamaño variable. La heparina
no fraccionada como producto farmacéutico es heparina que no ha sido fraccionada para aislar
la fracción de moléculas con bajo peso molecular. En cambio, la heparina de bajo peso
molecular se ha sometido a fraccionamiento para el propósito de hacer
su farmacodinámicamás predecible.
La heparina está en la lista de medicinas esenciales de la OMS, una lista con la medicación
más importante necesaria en un sistema de salud básico.
2. COMPETENCIAS.-
Valora la actividad anticoagulante de las formas farmacéuticas elaborados con heparina y lo

relaciona con el campo de trabajo del profesional
1 Tubos para hemólisis 30 Pieza
Se formarán 5 grupos,
2 Pipeta 5ml 5 Pieza
los cuales se
3 Pipeta 0,1; 0,2; 0,5ml 5 c/u Pieza
repartirán los
4 Gradilla 5 Pieza
materiales de forma
5 Baño María 1 Equipo
equitativa
6 Cronómetro 5 Pieza
INSUMOS
1 Plasma 75 ml
2 Cloruro de calcio (20g/L) 15 ml Las cantidades de los
reactivos son para el uso
3 Cloruro de sodio (9g/L) 35 ml
de todos los grupos de
4 Sustancia patrón de Heparina 40 ml forma equitativa
5 Hielo 300 g
Colocar los tubos en 2 series, serie patrón (P) y serie de dosificación (D), en una cesta-gradilla
y esta en una mezcla de agua + hielo.
Efectuar las reparticiones indicadas en la tabla:
Numero de tubos E1 D1 E2 D2 E3 D3 E4 D4 E5 D5 E6 D6
Cantidad de heparina 0 0 0.1 0.1 0.2 0.2 0.3 0.3 0.4 0.4 0.5 0.5
por tubo
Solución patrón de 0 0.1 0.2 0.3 0.3 0.4 0.5
heparina
Sol. de heparina por 0 0.1 0.2 0.4 0.5
dosificar
Solución de NaCl 0.9% 0.8 0.8 0.7 0.7 0.6 0.6 0.5 0.5 0.3 0.3 0.2 0.2
Solución de CaCl2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
Plasma 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Agitar los tubos invirtiéndolos (mismo número de veces para todos los tubos).
Meter en baño maría a 37ºC durante 1 hora.
200 minutos.
- Interpretar la reacción según el esquema siguiente:

- No-coagulación
- Coagulación incompleta
- + Coagulación completa
- calculo de la concentración de la preparación que se va a dosificar, según la fórmula:
- Concentración en UI/ml=VE/VD x concentración teórica
- VE= volumen de heparina del tubo de la serie patrón
- VD= volumen de heparina del tubo de la serie de dosificación
7. CUESTIONARIO.-
1.- Cuál es la función del CaCl2 en la reacción?

2.- Por que los tubos se colocan en B.M.?
3.- Cuál es el campo de aplicación de esta práctica?
4.- Cuál la función del NaCl?
5.- Cuál es la diferencia entre el método de la coagulación y el cromógeno?

Práctica No. 3
TROMBOPLASTINA
La Tromboplastina es una proteína que se forma en el plasma por la combinación del factor
tisular con los fosfolípidos de las membranas de las plaquetas y que participa en la coagulación
de la sangre por medio de la conversión de protrombina en trombina.
La tromboplastina es una combinación de fosfolípidos y factor tisular, ambos componentes

necesarios para la activación de la vía extrínseca de coagulación.
El reactivo tromboplastina completo está compuesto por factor tisular, fosfolípidos (que cumplen
la función de las plaquetas en el ensayo in vitro), y cloruro de calcio para reintroducir los iones
calcio necesarios para la coagulación que fueron acomplejados por el citrato de sodio y utilizado
como anticoagulante durante la recolección de la muestra.
2. COMPETENCIAS.-
• Determina el tiempo de coagulación sanguínea utilizando la tromboplastina, mezcla de

plasmas, y un exceso de tromboplastina cálcica obtenida del cerebro de conejo,
incubados a 37ºC.
1 Tubos para hemólisis 30 Pieza
2 Pipeta 5ml 5 Pieza
los cuales se
3 Pipeta 0,1; 0,2; 0,5ml 5 c/u Pieza
repartirán los
4 Gradilla 5 Pieza
materiales de forma
equitativa
6 Cronómetro 5 Pieza
INSUMOS
1 Plasma 75 ml
2 Cloruro de calcio (20g/L) 15 ml Las cantidades de los
3 Cloruro de sodio (9g/L) 35 ml
4 Sustancia patrón de Heparina 40 ml forma equitativa
5 Hielo 300 g
Se obtiene del Mercado muestras de cerebros (principalmente de conejo), luego se sacan las
arterias, se lava bien y se conserva un día en refrigeración. NOTA: esta parte del procedimiento
se realiza en casa.
En el laboratorio, se procede a moler la muestra con ayuda de un mortero junto con acetona,
desechar el sobrenadante, moler nuevamente con acetona y repetir el procedimiento 3 veces,
luego meter a la estufa el tiempo necesario para que la acetona se evapore. Como resultado
se tiene la muestra reducida a polvo, el que después será introducido en un tubo con solución
fisiológica y finalmente se coloca en Baño María unos minutos (TROMBOPLASTINA)
Se prepara 3,8g de citrato de sodio en 100ml (0,3ml en el tubo de hemólisis) más 2,7ml de
muestra de sangre y se centrifuga por 3 minutos.
Debido a la siguiente proporción:
1ml citrato = 9 ml de sangre
3𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑎𝑛𝑔𝑟𝑒 𝑥 1𝑚𝑙 𝑐𝑖𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜

