Traduccion-Bioquímica - Capitulo 2-9

FACULTAD DE
INGENIERIA
CARRERA DE:
INGENIERIA AMBIENTAL
Semana 5: Traducción del capítulo 2 y 9

Grupo 2
BIOQUÍMICA Y TOXICOLOGÍA
Elaborado por:
IRENE SALOME ROMERO TUCTO N00176363@upn.pe
JHON MIGUEL MELENDEZ MACHUCA N00181740@upn.pe
DOCENTE:
FERNANDO CAMILO JOAQUIN RODRIGUEZ
Cajamarca, junio de 2021

Ecotoxicología bioquímica
19
DOI: http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-411604-7.00002-7
Bioquímica
ECOTOXICOLOGÍA
Principios y métodos
20
2
Técnicas de preparación de tejidos y fraccionamiento subcelular
François Gagné
Esquema del capítulo
2.1Tipos de tampones de homogeneización 22

1. pH 22
2. Ion Queladores 24
3. Antioxidantes 24
4. Inhibidores de proteasas 24
5. Inhibidores de DNase/RNase 25
6. Osmolaridad 26
7. Agentes crioprotectores 26
2.2 Métodos de homogeneización 27
1. Mortero de tejido de teflón 27
2. Polítrón 28
3. Ultrasonidos 28
4. Congelación-Deshielo 29
5. Fraccionamiento Subcelular por Centrifugación Diferencial 29
6. Conservación de muestras biológicas para biomarcadores 31
Referencias 31
Los tejidos deben procesarse para permitir la detección del analito con una interferencia
mínima de una matriz biológica compleja. De hecho, dada la complejidad de los procesos
de vida, los tejidos deben ser manejados con cuidado para minimizar en la medida de lo
posible la degradación del analito o el punto final en estudio. La extensión de preparación
de tejidos dependerá de la especificidad del ensayo y de la especie. Los organelos
subcelulares son estructuras sensibles y se debe prestar especial cuidado para minimizar
la interrupción de los organelos durante la congelación, descongelación y
homogeneización. Los organelos se componen de membranas la mayor parte del tiempo y
se debe prestar especial atención a la osmolaridad (salinidad) de los medios de
comunicación para prevenir el choque o choque hiperosmótico. Durante la interrupción
celular o tisular, las proteasas y nucleasas son liberadas inadvertidamente, lo que podría
inactivar el biomarcador de interés. Las enzimas y el ARN son particularmente sensibles a
21
la actividad proteasa/ribonucleasa para que se brinde especial cuidado trabajando a bajas

temperaturas, trabajando a un pH ligeramente básico, y con la presencia de catalizadores
Ca/Mg. Todos estos aspectos se explicarán en este capítulo.
2.1 TIPOS DE BÚFERES DE HOMOGENEIZACIÓN

Los tampones de homogeneización están preparados para mantener la integridad del
analito y limitar su biodegradación mediante proteasas y núcleos endógenos.
La homogeneización de los tejidos para ensayos bioquímicos generalmente requiere la
interrupción de la estructura tisular y las células para liberar el material intracelular. El
proceso de homogeneización podría considerarse como un método de destrucción
"controlado" de las células. La elección entre el búfer de homogeneización (y el método) se
basa en un compromiso entre el rendimiento de recuperación de analitos y la integridad del
biomarcador. Por ejemplo, entre el paso de homogeneización para liberar una enzima
citosólica requiere el delicado de tantas células como sea posible en los tejidos, por un lado,
y por otro lado, una mayor dureza de los pasos de homogeneización en un medio de
amortiguación inadecuado podría favorecer la liberación y actividad de proteasas, RNase y
DNase, que podrían inactivar fácilmente el objetivo bioquímico en estudio. Un tipo de
Polítrón de homogeneización tisular es altamente eficiente en la interrupción de tejidos
duros o duros como músculos y tejidos conjuntivos, pero el proceso podría generar calor (y
ultrasonidos), que a su vez podrían inactivar la enzima o degradar químicamente los
analitos de interés. Deben tenerse en cuenta las siguientes propiedades de cualquier búfer
de homogeneización.
2.1.1 pH
El pH del medio de homogeneización se selecciona para mantener (1) el pH para la
estabilidad del analito, y (2) para limitar la actividad de proteasas, RNase y DNase. Por lo
general, se prefieren pH ligeramente básicos (7.58.2), ya que muchas de las enzimas de
degradación de proteínas y ácidos nucleicos son óptimas en pH 5.56.5 y generalmente
tienen un impacto limitado en la estabilidad del analito. Sin embargo, muchas enzimas
funcionan de manera óptima en pH,7.5 para que la concentración del buffer no debe ser lo
suficientemente alta como para derribar el pH durante el ensayo o el cuidado debe tomarse
no para inactivar irreversiblemente la enzima de interés. El búfer está seleccionado para
funcionar en el rango de pH y dentro de 61 de la pKa del búfer para garantizar un buen
control de pH. Se proporciona una tabla no exhaustiva para los búferes más utilizados en
bioquímica (Cuadro 2.1). La homogeneización
22
Table 2.1 Lista de tampones de uso común en la investigación bioquímica

Nombre común Nombre pKa Rango de pH
Tris Tris-(hidroximetil) 8.06 at 25C 7.069-06

cloruro de aminometano o Sensible a la temperatura;
sal de acetato ajustar el pH a la temperatura
de trabajo
HEPES Ácido 4-(2-hidroxietil)-1- 7.5 6.5-8.5
piperazinatanasulfónico
MOPS Ácido propanesulfónico 3-(N- 7.2 6.2-8.2

morfolino)
Glicina Ácido aminoacético pKa1 2.3 1.3-3.3
pKa2 9.5 8.5-10.5
bicarbonato NaHCO3 5.3-7.3
pKa1 6.35
(sodio) 9.3-11.3
H2CO3→HCO3-1
pKa2 10.35
HCO3-1→CO3-2
Fosfato de Nax3-xHxPO4 (x está pKa1 2.3 1.3—3.3
sodio/potasio entre 3 y 0) (H3PO4→H2PO4-1) 6.23-8.2
pKa2 7.2
(H2PO4-2→HPO4-1)
pKa3 12.1
(HPO4-2→PO4-3)
Acetato (sodio) CH3COOH/CH3COO- 4.75 3.75-5.75
Citrato (sodio) NaOOC-CH2-C pKa1 3.13 2.1-4.1
(-COONa,-OH)-CH2-COONa pKa2 4.76 3.8-5.8
pKa3 6.4 5.4-7.4
El tampón de pH a> 12 rara vez se requiere, especialmente para la homogeneización (nunca se requiere). En su lugar, se usa NaOH.
temperatura debe estar siempre por debajo de 4°C para limitar la actividad química general
de la muestra. Una de las mejores maneras de prevenir la degradación de la temperatura
se sugiere de la siguiente manera: los tejidos se congelan primero y la homogeneización
realizada (moliendas de tejido de mortero Polítrón o teflón) con el tejido congelado
directamente en el amortiguador de homogeneización helada. Este procedimiento es en
realidad una combinación de etapas de congelación-descongelación y homogeneización
mecánica del tejido. En general, un triturador de tejidos con mortero de teflón
(homogeneizador Potter-Elvehjem) ofrece el mejor compromiso entre el mantenimiento de
la integridad del componente intracelular (orgánulos) y el rendimiento de analitos. Cada
búfer tiene sus propias características y debe utilizarse caso por caso. Por ejemplo, Tris es
una sal que contribuye menos a la presión osmótica de los medios de comunicación, pero
el pH es sensible a los cambios de temperatura; Citrato es también un buen buffer y exhibe
propiedades que quelantes para elementos divalentes (Ca2+.).
23
El tampón de fosfato podría inhibir algunas actividades del citocromo P450 (P4503A4). Los
tampones son generalmente biológicamente compatibles cuando se utilizan a
concentraciones bajas a moderadas (1-50 mM).
2.1.2 Queladores de iones

Los quelantes de calcio, magnesio y zinc generalmente se agregan en la homogeneización
ya que muchas exonucleasas y endonucleasas (ARN y ADN) y proteasas necesitan estos
cationes para una actividad óptima. El ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) es, con
diferencia, el quelante más utilizado para cationes como calcio, magnesio y muchos otros
cationes como cobalto, zinc, cadmio, hierro (II) y níquel. El ácido etilenglicol tetraacético
(EGTA) es más específico para el calcio y menos específico para el magnesio. N,N,N´N´-
tetrakis(2-piridilmetil) etilendiamina (TPEN) es un buen quelante de zinc para
endopeptidasa dependiente del zinc (metaloproteinasa). También es un inductor de la
apoptosis en las células mediante la disminución de los niveles de zinc libre en las células.
Citrato se considera un quelante leve de calcio y hierro (II), pero el citrato es un metabolito
intermedio y podría interferir si se determina el metabolismo de la glucosa en el
experimento.
2.1.3 Antioxidantes
Algunas moléculas son sensibles al potencial de redox en las células durante la
homogeneización y la presencia de antioxidantes es necesaria en el búfer de la muestra.
Por ejemplo, las proteínas que contienen tiol podrían oxidarse fácilmente para formar
atenuadores e inactivar la enzima actividad si está presente. El análisis de compuestos
sensibles como los tioles (glutatión, proteínas ricas en cisteína, nitrito sódico, ácido
ascórbico y ácido retinoico) requiere que los tejidos se preparen en condiciones reductivas.
β-mercaptoetanol o ditiotreitol son los antioxidantes más utilizados en los tampones de
homogeneización y se utilizan a concentraciones entre 0,1 y 10 mM. Otros antioxidantes
como el ácido ascórbico, la cisteína y el glutatión también se pueden utilizar, Aunque se
debe tener cuidado de no interferir en los ensayos debido a sus orígenes biogénicos. Tris
(2-carboxetil) fosfina es un reductor muy fuerte con cierto potencial alquilante y se está
convirtiendo en un agente de reducción más común especialmente en el área de análisis
de electroforesis de gel de proteínas (proteómica).
2.1.4 Inhibidores de las proteasas
Los trabajadores de laboratorio deben ser siempre conscientes de la presencia de
proteasas en muestras biológicas. Por lo general, están activos en pH< 7 (condición
24
ligeramente ácida) y muchos de ellos requieren cationes (Ca 2+ o zinc) para trabajar. La
forma más fundamental de bloquear las proteasas es mantener los extractos de tejido a 0-
4°C en búferes de homogeneización ligeramente básicos (a pH 8-8.5) en presencia de
quelatadores (EDTA o EGTA). Sin embargo, EDTA no es capaz de inhibir la actividad de la
tripsina. El fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) es un inhibidor general de la proteasa
que inhibe proteasas serinas como tripsina y quimiotripsina. También inhibe proteasas de
cisteína y acetilcolinesterasa de mamíferos. Por lo general se utiliza a concentraciones
entre 0,1 y 1 mM en búferes de homogeneización. La aprotinina y la leupeptina también se
utilizan como inhibidores de la proteasa a base de proteínas para la tripsina y las proteasas
de serina/cisteína. Sin embargo, no podemos asumir su eficacia completa para todas las
especies y las precauciones siempre deben utilizarse con nuevas muestras biológicas,
especialmente cuando se trabaja con nuevas especies. Como guía general, trabajar a un
pH ligeramente básico a temperaturas frías y con una combinación de EDTA + otro inhibidor
(PMSF) generalmente da buenos resultados. Sin embargo, si se van a examinar los tejidos
del tracto de digestión, se debe considerar una matriz más completa de inhibidores de la
proteasa. Se ofrecen cócteles inhibidores de la proteasa comercial. En algún caso, las
proteasas podrían ser saciadas añadiendo una cantidad excesiva de proteínas como la
albúmina, por ejemplo, durante el aislamiento de las células de los organitos, siempre que
el exceso de proteínas no interfiera en los ensayos posteriores.
2.1.5 Inhibidores de DNase/RNase

Los criterios generales para las proteasas, como el pH ligeramente básico, las bajas
temperaturas y la presencia de un quelante de catión (EDTA) también se pueden aplicar a
las nucleasas en general. El dietilpirocarbonato (DEPC) es un conocido inhibidor de la
ribonucleasa o RNase. Se utiliza para tratar el agua a una concentración del 0,05-0,1%,
que se puede eliminar calentando a 80-90°C durante 15 minutos si es necesario. Si se va
a extraer ADN o ARN, la desnaturalización por calor a 75-80°C durante 10 minutos después
de la homogeneización en el amortiguador básico helado que contiene EDTA (por ejemplo,
tris-acetato de 10 mM, pH 8.2, con 1-10 mM EDTA) constituye un buen método para
inactivar RNase o DNase. Muchas fuentes comerciales de cócteles inhibidores de RNase
y DNase a base de proteínas recombinantes están disponibles actualmente (Qiagen, Life
Technologies, Invitrogen).
También están disponibles comercialmente inhibidores químicos de DNase como β-
mercaptoetanol (10-100 mM), EGTA y EDTA (10 mM), el dodecilsulfato sódico (0,5-1%) y
25
el yodoacetato (10 mM). La eficacia de cada uno de ellos dependerá de la naturaleza de

los tejidos y especies objeto de investigación.
2.1.6 Osmolaridad
La osmolaridad se define como el número de especies iónicas en la molaridad que tiene un
rango característico dependiendo de la especie examinada. Se calcula como la suma de
las especies iónicas molares en un medio de comunicación, por ejemplo, 150 mM NaCl
tiene una osmolaridad de 150 mM Na + + 150 mM Cl- = 300 mOsmol; 50 mM CaCl2 y 5 mM
NaHCO3 tienen una osmolaridad de 50 mM Ca 2++ 2 x 50 mM Cl- + 5 mM Na+ + 5 mM HCO3-
= 160 mOsmol. En vertebrados, los valores de osmolaridad plasmática oscilan entre 275 y
325 mOsmol. El mantenimiento de células, vesículas de membrana u orgánulos
intracelulares (microsomas, mitocondrias y núcleos) depende del equilibrio transmembrana
de la presión osmótica para prevenir el estrés hipo-osmótico o hiper-osmótico. Por ejemplo,
los medios de cultivo celular generalmente se ajustan a 290-320 mOsmol para prevenir
cualquier estrés osmótico en las células. Si se desconoce la osmolaridad, entonces un valor
podría determinarse midiendo la conductividad de las células o tejidos homogeneizados en
el agua si el plasma (o hemolinfa) no está disponible. En mejillones de agua dulce, la
hemolinfa tiene una osmolaridad de 70-100 mOsmol (35-50 mM NaCl). La osmolaridad de
los tampones de homogeneización o los medios de cultivo celular debe ser adecuada para
las especies investigadas, especialmente si se requiere el mantenimiento de vesículas de
membrana como núcleos, mitocondrias, lisosomas y microsomas. La osmolaridad se ajusta
generalmente con NaCl, KCl, Na/KH 2PO4 o sacarosa. Compuestos que no pasan las
membranas (Percoll o dextrans) o pasan fácilmente las membranas (dimetilsulfóxido;
DMSO) no se cree que contribuyan significativamente a la osmolaridad. Por ejemplo,
tampón basado en Tris y grandes proteínas (albúmina) contribuyo débilmente a la presión
osmótica.
2.1.7 Agentes crioprotectores