= 0,33ml citrato
9𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑎𝑛𝑔𝑟𝑒
0,3𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑐𝑖𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜 𝑥 9𝑚𝑙 𝑐𝑖𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜

= 2,7ml sangre
1𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑐𝑖𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜
100 minutos.
Si en dos conejos, hay una elevación térmica de 0,6 °C o más sobre su temperatura normal,
el ensayo es positivo; presencia de sustancias piretógenas.
Si hay una elevación térmica de 0,6 °C o más en un solo conejo o si la suma de las
elevaciones térmicas de los tres conejos es igual a 1,4 °C, el ensayo es considerado como
dudoso, en éste caso repetir el ensayo, pero con un lote de cinco conejos.
Si en dos conejos de éste nuevo ensayo, hay elevación térmica de 0,6 °C, se considera positivo;
presencia de sustancias piretógenas.
1.- Explique de qué manera afecta las variaciones de temperatura en la interpretación de

resultados.
2.- Explique a que se llaman pirógenos.
3.- Que tipo de termómetros se utilizan en la práctica?
4.- Cuidados que se deben de tener al realizar la práctica?
5.- Que criterio utiliza para inyectar un volumen a su conejo?
7. CUESTIONARIO.-
• ¿Cuáles son los factores de coagulación?

• ¿En qué tejido existe mayor cantidad de Tromboplastina?
• ¿Cuál es el anticoagulante utilizado?

Práctica No. 4
ENSAYOS BIOLÓGICOS DE SEGURIDAD: Control de esterilidad
Son ensayos aplicables a soluciones acuosas, polvos solubles, aceites y soluciones oleosas,
productos líquidos no inyectables, pomadas y cremas no hidrosolubles, apósitos quirúrgicos y
catguts e hilos quirúrgicos; que según la Farmacopea, deben ser estériles, pero un
resultado favorable solamente significa que no ha sido encontrado ningún microorganismo
en la muestra examinada en las condiciones del ensayo. La extensión de éste resultado
a un lote de productos necesita la certeza de que todas las unidades que lo componen han
sido preparadas de tal manera que hay un alto grado de probabilidad de que hubieran
satisfecho el ensayo.
2. COMPETENCIAS.-
Demuestra que los productos mencionados (vide supra) cumplen con las normas de:
- Farmacopea Europea DGA
- DSP
- SAL
A través de la resolución de problemas
1 Matraz Erlenmeyer 250ml 5 Pieza
los cuales se
3 Mechero bunsen 5 Pieza
repartirán los
4 Estufa de cultivo 1 Equipo
materiales de forma
5 Flujo laminar 1 Equipo
equitativa
6 Embudo Buchner 5 Pieza
7 pHmetro 1 Equipo
8 Pinzas 5 Pieza
INSUMOS
1 Medio Tioglicolato 30-50ºC 75 ml Las cantidades de los
2 Medio hidrolizado de caseína 20-25ºC 15 ml forma equitativa
Control de Calidad de Medios de Cultivo
Sembrar, con aproximadamente 100 microorganismos viables, siete tubos con los medios
escogidos respectivamente (aerobios, anaerobios y hongos) e incubar durante 7 días como
máximo a una temperatura comprendida entre 30 a 35 ºC, con la finalidad de evidenciar
bacterias y a una temperatura de 20 a 25 ºC para poder evidenciar contaminación por
hongos. El medio es adecuado si permite un crecimiento rápido y abundante de los
microorganismos que correspondan. Se aconseja el empleo de los siguientes
microorganismos, para éste ensayo:
Staphylococcus aureus ATCC 6538 P

Bacillus subtilis ATCC 6633
Clostridium sporogenes ATCC 19404
Cándida albicans ATCC 2091
Procedimiento.
Se recomienda leer detenidamente las Pág.. 872 – 875 del libro. Se abre el envase cerrado
con las precauciones de asepsia en una caja seca o una campana de flujo laminar de aire
estéril. Por cada medio de cultivo se efectúan tres tomas en diferentes lugares del envase. En
el caso de algodón hidrófilo o de cualquier material no tejido, cada porción debe ser
aproximadamente de 1 g. En el caso de productos tejidos, cada porción debe ser de
aproximadamente 10 centímetros cuadrados. Si son compresas de gasa cortadas, estén
o no empaquetadas individualmente, se toman tres compresas enteras de distintos lugares
del envase, para cada uno de los medios de cultivo.
Se utilizan en cada caso una cantidad de medio de cultivo suficiente para sumergir
completamente el material de ensayo ( 20 a 150 ml ).
Si es necesario repetir el ensayo, una segunda o tercera vez, se reparte el proceso

utilizando el mismo número de porciones que en el primer ensayo, pero partiendo cada
vez de un envase distinto y abierto en el momento del ensayo.
Inoculación de Medios de Cultivo.

Se introduce cada toma en un recipiente diferente que contenga el medio elegido,
utilizando tres porciones para cada tipo de medio.
200 minutos.
Observar y tomar nota de práctica.

7. CUESTIONARIO.-
1.- Explique a que se llama actividad antimicrobiana.

2.- Mencione las características que debe reunir el medio de cultivo empleado en la
practica.
3.- Si las lecturas de dos pruebas son diferentes cual es el siguiente paso a seguir?
4.- Mencione dos formas farmacéuticas sujetos a esta prueba?
5.- Que significa la sigla DGA?

Práctica No. 5
SEMINARIO: DETERMINACIÓN DE LA TOXICIDAD DEL DICLOFENACO EN LARVAS DE

ARTEMIA SALINA
Los estudios de toxicidad constituyen hoy día una parte muy importante dentro del desarrollo
de un nuevo fármaco y se extienden prácticamente a lo largo de todo el mismo. El objetivo de
los mismos es evaluar el riesgo o peligro potencial que un agente químico o físico puede
ocasionar sobre la salud humana cuando es objeto de exposiciones agudas o crónicas".
Y no se limitan sólo a los fármacos sino que la mayor parte de las sustancias químicas
industriales (pesticidas, agroquímicos, cosméticos, plásticos, etc.) son objeto de estudios de
toxicidad iguales o más complejos que los realizados con los nuevos fármacos. El presente
trabajo se llevó a cabo para determinar experimentalmente la dosis letal media en algunos
microorganismos mediante un bioensayo de toxicidad.
La industria farmacológica somete todos sus compuestos químicos apruebas para detectar
toxicidad; la mayoría de estas pruebas involucran protocolos que trabajan sobre líneas
celulares específicas humanas células de animales o bien en animales de laboratorio con cepas
específicas de ratones, ratas, conejos, chimpancés; este tipo de bioensayos son muy costosos
en términos de tiempo, dinero, infraestructura sofisticada, sin mencionar las habilidades de
manejo de las técnicas.
Artemia salina sólo había sido utilizada en varios bioensayos, entre las aplicaciones están:
o análisis de pesticidas
o micotoxinas
o contaminantes de corriente
o anestésicos
o toxinas de dinoflagelados
o compuestos parecidos a morfina
o toxicidad de aceites dispersantes
o carcinogenicidad de esteres de forbol
o toxinas en medios ambientes marinos.
Estudios de toxicidad
Los estudios de toxicidad constituyen hoy día una parte muy importante dentro del desarrollo
de un nuevo fármaco y se extienden prácticamente a lo largo de todo el mismo. El objetivo de
los mismos es "evaluar el riesgo o peligro potencial que un agente químico o físico puede
ocasionar sobre la salud humana cuando es objeto de exposiciones agudas o crónicas".
Podría definirse la toxicidad como "el estudio cualitativo y cuantitativo de los efectos deletéreos
ocasionados por agentes químicos o físicos sobre la estructura y función de los sistemas vivos
y la aplicación de estos estudios para la evaluación de la seguridad y la prevención de daños

al hombre y a las formas de vida útiles" (Hayes, 1975) El término cualitativo se refiere al tipo
de órgano diana afectado, en comparación con otras sustancias conocidas, mientras que el
término cuantitativo se refiere a la relación dosis-respuesta.
Ya en el siglo XVI, Paracelso afirmaba que "todas las sustancias son tóxicas y ninguna
sustancia es tóxica. Sólo la dosis determina la toxicidad". Cuando se representa gráficamente,
la curva dosis respuesta para un efecto en particular (efecto hepatotóxico, nefrotóxico,
mutagénico, embriotróxico, etc.) presenta una forma sigmoidal, siendo de particular interés
examinar :
• La forma de la curva dosis respuesta
• Las respuestas a dosis bajas del agente
• La naturaleza de las respuestas a dosis altas
• La pendiente de la parte recta de la curva (acentuada = alta toxicidad; reducida = baja
toxicidad)
Bioensayo
Prueba que involucra organismos vivos, en la cual, alguna propiedad de una sustancia es
medida en términos de la respuesta biológica que produce.
En los bioensayos se utiliza los registros de dato mediante una curva dosis respuesta cuantal,
• ayuda a determinar la potencia de cualquier sustancia fisiológicamente activa o de