En algunos casos, una serie de complejos enzimáticos o receptores de membranas unidas
a proteínas son sensibles a las temperaturas de congelación ya que la cristalización ocurre
durante la congelación. Se requiere la adición de agentes crioprotectores que prevengan o
reduzcan la formación de cristales durante la congelación profunda. Podrían añadirse
directamente en el búfer de homogeneización o incluirse justo antes de congelarse a una
fracción de homogeneización determinada. DMSO y glicerol son los agentes
crioprotectores más utilizados. La concentración de DMSO suele ser ~10-30% y glicerol
26
entre 10 y 50%. También se podrían utilizar otros agentes crioprotectores como sacarosa,
glucosa, etilenglicol y propilenglicol.
2.2 MÉTODOS DE HOMOGENEIZACIÓN

En esta sección se propone una selección de métodos de homogeneización. La eficacia de
los métodos de homogeneización es un equilibrio entre el rendimiento y la integridad de la
muestra cómo se mencionó anteriormente. Por un lado, los métodos de homogeneización
leve son generalmente adecuados para estructuras delicadas (vesículas de membrana o
grandes macromoléculas de ADN), pero el rendimiento podría ser bajo. Por otro lado, los
métodos de homogeneización agresivos podrían aumentar significativamente el
rendimiento, pero a expensas de la integridad de la muestra. Por ejemplo, un
homogeneizador de polítrones podría procesar tejidos robustos, pero a expensas de
destruir orgánulos celulares (por ejemplo, mitocondrias o ADN genómico). En algunos
casos, una combinación de procedimientos de homogeneización podría utilizarse para
mejorar el rendimiento con una pérdida mínima de integridad biológica.
2.2.1 Mortero de tejido del teflón

La trituradora de tejidos con mortero de teflón (Potter-Elvehjem) es, con diferencia, el mejor
método para aislar los orgánulos celulares. El diámetro del mortero del teflón se ajusta
firmemente al tubo para que un espacio estrecho fuerza los tejidos a pasar a través de este
espacio durante las pasadas arriba y abajo (Figura 2.1). El mortero Potter también gira por
un motor (se utiliza un taladro penetrante en algún momento) a diferentes velocidades. Por
lo general, se requieren de 5 a 10 trazos o pasadas para homogeneizar una muestra.
Figure 2.1 Un triturador de tejidos con mortero de teflón.
27
Este método es conveniente para los tamaños relativamente pequeños de tejidos

(aproximadamente 10 mg-10 g). Se requieren tamaños más grandes para picar los tejidos
en trozos más pequeños y homogeneizarlos en secuencia. La homogeneización debe
realizarse a <4°C, es decir, en amortiguador de hielo, con tejidos ligeramente congelados,
y el tubo de mortero de teflón rodeado de hielo o colocado en una cámara de 4°C.
2.2.2 Polítrón
La amoladora de tejido Polítrón (Figura 2.2) representa una técnica de homogeneización
más fuerte y se utiliza para tejidos robustos como el cartílago y el músculo. Se considera
un proceso duro que puede conducir a daños subcelulares y macromoleculares
importantes. Las cuchillas giratorias, que están firmemente instaladas en un tubo metálico,
forman la base del proceso de molienda de tejidos. Este proceso, sin embargo, genera
calor y ultrasonidos por lo que se debe tener cuidado de mantener el tejido congelado
durante la homogeneización y limitar la macromolécula y la descomposición del orgánulo.
Las amoladoras de tejido Polítrón se venden como instrumentos portátiles, lo que las hace
fáciles de manejar.
2.2.3 Ultrasonidos
Los tejidos y las células podrían interrumpirse fácilmente en los baños de agua ultrasónicos.
Más adaptado para interrumpir las membranas celulares y macromoléculas en las células,
este método podría generar cantidades significativas de calor en el proceso para que pueda
desnatar proteínas y macromoléculas de ADN/ARN.
Figure 2.2 Molinillo de tejido a base de polítrones.
28
2.2.4 Congelación-Deshielo
El proceso de congelación representa un procedimiento de homogeneización "leve" y por
lo general se utiliza en combinación con otros métodos de homogeneización. Consiste en
congelarse rápidamente a -85°C y descongelarse a 4°C en secuencia (los tubos podrían
descongelarse rápidamente a 6-10°C en un baño de agua durante 10 minutos y mantenerse
en 4°C). Por lo general, de dos a tres ciclos de congelación son necesarios. La mayoría de
las veces, los tejidos se congelan una vez y se homogeneizan usando una amoladora de
tejido de mano de teflón (dos a cuatro pasadas) para obtener mejores resultados. Sin
embargo, la actividad de algunas enzimas es sensible a los ciclos repetidos de congelación-
deshielo. Las caídas en las actividades en el orden del 30% podrían observarse con
algunas enzimas. Por lo tanto, las actividades enzimáticas en muestras deben compararse
con el mismo número de ciclos de congelación-deshielo (generalmente <3 ciclos).
2.2.5 Fraccionamiento Subcelular por Centrifugación Diferencial

La separación del componente intracelular generalmente se logra mediante centrifugación
diferencial. Un procedimiento general se muestra en la Figura 2.3 que se puede adaptar
Homogeneizado de tejido/célula
Tamizado
500-1000 x g 15 min 2–4°C
Bolita (núcleos, sobrenadante

restos celulares)
9000 x g 20 min 2–4°C
Pelotilla (mitocondrias, Sobrenadante (vesículas de

sinaptosomas) membranas, lisosomas,
microsomas)
15–20000 x g 20–30 min 2–4°C
Pelotilla (vesículas sobrenadante

de membrana,
lisosomas 100-110000 x g 60–90 min 2–4°C*
Pellet sobrenadante
Microsomas
Citosol (fracción soluble)
(retículo
endoplásmico
áspero y liso)
* Requerir una ultracentrífuga
Figure 2.3 Esquema General de centrifugación para el aislamiento de fracciones intracelulares.
29
dependiendo del tipo de tejido o especies de prueba bajo investigación. El homogeneizado