actividad desconocida
• permite evaluar el grado de toxicidad de una sustancia química y compararla con
diferentes compuestos
• a su vez se pueden conocer la sensibilidad que presentan en diferentes especies hacia
un compuesto especifico
• tiene por finalidad determinar las concentraciones de un toxico dado que ocasionen
efectos dañinos o nocivos en un organismo modelo.
Artemia salina
La Artemia salina es un pequeño organismo que vive en las aguas salobres e hipersalinas de
todo el mundo. Es la presa viva más adecuada para la alimentación de los estadios post-
larvarios de muchas especies de peces y crustáceos marinos. Y en su fase adulta resulta un
aporte interesante para multitud de invertebrados y peces que pueblan nuestro acuario. Este
pequeño ser es un crustáceo de la subclase de los anostraceos y conforma el plancton de las
aguas continentales salobres.
• Pequeño tamaño (adultos 8-13 Mm. de longitud).
• Elevado contenido en proteínas (nauplios 50-60%; adultos 40-50%).
• Gran eficiencia en la conversión del alimento.
• Reproducción por medio de quistes durables que toleran la desecación y pueden ser
activados en cualquier momento bajo condiciones adecuadas
Reproducción
-Ovípara (quistes)
-Ovovivípara (nauplios)
Los machos tienen un par de antenas modificadas para sujetar a la hembra, así como un par
de penes en la parte posterior del tórax.
Las hembras poseen un saco ovígero o útero que está situado inmediatamente detrás del
undécimo par de toracópodos.
El primer estado larvario (también llamado estado I) mide entre 400 y 500 micras de longitud,
tiene un color pardo anaranjado (por acumulación de reservas vitelinas) y posee tres pares de
apéndices: el primer par de antenas (también llamadas anténulas y que tienen una función
sensorial) el segundo par de antenas (con función locomotora y filtradora) y las mandíbulas
(con una función de toma de alimento). Un único ocelo de color rojo tambien llamado ojo
nauplial se encuentra situado en la cabeza entre el primer par de antenas. La cara ventral del
animal se encuentra cubierta por un amplio labro que interviene en la toma de alimento
(transfiriendo las partículas desde las setas filtradoras hasta la boca). El estado larvario I no se
alimenta ya que su aparato digestivo no es todavía funcional (permaneciendo aún cerrados la
boca y el ano).
Tras aproximadamente 24 horas, el animal muda al segundo estado larvario (también llamado
estado II). Pequeñas partículas alimenticias (tales como células de microalgas, bacterias,
detritus) con un tamaño que varía entre 1 y 40 micras son filtradas por el segundo par de
antenas, siendo entonces ingeridas por un aparato digestivo ya funcional.
Los huevos
Lo primero que debemos hacer es elegir y comprar los huevecillos. Normalmente los venden
decapsulados, en varias marcas. Si no se encuentran decapsulados, que suele ser raro, se
deben tratar con una solución de lejía diluida, con lo que se disuelve la cascara. Es mejor
decapsulados porque esto nos asegura un mayor porcentaje de eclosiones, menos cascaras
vacías y menor tiempo de incubación.
Incubación
Para incubarlos se pueden seguir varios métodos muy fáciles. Por ejemplo, se comercializa un
aparato que se coloca dentro del acuario con un macarrón que insufla aire, y totalmente
estanco.
También se puede seguir la forma más clásica, dentro de una botella fuertemente aireada con
un difusor.
O por ultimo dentro de un acuario destinado para este fin donde se les puede también dejar
para su desarrollo hasta la etapa adulta.
Se realice de una u otra forma las características para la incubación son las siguientes:
o T = 26 a 28 grados.
o Salinidad = 32'5 gr/l. o 1.022
o Tiempo de 24 a 48 horas.
o Oxigenación casi a saturación
Desarrollo
Si se desea mantenerlos para que se transformen en adultos es necesario trasladar a los

nauplios a un acuario a tal efecto. Se puede utilizar un acuario de 5 o 10 litros, en el que se
mantendrá una aireación constante, pero no exagerada (puede albergar hasta 5000 nauplios
por litro).
La iluminación no es importante pero si necesaria si las vamos a alimentar con algas (entonces
es conveniente poner un tubo durante 12 horas diarias). Las artemias soportan temperaturas
de 20 a 30 grados, una de 26 será conveniente, la salinidad la antes indicada.
Durante los primeros días el crecimiento de los nauplios es lento. El alimento distribuido debe
repartirse en pequeñas cantidades pero a menudo. Los primeros cruces tienen lugar de 15 días
a 3 semanas después de la eclosión. Las parejas se pueden identificar fácilmente; el macho
está constantemente pegado a la parte anterior del cuerpo de la hembra. Las Artemias adultas
bien alimentadas son muy fecundas y con solo algunos miligramos de huevos es suficiente
para comenzar una cría que podremos mantener, si la cuidamos, durante varios meses.
La estructura externa de los huevos varía según las estaciones de puesta. En óptimas
condiciones de salinidad, las cascaras vacías muy finas desaparecen rápidamente disgregadas
por las colonias de bacterias. Si la salinidad es fuerte (1.028 y mas) las cascaras más gruesas
permanecen en la superficie, creando una proliferación de bacterias patógenas, nada buenas
para el conjunto de cría.
Alimentación
Para alimentar a las artemias se puede hacer de varias formas. La más sencilla es comprar el
alimento comercial que se vende a este efecto, suele ser un extracto en suspensión de
fitoplancton y levadura. Si se utiliza este, es conveniente remover el agua de vez en cuando

para que no se quede en el fondo y lo coman las artemias.
Una forma barata de alimentar a las artemias es preparar nuestro propio extracto casero. Esta
suspensión alimenticia es una disolución de levadura natural en agua salina.
También se puede cultivar fitoplancton compuesto por algas flageladas microscópicas. Se

cultiva dentro de botellas de plástico tapadas simplemente con algodón, sin aireación. Se llenan
de agua de mar (unos 250-300 ml.) en las que se mezclan una o dos gotas de abono líquido
que puede ser el destinado a las plantas de casa (que no contenga insecticidas). Las botellas
deben iluminarse de 12 a 15 horas diarias, evitando los rayos de sol. Al día siguiente el medio
está disponible para meter el alga (Dunaliella, recomendada), sobre 5 ml. por botella. Estas
algas no son visibles más que por el microscopio, pero después de algunos días la abundancia
es tal que colorea el agua. Se distribuyen a las artemias varias veces al día y se intenta rotar
las botellas de donde se sacan para no acabar con el cultivo.
Chi cuadrado
Esta prueba puede utilizarse incluso con datos medibles en una escala nominal. La hipótesis
nula de la prueba Chi-cuadrado postula una distribución de probabilidad totalmente
especificada como el modelo matemático de la población que ha generado la muestra.
Para realizar este contraste se disponen los datos en una tabla de frecuencias. Para cada valor
o intervalo de valores se indica la frecuencia absoluta observada o empírica (Oi). A
continuación, y suponiendo que la hipótesis nula es cierta, se calculan para cada valor o
intervalo de valores la frecuencia absoluta que cabría esperar o frecuencia esperada (Ei=n·pi ,
donde n es el tamaño de la muestra y pi la probabilidad del i-ésimo valor o intervalo de valores
según la hipótesis nula). El estadístico de prueba se basa en las diferencias entre la Oi y Ei y
se define como:
Este estadístico tiene una distribución Chi-cuadrado con k-1 grados de libertad si n es
suficientemente grande, es decir, si todas las frecuencias esperadas son mayores que 5. En la
práctica se tolera un máximo del 20% de frecuencias inferiores a 5.
Si existe concordancia perfecta entre las frecuencias observadas y las esperadas el estadístico
tomará un valor igual a 0; por el contrario, si existe una gran discrepancia entre estas
frecuencias el estadístico tomará un valor grande y, en consecuencia, se rechazará la hipótesis
nula. Así pues, la región crítica estará situada en el extremo superior de la distribución Chi-
cuadrado con k-1 grados de libertad.
2. COMPETENCIAS.-
El estudiante será capaz de determinar la toxicidad y letalidad del diclofenaco mediante los
huevos de artemia salina.
NO APLICA
Eclosión de los huevos de artemia salina
Para poder llevar a cabo el experimento se debe eclosionar

primero los huevos y se hará de la siguiente forma:
1. Conseguir los huevos de artemia que son como una
especie de arena, estos se puede conseguir en los
acuarios.
2. Armar el sistema para poner a los huevos, con las
botellas de plástico, cortar una por la parte superior y la
otra por la parte inferior esta conservara la tapa de la
botella, la que fue cortada por la parte inferior
invertirla y ponerla sobre la que fue cortada por la parte
superior, esta que fue cortada por la parte superior
será como la base.
3. Ya armado el sistema se pone la manguera conectada a la
bomba de aire o a algún motor con el propósito de
generar movimiento ya que las artemias eclosionan
cuando hay movimiento.
4. Introducir 1 litro de agua de pila, una cuchara de sal y 1 cuchara de bicarbonato ya que esto
favorecerá al crecimiento de las artemias y poner una cantidad aproximada de 2 cucharadas
de los huevos de artemia dependiendo de la cantidad que se quiere eclosionar.
5. Controlar la temperatura que este entre los 24° a los 28 o máximo 30°, y prender la bomba
de aire.
6. Una vez ya eclosionados llevar las artemias eclosionadas a una cubeta grande y cuadrada.
7. Para trasladarlos se debe poner luz a la parte de la tapa de la botella ya que las artemias
tienden a ir a la luz, y abrir la tapa y dejarlos caer en la cubeta, y los que quedaron en la
superficie desecharlos ya que son los que no eclosionaron.
Realización del bioensayo