generalmente contiene fibras tisulares, desechos celulares y células intactas, que se
eliminan mediante un procedimiento de tamizado (50-500 μm) como rejillas metálicas o
plásticos o tela de lana "algodón-queso". Este paso es opcional si el aislamiento de núcleos
puros no es un objetivo. El homogeneizado está centrifugado entre 1000 y 1500 g por 15
minutos para aislar grandes desechos celulares y núcleos. El sobrenadante se centrifuga
a 9000 x g para 20-30 min a 2-4°C para obtener el pellet mitocondrial crudo y el
sobrenadante. Con homogeneizados de tejido nervioso, el pellet también contiene
sinaptosomas crudos de las células nerviosas (de terminales nerviosos). Las mitocondrias
y los sinaptosomas podrían separarse aún más por la centrifugación del gradiente de
densidad de sacarosa, como se explica en el Capítulo 9. El sobrenadante podría ser
centrifugado entre 15 y 20,000 g por 20 minutos para aislar vesículas de membrana y
lisosomas (pellet). Por último, el sobrenadante está ultracentrífuga a 105,000 g durante 60-
90 min a 2-4°C para paletizar los microsomas (retículo endoplasmático suave y áspero) y
el citosol (sobrenadante). Los microsomas generalmente se resuspende en hielo frío 10
mM HEPES-NaOH buffer, pH 7.4, que contiene 150 mM NaCl o KCl (o fosfato sódico de
100 mM, pH 7.4), 1 mM EDTA, 1 mM de ditiotreitol y 20% de glicerol como agente
crioprotector. Si no hay ultracentrífuga disponible, entonces los microsomas podrían
aislarse utilizando el método de precipitación de calcio [1]. Este procedimiento consiste en
añadir 10 mM CaCl2 a los 9000 o 12,000 x g de sobrenadante y centrífuga a 15,000 x g por
30 minutos a 2-4°C. Los microsomas agregados del calcio se encuentran en el sedimento
y se resuspendido en el mismo tipo de amortiguador como se describió anteriormente.
Las enzimas marcadoras podrían utilizarse para evaluar la pureza (o contaminación por)
de la fracción subcelular (Tabla 2.2). Las enzimas son específicas o
Table 2.2 Enzimas marcadoras para los orgánulos principales

orgánulo Enzimas marcadoras
Núcleos
membrana
plasmática 5´-nucleotidasa Na/K-ATPasa Fosfatasa alcalina
Mitocondria Citocromo c oxidasa Succinato deshidrogenasa
Lisosomas Fosfatasa ácida
Microsomas NADPH-citocromo P450 reductasa, citocromo P450-relacionado
enzimas (benzo[a]pireno hidroxilasa, dibenzoilflouresceína dealquilasa,
etilmorfina-N-desmetilasa)
citosol Glutatión S-transferasa
30
a alta actividad en los orgánulos objetivo. Esto representa un medio cuantitativo para
evaluar el procedimiento de aislamiento y enriquecimiento de fracciones subcelulares [2].
2.2.6 Conservación de muestras biológicas para biomarcadores

Las muestras biológicas generalmente se conservan congeladas para su almacenamiento
a largo plazo. Para almacenamiento a largo plazo (>1 mes), las muestras generalmente se
congelan a -85°C. Algunos laboratorios utilizan hielo seco para congelar, pero la
temperatura es de -78.5°C. Para la congelación a corto plazo (<1 mes), una temperatura
de congelación de -20°C es aceptable. Especialmente para las enzimas, la actividad se
pierde después de cada ciclo de congelación. En general, una pérdida del 20-30% en la
actividad enzimática ocurre después de cada paso de congelación, especialmente en
ausencia de agente crioprotector como el glicerol, pero esto debe ser comprobado con cada
enzima. Las enzimas unidas a la membrana y los conjuntos de enzimas cuaternarias son
particularmente sensibles a los ciclos repetidos de congelación. Trate de organizar su
trabajo para que solo se requiera un máximo de uno o dos ciclos de congelación.
Referencias
1. Hamilton RL, Moorehouse A, Lear SR, Wong JS, Erickson SK. Un método rápido de
precipitación de calcio de recuperar grandes cantidades de retículo endoplasmático
áspero altamente puro. J Lipid Res 1999; 40:1140-7.
2. Padh H. Organelle aislamiento y ensayo de enzimas marcadoras. En: Goldman CA,

editor. Estudios probados para la enseñanza de laboratorio, vol. 13. Actas del 13º
Taller/Conferencia de la Asociación para la Educación de Laboratorio de Biología
(ABLE), 1992. p. 129-46.
31
9
Interrupción neuroendocrina
François Gagné
Esquema del capítulo
9.1 Evaluación de Vitelogenina como marcador de estrogenicidad 146
9.1.1 Reactivos 147
9.1.2 procedimiento 147
9.1.3 Cálculo de datos 148
9.1.4 Precauciones 148
9.2 Estradiol-17β o sitios de unión a esteroides 150
9.2.1 Reactivos 150
9.3 Ensayo fluorométrico para catecolaminas e indolaminas 152
9.3.1 Reactivos 152
9.3.2 Extracción de aminas biogénicas 153
9.3.3 Determinación de indolaminas (Serotonina) 153
9.3.4 Determinación de 5-HIAA 154
9.3.5 Determinación de adrenalina y dopamina 154
9.4 Inmunoensayos competitivos para la dopamina y la serotonina 154
9.4.1 Reactivos y Soluciones 155
9.4.2.1 Adsorción de conjugado de dopamina albúmina 156
9.4.3 Cálculo y análisis de datos 157
9.5 Actividad de la monoamino oxidasa 158
9.5.1 Reactivos 158
9.5.3 análisis de datos 159
9.6 Neurotransmisor dirigido adenilato ciclasa Actividad en Sinaptosomas 160
9.6.1 Reactivos 160
9.6.3 Cálculo y análisis de datos 161
9.7 Acetilcolinesterasa 162
9.7.1 Reactivos 162
9.7.3 Data Analysis 163
9.8 Análisis de esteroides por cromatografía de capa delgada de alto rendimiento 164
9.8.1 Reactivos 164
32
9.8.3 Análisis de datos 166

9.9 Evaluación de glutamato y γ-amino butirato 166
9.9.1 Determinación de la actividad del glutamato descarboxilasa 166
9.9.1.1 Reactivos 167
9.9.1.2 procedimiento 167
9.9.2 Determinación de GABA endógeno 167
9.9.3 Detección de GABA 168
9.9.3.1 Reactivos 168
9.9.3.2 procedimiento 168
9.9.3.3 Análisis de datos 169
Referencias 169
La presencia de sustancias químicas que pueden interrumpir los sistemas de señalización

neuroendocrina es un área de investigación intensa en ecotoxicología. Interrupción en la
señalización de estrógenos por compuestos que imitan estrógenos fue y sigue siendo el
objeto de muchas investigaciones, pero no sólo las hormonas se ven afectadas,
neurotransmisores son así [1,2]. En los organismos ovíparos, la estimulación del receptor
de estrógeno (estradiol-17β) conduce a la síntesis de vitelogenina, un precursor de yema
de huevo destinado como fuente de energía para el embrión en desarrollo. Las
exposiciones prolongadas a estos imitadores del estrógeno podrían llevar al desarrollo
sexual alterado tal como intersexual y feminización masculina. La evidencia reciente
sugiere que los compuestos serotoninérgicos y tal vez similares a los opiáceos también
podrían encontrarse en las aguas residuales municipales, que constituyen otros tipos de
disruptores neuroendocrinos que podrían obstaculizar el estado reproductivo y conductual
en la vida silvestre [2]. Este capítulo presentará métodos para examinar el sistema
neuroendocrino en peces y bivalvos en varios aspectos: unión a estradiol-17β,
vitelogenina, metabolismo y señalización de la serotonina y dopamina, metabolismo
glutamato y γ- de aminobutirato y acetilcolinesterasa.
9.1 EVALUACIÓN DE VITELLOGENINA COMO MARCADOR DE ESTROGENICIDAD