1. Rotular cada tubo y agregar en forma ascendente la concentración del diclofenaco
partiendo de 0 ml.
2. Agregar de forma descendente el volumen de agua partiendo de 2 ml.
3. A cada tubo se colocan artemias no pasan de 10 artemias por tubo ni disminuyen de 8
artemias por tubo.
4. Se observara el movimiento de las artemias por un periodo de 120 min.
5. Al término del periodo se observara cuantas murieron y cuantas no.
6. En relación a estos datos se saca las probabilidades de las que murieron y de las que no
murieron y se realiza la tabla correspondiente y el método de shi cuadrado.
300 minutos.
No Vol. Vol. Total Art. Probabilidad Art. Probabilidad

de (H2O) (diclofenaco) Art.salinas Salinas Muertas Salinas Vivas
tubos (n) muertas(r) (r/n) vivas (v/n)
(v)
1 2 0 10 0 0 10 1
2 1,8 1,2 10 1 0,1 9 0,9
3 1,6 0,4 8 5 0,62 3 0,37
4 1,4 0,6 10 5 0,50 5 0,5
5 1,2 0,8 10 5 0,50 5 0,5
6 1 1 8 7 0,87 1 0,1
7 ,8 1,2 10 7 0,70 3 0,3
8 0,6 1,4 8 8 1 0 0
9 0,4 1,6 9 9 1 0 0
10 0,2 1,8 8 8 1 0 0
11 0 2 9 9 1 0 0
Concentra 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 total
ción
Muertos 0 0,1 0,63 0,50 0,50 0,88 0,70 1,0 1,0 1,0 1,0 7
0,63 0,06 0,40 0,31 0,31 0,55 0,44 0,63 0,63 0,63 0,63
Vivos 1,0 0,9 0,3 0,5 0,5 0,1 0,3 0 0 0 0 4

0,63 0,40 0,10 0,18 0,18 0,03 0,10 0 0 0 0
Total 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11
GUIAS DE PRÁCTICA CIENCIAS DE LA SALUD - QUIMICA
Código de registro: RE-10-LAB-047-001 Versión 1.0
𝒙𝟐 = 𝟎, 𝟔𝟑𝟔
𝒙𝟐 = 𝟎, 𝟓𝟖𝟕
𝒙𝟐 = 𝟎, 𝟏𝟑𝟐
𝒙𝟐 = 𝟎, 𝟏𝟎𝟒
𝒙𝟐 = 𝟎, 𝟏𝟎𝟒
𝒙𝟐 = 𝟎, 𝟏𝟖𝟒
𝒙𝟐 = 𝟎, 𝟏𝟒𝟔
𝒙𝟐 = 𝟎, 𝟐𝟎𝟖
𝒙𝟐 = 𝟎, 𝟐𝟎𝟖
𝒙𝟐 = 𝟎, 𝟐𝟎𝟖
𝒙𝟐 = 𝟎, 𝟐𝟎𝟖
𝒙𝟐 = 𝟎, 𝟐𝟎𝟖
𝒙𝟐 = 𝟎, 𝟔𝟎𝟖
𝒙𝟐 = 𝟎, 𝟑𝟑𝟒
𝒙𝟐 = 𝟎, 𝟔𝟗𝟒
𝒙𝟐 = 𝟎, 𝟔𝟗𝟒
𝒙𝟐 = 𝟎, 𝟏𝟏𝟑
𝒙𝟐 = 𝟎, 𝟑𝟑𝟒
𝒙𝟐 = 𝟎
𝒙𝟐 = 𝟎
𝒙𝟐 = 𝟎
𝒙𝟐 = 𝟎
Σn=5,781
En la tabla:
Columnas: 2-1 = 1
Filas; 11-1 = 10
18,3017
7. CUESTIONARIO.-
1. ¿Por qué es necesario determinar la toxicidad de Artemia salina?

2. ¿Qué métodos estadísticos pueden utilizarse para determinar la suma total
media?
3. ¿Qué es el Probit y qué relación tiene con la Curva de Gauss?

Práctica No. 6
SEMINARIO: UTILIZACIÓN DE LA PRUEBA DE ELISA COMO UN

ENSAYO BIOLÓGICO PARA FÁRMACOS (HAPTENOS)
El Test ELISA es un ensayo inmunoenzimático en fase sólida para la detección

cualitativa de anticuerpos. Se realiza en placas cuyos pocillos han sido
activados con extractos totales de las cepas, incluyendo antígenos de
membrana altamente inmunogénicos. El recubrimiento de los pocillos se
realiza mediante una novedosa tecnología consistente en la utilización de un
adhesivo biológico que facilita la inmovilización de los antígenos y aumenta la
estabilidad de la placa activada. Si las muestras analizadas contienen
anticuerpos, éstos formarán un complejo estable con los antígenos que
recubren los pocillos. El material unido en forma inespecífica será eliminado
por medio del lavado. Durante la incubación con el conjugado, los anticuerpos
anti-IgG humanas marcados con peroxidasa se unirán al complejo formado.
Finalmente, en la etapa de incubación con el sustrato cromogénico, la
peroxidasa unida al complejo producirá una coloración que permitirá detectar
las muestras reactivas. La reacción enzimática se detendrá por la adición de
ácido sulfúrico, midiéndose luego la intensidad del color en un lector
colorimétrico para placas de ELISA.
2. COMPETENCIAS.-
El estudiante será capaz de realizar la prueba de ELISA y dar su correcta

interpretación.
1 Placa de Elisa 1 Pieza Se formarán 5 grupos,
2 Pipeta 5, 10ml 5 c/u Pieza los cuales se repartirán
3 Micropipeta 20-200 5 Pieza los materiales de forma
4 Piseta 5 Pieza equitativa
INSUMOS
1 Kit de ELISA (disponibles ) 1 Kit Las cantidades de los
forma equitativa
1. Colocar los reactivos a temperatura ambiente

2. Diluir la solución de lavado 25x con agua destilada o desionizada. Si se va
a utilizar una tira de 8 pocillos, preparar 50ml de solución de lavado
tomando 2ml de la solución 25x y agregando 48ml de agua. La solución
diluida es estable por dos semanas a 4ºC.
3. Poner en el soporte los pocillos correspondientes al número de muestras
a analizar. Incluya dos pocillos para el control positivo y dos para el control
negativo.
4. Agregar a cada pocillo 200µL de diluyente de muestra.
5. Agregar 20µL de cada muestra o control. Al agregar las muestras, el
diluyente de muestra virará de color de acuerdo a la siguiente tabla:
Tipo de Sin Suero o Control Control

muestra muestra plasma positivo negativo
Color Violeta Azul Turquesa Verde
ADVERTENCIA: Las muestras hemolizadas o turbias alterarán el color

final sin afectar el resultado. El cambio de color es proporcional al volumen
de muestra agregado. Un viraje de menor intensidad, indicará que se
dispensó un volumen inferior o que la muestra no se encuentra en
condiciones adecuadas.
6. Sellar la placa con el autoadhesivo provisto, para impedir la evaporación

de los reactivos, e incubar por 30 minutos a 37ºC±1ºC
7. Sacar el adhesivo y lavar la placa. Para esto, eliminar el contenido y
agregar a cada pocillo 350µL de solución de lavado diluida. Eliminar la
solución y repetir esta operación 4 veces más.
Protocolo recomendado para lavador automático de tiras:
Realizar 5 ciclos de lavado dispensando 350µL de la solución de lavado

diluida.
Asegurarse cuando sea posible que:
o El pocillo se llene con la solución de lavado
o La solución de lavado no rebalse en ningún momento
o El tiempo de remojo sea de 30 segundos
o No quede líquido remanente en los pocillos al final del lavado.

Para esto se recomienda, si es posible, realizar un aspirado
cruzado en el último paso
NOTA: siempre mantener limpio el equipo enjuagando con abundante

agua destilada al final de cada jornada de trabajo. Realizar mantenimiento
periódico de acuerdo a las instrucciones de su proveedor.
8. Después de lavar, invertir la placa y golpearla suavemente sobre papel

absorbente para eliminar cualquier exceso de líquido en los pocillos. Si la
base de los pocillos se moja, limpiar con papel absorbente para evitar la
formación de precipitados que podrían interferir con la lectura.
ADVERTENCIA: No permitir que la placa se seque.
9. Tomar sólo el volumen de conjugado que va a utilizar y depositarlo en un

recipiente limpio. Agregar 100µL de conjugado a cada pocillo.
ADVERTENCIA: No pipetear el conjugado directamente del frasco original.

No devolver el conjugado sobrenadante al frasco original.
10. Tomar sólo el volumen de conjugado que va a utilizar y depositarlo en un

recipiente limpio. Agregar 100µL de conjugado a cada pocillo.
11. Lavar de manera similar a lo descrito en los puntos 7 y 8.
12. Agregar 100µL de sustrato a cada pocillo e incubar la placa en oscuridad
durante 30 minutos a temperatura ambiente.
13. Detener la reacción agregando 100µL de Solución de detención a cada
pocillo.
300 minutos.
LECTURA E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Leer la placa a la inmediatamente después de transcurrido el tiempo

establecido.
ADVERTENCIA: las lecturas posteriores a los 60 minutos no son confiables.