Vitelogenina (Vtg) se sintetiza en el hígado en vertebrados y en los tejidos de la gónada en
invertebrados (mejillones, almejas y gasterópodos) y está bajo el control de estradiol-17β
y otros precursores neuro peptídicos del sistema nervioso. En este capítulo se presentan
ensayos indirectos y directos para Vtg. El ensayo indirecto se basa en los niveles de
fosfatos alcalino-lábiles (ALP) en proteínas de alto peso molecular, que son fraccionadas
por acetona o éter de metilo t-butilo [3]. De hecho, los ALP podrían utilizarse como sustituto
de los niveles de Vtg en peces, mejillones y almejas, pero no en gasterópodos en la
33
mayoría de los casos. Hay muchas variaciones del método ALP para la evaluación Vtg,
que aporta cierto grado de sensibilidad y ofrece menos interferencias como la turbidez [4,5].
Los ensayos directos para Vtg podrían realizarse mediante reacción cuantitativa en cadena
de la polimerasa o mediante inmunoensayos basados en enzimas disponibles
comercialmente si están disponibles para una especie determinada. Vtg es altamente
específico de especies para que un inmunoensayo Vtg salmónido por lo general no
funciona con otras especies de peces, por ejemplo.
9.1.1 Reactivos
Estándar de fosfato: Disolver 1.74 g de fosfato monobásico de potasio en 100 ml de

NaOH 1 M para dar 0.5 g de fosfato/100 ml (5 mg de fosfato/ml). Diluir esta solución de
reserva 1/100 para obtener una concentración final de 50 𝜇𝑔 fosfato/ml.
Reactivo de molibdato: Disolver 1 g de molibdato de amonio (Sigma A7302) en 100 ml

de ácido sulfúrico de 0,9 M (H2SO4). Hacer ácido sulfúrico en esta concentración
mezclando 5 ml de ácido sulfúrico concentrado (en una capucha de humo y usar guantes
protectores, anteojos y bata de laboratorio) en 100 ml de agua SQ.
Reactivo de ascorbato: 1 g de ácido L-ascórbico (Sigma A7631) con 100 ml H2O.
NaOH 1 M: Disolver 4 g NaOH en 100 ml de agua SQ.
9.1.2 Procedimiento
Los tejidos se homogeneizan en el amortiguador de homogeneización helado que contiene
inhibidor de la proteasa, agentes reductivos (ditiotreitol o β-mercaptoetanol), y quelante de
calcio/magnesio (EDTA); por ejemplo, tampón Tris-acetato de 50 mM, pH 8, que contiene
100 mM NaCl, 0,1 mM ditiotreitol y 0,1 mM EDTA. La apoprotinina podría añadirse como
inhibidor de la proteasa a 1-10 μg/ml. El homogeneizado se centrifuga a 12.000 x g durante
20 minutos a 2°C y el sobrenadante es recogido para su análisis.
Acetona se añade un 200 μL del sobrenadante para obtener una concentración final del
35% y se coloca en hielo durante 10-15 min. A continuación, la mezcla se centrifuga en
10.000 x g durante 5 min a 4°C. El sobrenadante se retira y el sedimento se lava en 500
μL de acetona al 50% para eliminar cualquier rastro de lípidos y fosfatos libres. A
continuación, el sedimento se seca (aire) y se resuspende con 100 μL de NaOH 1M y se
incuba durante 60 min a 37°C.
Los fosfatos inorgánicos liberados se determinan a continuación mediante un ensayo

espectrofotométrico utilizando el reactivo complejo de ácido fosfomólibdico [6]. En una
34
microplaca transparente, 20 μL del espacio en blanco (solo NaOH), estándar (20 μL de

fosfato estándar de 5 μg/mL de fosfato), y la muestra (pellet resuspendido en NaOH) se
añade en duplicado a 125 μL de agua. Añadir rápidamente 5 μL de ácido tricloroacético
(6,1 N), 25 μL de reactivo de molibdato, y 25 μL de ascorbato, y mezclar a fondo durante 5
minutos en un mezclador de microplacas si está disponible o mediante pipeteo repetido si
no. Determine la absorbancia del complejo de fosfomolibdato a 815 nm.
La absorbancia a 444 nm también se mide para la corrección de turbidez, si está
presente.
9.1.3 Cálculo de datos

En primer lugar, la absorbancia a 815 nm se corrige para la turbidez mediante la siguiente
ecuación:
A815 corregido = (1.045 x A815) - (0.043 x A444)
La concentración de fosfato viene determinada por lo siguiente:
[muestra de A815 − A815 en blanco]X Concentración estándar de fosfato/2A815
estándar - A815 en blanco X (volumen de la muestra μL/volumen total del ensayo μL) x
(1mL /volumen S 12 utilizado) = Y μg=/mL
En el ejemplo actual, los volúmenes son, respectivamente, 200/20 x 1000/ 200 = 50.
Esta concentración se normaliza con proteínas totales (mg/ml) o homogeneiza el peso del
tejido en g/ml
Y μg/mL/g peso del tejido/ml o mg/proteína mL
= Z μg fosfato/g o Z μg fosfatos/mg proteínas)
9.1.4 Precauciones
El ensayo genérico para Vtg utilizando el ALP se basa en el principio de que cuando el Vtg
altamente fosforilado se produce en tejidos de alta concentración. Los niveles de ALP en
lipofosfoproteínas de alto peso molecular aumentan por encima de los niveles de fondo de
ALP en los tejidos. Dado que las proteínas de yema de huevo podrían alcanzar más del
50% del total de proteínas en la gónada, el aumento de ALP a partir de proteínas de alto
peso molecular es indicativo de Vtg. Además, las proteínas Vtg generalmente tienen una
mayor proporción de sitios de fosforilación que los niveles promedio en los tejidos en el
intento de mitigar las señales de fondo, pero esto depende de la especie examinada. De
hecho, se estimó que el valor medio de la serina y la treonina en un grupo proteico en
eucariotas se encuentra en el rango del 10.9% del contenido total de aminoácidos [7]. Por
ejemplo, Vtg de Mytilus edulis tiene alrededor del 14.8% de los sitios potenciales de
35
fosforilación (serina y treonina) que son compatibles con la metodología ALP. Por el
contrario, en los gasterópodos, el número de sitios de fosforilación está cerca del valor
medio de fondo y el método ALP no se puede utilizar [8].
La técnica ALP es un medio conveniente, barato y rápido para examinar o explorar la
presencia de lipofosfoproteínas fosforiladas de alto peso molecular en varios organismos.
Sin embargo, dado que este método es indirecto, recomendamos ejecutar electroforesis de
gel con manchas azules de plata o Coomassie en el material precipitado por acetona para
detectar la presencia de proteínas femeninas específicas en los tejidos gónada para validar
el ensayo. También se podría utilizar la tinción de fosfato con varios tintes (molibdato de
amonio/verde metilo, "Manchas todas", Manchas de diamante Pro-Q). Se deben considerar
las siguientes precauciones al aplicar el ensayo indirecto de ALP en organismos:
1. Los ovocitos que contienen mujeres deben tener valores de ALP más altos que los
antecedentes, que podrían ser hembras o machos no grabados. Esto podría
comprobarse ejecutando una electroforesis de gel en paralelo al principio.
2. Debido a que los valores basales de ALP son de fondo (de los niveles medios de fosfato
de otras proteínas durante el fraccionamiento de acetona), no podemos interpretar esto
como Vtg obviamente; es el aumento (cambio) en el ALP de lipofosfoproteínas
fraccionadas de alto peso molecular que está relacionado con Vtg y no con los valores
basales.
3. Los datos de ALP deben compararse entre machos y hembras que se encuentran en
la misma etapa de gametogénesis (etapas tempranas, medias, tardías y en reposo).
Los niveles de ALP en las mujeres en las primeras etapas medias de la gametogénesis
deben ser más altos que los hombres. En algunos casos, si el contenido de proteínas
en las hembras es más alto en la gónada que en los machos en las etapas de reposo
o temprano, entonces los niveles de ALP en las hembras podrían ser más bajos que
los hombres.
4. Generalmente se reconoce que los organismos bajo gametogénesis activa en la etapa
tardía y desove son menos sensibles a la exposición a disruptores endocrinos porque
su fisiología es impulsada por la reproducción. Para la detección de disruptores
endocrinos, los niveles de ALP generalmente se miden en organismos en la etapa de
reposo o temprana de gametogénesis y preferiblemente en los hombres. Por ejemplo,
se informó que las poblaciones silvestres de mejillón recolectadas aguas abajo a las
plumas de dispersión de aguas residuales municipales mostraron una mayor proporción
en las hembras, mientras que los machos habían aumentado los niveles de ALP y
36
mostraban la banda de proteína de alto peso molecular femenino especifico después de

la electroforesis de gel [9].
5. En las hembras embarazada o en las etapas medias y tardías de la gametogénesis, el
método ALP podría sufrir problemas de sobre normalización al normalizar por el
contenido total de proteínas. Si las proteínas de yema de huevo representan más del 1%
del contenido total de proteínas en la muestra, normalizar con proteínas totales podría
normalizar en exceso los niveles de ALP. Recomendamos corregir el peso del tejido o
utilizar los métodos de adición residuales o escalonadas explicados en el Capítulo 2.
9.2 ESTRADIOL-17β O SITIOS DE UNIÓN DE ESTEROIDES
La aparición de estradiol-17β sitios de unión podría determinarse por el potencial de

unión de estradiol-17β de proteínas citosólicas en un extracto de tejido dado. Para medir
la unión a proteínas citosólicas, se utilizó estradiol-17β vinculada a albúmina etiquetada
fluorescentemente (E2-A-FITC). E2-A-FITC vinculado a los receptores producirá un
complejo proteico que se puede eliminar de E2-A-FITC sin enlazar por ultrafiltración a
través de una membrana de poro de 100 kDa. De hecho, el receptor E2 tiene un peso
molecular de ~70 kDa y albúmina un peso molecular de 60 kDa que equivale a un
complejo proteico de 130 kDa, que puede ser separado por un dispositivo de
ultrafiltración de 100 kDa (Figura9.1). Se cuidó de limitar la interacción proteica no
específica y se encontró que la β libre de estradiol-17 competía eficazmente con la unión
E2-A-FITC [10]. En la gónada de Elliptio complanata, una constante de disociación de
0.4 nM para estradiol fue determinada por esta metodología, que estaba en el mismo
rango de receptores de anfibios [10].
9.2.1 Reactivos
Búfer de aislamiento del receptor: 10 mM HEPES, pH 7.4, que contiene 50 mM NaCl,

10 mM de molibdato de amonio, 1 mM EDTA y 5 mM de ditiotreitol.
Búfer de ensayo: PBS que contiene 0.1% interpolación 20, 0.05% albúmina sérica
bovina (BSA) y ditiotreitol de 5 mM. Disolver 0,1 g de interpolación 20, 0,1 g BSA, y 77
mg de ditiotreitol en 100 ml de solución PBS. PBS se compone de NaCl de 140 mM, 5
mM KH2PO4, 1 mM NaHCO3, y 10 mM HEPES-búfer NaOH, pH 7.4. Filtrar en un filtro de
membrana de 0,2 μm. Prepárense frescos.
Reactivo E2-A-FITC: Disolver 1 mg de E2-A-FITC (E2 vinculado a isotiocianato de
fluoresceína albúmina) en 10 ml de búfer de ensayo. Almacenar en la oscuridad para
37
E2
E2 FITC
E2 FITC
FITC
Figura 9.1 Principios esquemáticos de los sitios de unión estradiol-17β en los tejidos. Free E2-A-FITC pasa a través
del filtro mientras que E2-A-FITC unido a los receptores proteicos se conserva en el filtro de membrana de 100 kDa.
1 semana a 4°C. Diluir a 100 nmol estradiol/ml con el búfer de ensayo. Se requiere un
reductor como el ditiotreitol, ya que la albúmina tiende a oxidarse y formar agregados,
que aumentan la unión de fondo de E2-AFITC al filtro de membrana.
9.2.2 Procedimiento
Los homogeneizados de tejido se preparan en el amortiguador de aislamiento del receptor
usando un teflón triturador de tejido de mano (cinco pasadas sobre hielo). A continuación,
el homogeneizado se centrifuga a 12.000 x g durante 20 minutos a 2°C. El sobrenadante o
fracción S12 se recupera, se mantiene en hielo y se filtra en un filtro de membrana de 0.2
μm para eliminarlas vesículas de membrana. La fracción S12 filtrada se diluye 1/5 en la
solución de ensayo. Un volumen igual (150 μL) se mezcla con 1 volumen de reactivo E2-
A-FITC e incubado durante 30-60 min a temperatura ambiente. A continuación, la mezcla
se centrifuga en un dispositivo de ultrafiltración de 100 kDa (unidad de inserción de
ultrafiltración de 400 μL para tubos microcéntrifugado; Sigma Chemical Company) a 10,000
x g a 4°C durante 15-30 min. E2-AFITC unido a receptores u otras proteínas de alta afinidad
(es decir, con un peso molecular de 40 kDa o más) se conservará en la membrana ultrafiltro
mientras que el E2-A-FITC sin consolidar o libre pasará a través de la membrana. La
fluorescencia asociada con la membrana o en el eluato se mide utilizando un lector de
microplacas a 485 nm de excitación y 512 nm de emisión. Para la medición en el eluido, la
relación inversa de la fluoresceína es una medida de unión E2 a proteínas citosólicas. Los
38
espacios en blanco contienen sólo E2-A-FITC sin proteínas citosólicas y el control positivo
del estradio17β sin etiquetar podría utilizarse a concentraciones de 5-100 nmol/ml para
comprobar la liberación de E2-A-FITC no enlazado. Para la medición en la membrana de
ultrafiltración, el material se recupera añadiendo 100 μL de PBS en la membrana y
resuspendido por pipeteo repetido o purgado con 20 % DMSO en agua.