a) Lectura: Leer los resultados en un lector para microplacas utilizando un
filtro de 450nm, se puede utilizar un filtro de referencia de 620-630nm si el
equipo lo permite.
NOTA: el uso del filtro de referencia permite eliminar las variaciones

producto de interferencias en el trayecto del haz de luz del lector.
b) Cálculo del punto de corte: luego de la lectura se deberá calcular el valor

de “cut off” a partir de los valores de absorbancia de los pocillos
correspondientes a los controles positivos y negativos.
El “cut off” se determina utilizando la siguiente ecuación:
“cut off” = (promedio controles positivos + promedio controles negativos) x 0,35
c) Determinación de resultados: Una muestra será positiva cuando su

absorbancia sea mayor que el “cut off”. Un suero será negativo cuando su
absorbancia sea menor que el “cut off”. Las muestras cuya absorbancia se
encuentre en un rango de “cut off” ± 10%, deben considerarse dudosas y
deberán ser analizadas nuevamente en duplicado. Si al menos uno de los
replicados mantiene una lectura en esta zona, considere la muestra como
positiva.
En casos excepcionales en los que no se cuente con un lector

colorimétrico, se puede realizar una lectura visual. Los pocillos positivos
serán de color amarillo y podrán diferenciarse de los pocillos negativos, los
que serán incoloros o presentarán una leve coloración amarilla. Este tipo
de lectura no permite verificar los criterios de validación, por lo que se
recomienda sólo en situaciones excepcionales.
VALIDACIÓN DE LOS RESULTADOS:
Para que la prueba sea considerada válida deben cumplirse los siguientes
requisitos:
- La densidad óptica de cada control negativo debe ser menor o igual a

0,2. Si la densidad óptica de uno de los controles negativos es mayor, y
la lectura del otro control está en los rangos habituales, y se cumplen los
criterios de validación, descarte ese valor.
- La diferencia entre los controles positivos dividida por el promedio de
ellos, debe ser menor o igual a 0,21 (equivalente a un coeficiente de
variabilidad de 15%).
- El promedio de los controles positivos dividido por el promedio de los
controles negativos debe ser mayor o igual a 5. Este límite evita la pérdida
de sensibilidad en los casos que los valores del control positivo sean
bajos.
7. CUESTIONARIO.-
1. ¿Por qué se utilizan las enzimas peroxidasas o fosfatasas?

2. ¿Cuántas veces debe lavarse el complejo Antígeno-Anticuerpo y por qué?
3. Explique el fenómeno de Adsorción

RE-10-LAB-047 ENSAYOS BIOLOGICOS DE MEDICAMENTOS v3

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GUIAS DE PRÁCTICA CIENCIAS DE LA SALUD QUIMICA

Código de registro: RE-10-LAB-047 Versión 3.0

UNIVERSIDAD DEL VALLE

VALORACIÓN MICROBIOLÓGICA DE ANTIBIÓTICOS

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La valoración de antibióticos en la Industria Farmacéutica constituye una especialidad que

El agar Müller-Hinton es un medio de cultivo microbiológico utilizado comúnmente para realizar

También puede añadirse un 5% de sangre de oveja y NAD cuando se realiza la prueba de

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1. CONOCIMIENTO TEORICO REQUERIDO.-

La heparina es un glicosaminoglicano muy sulfatado, se utiliza

Valora la actividad anticoagulante de las formas farmacéuticas elaborados con heparina y lo

3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.-

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6. MEDICIÓN, CALCULOS Y GRAFICOS.-

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1.- Cuál es la función del CaCl2 en la reacción?

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1. CONOCIMIENTO TEORICO REQUERIDO.-

La tromboplastina es una combinación de fosfolípidos y factor tisular, ambos componentes

• Determina el tiempo de coagulación sanguínea utilizando la tromboplastina, mezcla de

3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.-

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1ml citrato = 9 ml de sangre

3𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑎𝑛𝑔𝑟𝑒 𝑥 1𝑚𝑙 𝑐𝑖𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜

0,3𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑐𝑖𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜 𝑥 9𝑚𝑙 𝑐𝑖𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜

5. TIEMPO DE DURACION DE LA PRÁCTICA.-

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1.- Explique de qué manera afecta las variaciones de temperatura en la interpretación de

• ¿Cuáles son los factores de coagulación?

UNIVERSIDAD DEL VALLE

1. CONOCIMIENTO TEORICO REQUERIDO.-

3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.-

Staphylococcus aureus ATCC 6538 P

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Inoculación de Medios de Cultivo.

5. TIEMPO DE DURACION DE LA PRÁCTICA.-

6. MEDICIÓN, CALCULOS Y GRAFICOS.-

Observar y tomar nota de práctica.

1.- Explique a que se llama actividad antimicrobiana.

UNIVERSIDAD DEL VALLE

SEMINARIO: DETERMINACIÓN DE LA TOXICIDAD DEL DICLOFENACO EN LARVAS DE

1. CONOCIMIENTO TEORICO REQUERIDO.-

y la aplicación de estos estudios para la evaluación de la seguridad y la prevención de daños

• ayuda a determinar la potencia de cualquier sustancia fisiológicamente activa o de

Si se desea mantenerlos para que se transformen en adultos es necesario trasladar a los

fitoplancton y levadura. Si se utiliza este, es conveniente remover el agua de vez en cuando

También se puede cultivar fitoplancton compuesto por algas flageladas microscópicas. Se

3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.-

Eclosión de los huevos de artemia salina

Para poder llevar a cabo el experimento se debe eclosionar

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