La concentración de fluoresceína en el eluato (E2-A-FITC sin consolidar) se determina de
la siguiente manera: fluoresceína que se encuentra en el eluato (forma libre de E2) y se
corrige con los niveles de proteínas totales. Los datos se expresan como proteína nmol/ml
de fluoresceína-1/mg.
9.3 ENSAYO FLUOROMÉTRICO PARA CATECOLAMINAS E INDOLAMINAS
Catecolaminas (dopamina y adrenalina) e indolaminas (serotonina) pueden ser

determinadas por espectroscopia de fluorescencia. Este ensayo es una manera rápida y
rentable de determinar los niveles de los neurotransmisores descritos anteriormente
siempre que haya un fluorómetro disponible. Este método se basa en el fraccionamiento
de las aminas y determinaciones selectivas de fluorescencia para la serotonina [11] y
catecolaminas [12]. La serotonina se determina utilizando el reactivo de o-ftalaldehído, que
reacciona con aminas secundarias en presencia de exceso de tioles (R-SH).
9.3.1 Reactivos
Búfer de homogeneización: Los tejidos se homogeneizan en cualquier amortiguador

isotónico como la sacarosa de 250 mM que contiene 10 mM HEPES-NaOH, pH 7.4, que
contiene 1 mM EDTA y 1 mM de ditiotreitol como agentes reductores.
Glutatión reducido (GSHR): Preparar una solución reducida de material de glutatión a
100 mM en presencia de 1 M HCl. Estable en la oscuridad a 4°C durante una semana.
Diluir 1/100 el día del análisis mezclando 20 μL en 2 ml de agua.

n-butanol disolvente: Grado reactivo n-butanol.
OPT reactivo: Disolver 10 mg de o-ftalaldehído en 0.1 M HCl. Mantener en la oscuridad
y estable durante una semana a 4°C.
Solución de Lugol: Disolver en una campana de humo 2,5 g de yodo y 5 g de yoduro de
potasio en agua destilada de 100 ml. Esta solución también está disponible
comercialmente en diferentes formulaciones.
39
Estándares: Preparar por separado una solución de 5 μmol/ml (5 mM) de serotonina,

dopamina, ácido 5-hidroxiindolacético (5-HIAA), y adrenalina en 0,1 M HCl. Estas
aminas biogénicas, con la excepción de 5-HIAA, están sometidas a oxidación, que se
previene en condiciones ácidas. La adición de 1 mM reducido glutatión u otro reductor
podría prevenir aún más la oxidación. Estable durante 1 semana en la oscuridad a 4°C.
Solución NaHCO3: Preparar una concentración de NaHCO3 de 100 mM en agua, ajustar

el pH a 9 con NaOH 1 M.
9.3.2 Extracción de aminas biogénicas
En los tubos microcentrífugados duplicados, agregue 100 μL de GSH R a 250 μL de

homogeneizado. Mezcle los tubos por inversión y soporte durante 5 minutos. Añadir 300
μL de n-butanol y mezclar (vórtice) y centrífuga a 10,000 x g durante 20 s. Retire el
sobrenadante y deseche el pellet. Añade 1 volumen de hexano (600 μL) y centrífuga de
nuevo. La fase acuosa está en la parte inferior y la fase orgánica en la capa superior. El
metabolito de la serotonina (5-HIAA) se encuentra en la fase orgánica (mantener a un lado).
Se podría realizar un paso de preconcentración facultativo si las aminas biogénicas

están demasiado diluidas en el homogeneizado. El procedimiento consiste en mezclar 200-
300 μL de la fase acuosa a 1 volumen de agua y 50 mg de purines de alúmina activados
(lavados en agua bidestilada) en un tubo de microcentrífuga. La alúmina se peletiza por
breve centrifugación a 5000 x g durante 30 s y se resuspende en agua. La muestra se
centrifuga de nuevo, el agua se desecha, y las aminas biogénicas se eluyen
resuspendiendo el sedimento en 50-100 μL de 100 mM Tris-acetato, pH 8. La alúmina se
elimina mediante un breve paso final de centrifugación.
9.3.3 Determinación de indolaminas (Serotonina)
En una microplaca oscura para lecturas de fluorescencia, pipeta 25-100 μL de la fase

acuosa (fase inferior), y añadir 100 μL de agua SQ y 40 μL del reactivo OPT. Caliente la
microplaca a 70°C en un baño de agua durante 15 minutos. Enfriar a temperatura ambiente
y determinar la fluorescencia a 360 nm de excitación y 460 nm para la emisión. El espacio
en blanco contiene sólo el búfer de homogeneización y reducción de GSH, y 0.5 mM
estándar de serotonina se añade en otro pozo en duplicado para la calibración.
40
9.3.4 Determinación de 5-HIAA
En un tubo de microcentrífuga, mezcle 200 μL de la fase superior de hexano con 100 μL

de NaHCO3. Mezcle brevemente la inversión y la centrífuga para separar las fases si es
necesario. Recoger 75-85 μL de la fase acuosa en la parte inferior del tubo. Realizar
ensayos como se describió anteriormente para la serotonina. Se prepara una solución
estándar en blanco y de 0.5 mM de 5-HIAA reemplazando la muestra de homogeneizado
por NaHCO3.
9.3.5 Determinación de adrenalina y dopamina
En un tubo de microcentrífuga, retire 100 μL de la fase acuosa y agregue 390 μL de agua

SQ y 10 μL de solución alcalina de yodo/yoduro (solución de Lugol). Prepare esto en una
capucha de humo y use gafas y guantes protectores. Incubar durante 5 minutos a 75°C y
transferir 200 μL a un lector de microplacas de fluorescencia o espectrómetro y leer
fluorescencia a 395 nm de excitación y 475 nm para emisión (adrenalina). Preparar
espacios en blanco y adrenalina estándar en pozos separados (50-150 nmol / mL).
Continúe calentando a 75°C durante 60 min y retire 200 μL a una microplaca/espectrómetro
de fluorescencia y lea a 325 nm de excitación y 380 nm para la emisión (dopamina).
Preparar espacios en blanco (solo búfer de homogeneización) y estándar de dopamina
(50150 nmol/ml) en pozos separados.

Los datos se obtienen utilizando el protocolo de serotonina como ejemplo:
nmol
Concentración estándar de serotonina (500 mL ) nmol
(Unidades de fluorescencia (FU) muestra − FU en blanco) x [ ] = serotonina
(FU estándar− FU en blanco) mL
Esta concentración se corrige entonces para los factores de dilución (240/100) / (1000/200
μL de volumen de homogeneizado) y se normaliza contra proteínas totales de
homogeneizado o peso húmedo/seco para producir proteínas nmol serotonina/mg o g peso.
9.4 ENSAYOS INMUNOLÓGICOS COMPETITIVOS PARA LA DOPAMINA Y LA

SEROTONINA
Un ensayo altamente sensible, específico, y rápido para la dopamina y la serotonina en
muestras biológicas se presenta. El ensayo se basa en la unión competitiva de anticuerpo
monoclonal de dopamina a dopamina atada en la parte inferior del pozo y dopamina
41
presente en la muestra de prueba [13]. El ensayo competitivo se basa en el siguiente

principio: cuanto más concentrado la dopamina en la muestra de prueba, menos anticuerpo
estará obligado a adsorbed dopamina en la parte inferior del pozo. La cantidad de
anticuerpos unidos en la parte inferior del pozo es detectada por una peroxidasa de rábano
picante vinculada a anticuerpos secundarios. Para aumentar aún más la sensibilidad del
ensayo, la actividad peroxidasa se detecta utilizando un sustrato quimioluminiscencia
altamente sensible (luminal). Por lo tanto, este ensayo requiere un lector de microplacas de
luminiscencia. Los sustratos a base de fluorescencia y absorbancia podrían utilizarse en su
lugar, pero con menor sensibilidad. El ensayo se presenta para la dopamina y podría
adaptarse a la serotonina (o cualquier otro neurotransmisor u hormona) simplemente
cambiando el anticuerpo primario y los estándares de serotonina como se describe en las
siguientes tablas.
9.4.1 Reactivos y soluciones

Artículos
Solución salina tamponada de fosfato 140 mM NaCl, 5 mM KH2PO4,1 mM NaHCO3, pH

(PBS) 7.4
Amortiguador de recubrimiento Tris-HCl de 50 mM, pH 8,5
Búfer de lavado PBS 1 x
Búfer de bloqueo PBS con 1% de leche en polvo sin grasa
Amortiguador de dilución PBS con 0.5% de leche sin grasa en polvo
Dopamina BSA (0.5μg/pozo) Solución de 5 μg de stock g/ml en agua; estable
durante 1 semana.
Serotonina-BSA (0.5 μg/pozo)
Anticuerpo primario Conejo policlonal a dopamina (IgG; criado contra
dopamina-glutaraldehído-BSA) o conejo policlonal
a serotonina (IgG)
Diluir 1/5000 con tampón de dilución
Anticuerpo secundario IgG anti-conejo: conjugado peroxidasa rábano
Diluir 1/10000 con tampón de dilución
Stock standard Prepárese en PBS (inestable, manténgase en la
oscuridad y en
Dopamina 20 mM 4°C)
Serotonina 20 mM
Sustrato peroxidasa Sustrato BM Quimioluminiscencia ELISA
9.4.2 procedimiento
En primer lugar, preparar diluciones en serie de dopamina utilizando el búfer de dilución
como se describe en la tabla siguiente.
42
dopamina Volumen (μl) Dopamina Volumen (μl) Dilución

(μM) 20 mM Buffer
S1 4000 300 1200
Diluciones en
serie
S2 2000 750 μl S1 750
S3 1000 750 μl S2 750
S4 500 750 μl S3 750
S5 250 750 μl S4 750
S6 125 750 μl S5 750
S7 62.50 750 μl S6 750
S8 31.25 750 μl S7 750
S9 15.63 750 μl S8 750
S10 7.81 750 μl S9 750
S11 3.91 750 μl S10 750
S12 1.95 750 μl S11 750
Para la serotonina, los estándares se preparan de la siguiente manera:

Serotonina (μM) Volumen (μl) Volumen (μl) Dilución
Serotonina búfer
20 mM
S1 1000.00 50 950
Diluciones en serie
S2 500.00 400 400
S3 250.00 400 400
S4 125.00 400 400
S5 62.50 400 400
S6 31.25 400 400
S7 15.63 400 400
S8 7.81 400 400
S9 3.91 400 400
S10 1.95 400 400
S11 0.98 400 400
S12 0.49 400 400
9.4.2.1 Adsorción del Conjugado Dopamina-Albúmina
Preparar la dopamina BSA en el amortiguador de recubrimiento a una concentración final

de 5 μg/L. Transferencia 100 μL de esta solución a cada pozo (microplaca para
luminiscencia Microlita 2). Mantener tres pozos sin dopamina BSA como espacios en
blanco para controlar la unión inespecífica de anticuerpos. Coloque la cubierta o el sello
con membrana de Parafilm e incuba durante la noche a 4°C en la oscuridad. Después del
período de incubación, retire todo el líquido por aspiración o invirtiendo la microplaca en
una toalla absorbente. Lave los pozos con 200 μL de PBS tres veces. No seque los pozos.
Agregue inmediatamente 250 μL de búfer de bloqueo en cada pozo e incube durante 90
minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
43
Mientras tanto, preparar las muestras, estándares de dopamina (ver arriba), y el

anticuerpo primario en el buffer de dilución. Retire el búfer de bloqueo en los pozos y lave
una vez con el búfer de lavado. Mezclar 50 μL de cada estándar de dopamina, muestra, y
en blanco (buffer de dilución solamente) a 50 μL de anticuerpo primario en pozos que
contienen dopamina BSA adsorbida. Incuba a temperatura ambiente durante 90 minutos
en la oscuridad. Durante ese tiempo, el anticuerpo primario se unirá proporcionalmente a
la dopamina en las muestras o los estándares S2-S11, es decir, cuanta más dopamina en
solución menos unión a la dopamina BSA adsorbida en la parte inferior de los pozos (enlace
competitivo).
Durante este paso de incubación, preparar la dilución del anticuerpo secundario en el
amortiguador de dilución. Al final del período de incubación, lave tres veces con 200 μL de
amortiguador de lavado. Añadir 100 μL de anticuerpo secundario conjugado a la enzima
peroxidasa. Cubrir e incubar durante 60 minutos en la oscuridad.
Durante ese tiempo, prepare el sustrato quimioluminiscencia según el kit de
proveedores. Una preparación interna podría hacerse preparando 1-5 μM luminol con 50-
100 μM H2O2 (preparar fresco justo antes del ensayo). Después del período de incubación,
retire el anticuerpo secundario y lave tres veces con el búfer de lavado (PBS). Añadir 100
μL de sustrato quimioluminiscencia y leer luminiscencia después de 35 min en un lector de
microplacas (por ejemplo, instrumento camaleónico, lecturas directas, tiempo de lectura de
500 ms).
9.4.3 Cálculo y análisis de datos

Se produce una curva de enlace competitiva como se muestra en la figura 9.2. Esta curva
servirá para extrapolar los niveles de dopamina en la muestra de prueba. Debido a que la
cuantificación se basa en la inhibición de la actividad peroxidasa, se deben analizar
muestras con picos para eliminar cualquier posible efecto de matriz al principio. Si no se
observa ninguna interferencia en presencia de la muestra de ensayo, se podrían utilizar
diluciones de la muestra de ensayo para determinar la concentración de dopamina dentro
de la ecuación lineal en la Figura 9.2. Si se encuentra interferencia, la calibración debe
realizarse mediante la metodología de adición estándar, como se explica en el Capítulo 8.
La concentración extrapolada de dopamina (nmol/ml) se normaliza contra proteínas

totales (mg/ml) o peso homogeneizado tisular (g/ml) para dar dopamina nmol (o
serotonina) /mg de proteínas.
44
(Unidades de luz relativas / min)

Actividad de peroxidasa
Dopamina (log uM)

Figura 9.2 Curva de competencia típica de ensayos inmunes basados en enzimas.
9.5 ACTIVIDAD DE MONOAMINO OXIDASA

La actividad de la monoamino oxidasa (MAO) se encuentra en las mitocondrias y el ensayo
debe realizarse en la fracción de mitocondrias para la máxima sensibilidad. Las
mitocondrias se preparan centrifugando primero el homogeneizador (preparado en
condiciones isotónicas) a 1500 x g durante 15 minutos a 2-4°C y centrifugando el
sobrenadante a 9000 x g durante 20 min a 24C. El pellet corresponde a la fracción
mitocondrial cruda y se resuspende en un pequeño volumen de amortiguador isotónico. Sin
embargo, el ensayo puede realizarse hasta la fracción homogeneizada o sobrenadantes
obtenidos por debajo de 6000 x g, pero la peroxidasa citosólica estaría presente cuando se
deben incluir controles específicos (midiendo en presencia/ ausencia del sustrato de la
tiramina). El principio del ensayo se basa en la detección de H 2O2 liberado por el
diclorofluoresceína diacetato/sistema peroxidasa que se forma a partir de la reacción de
desaminación de aminas biogénicas (serotonina, dopamina) o sustrato genérico no
específico como la tiramina.
9.5.1 Reactivos
Búfer de ensayo: Prepare 140 mM NaCl y 10 mM HEPES-NaOH, pH 7.4.
Sustrato de tiramina (1 mM): Disolver 14 mg en agua SQ de 10 ml.
Diclorofluoresceína/peroxidasa: Preparar una solución de stock de diacetato de
diclorofluoresceína a 10 mM en dimetilsulfóxido (DMSO). Preparar una solución de 5
mg/ml de peroxidasa de rábano picante. Diluir la solución de stock de peroxidasa para
45
obtener 10 μg/mL en el búfer de ensayo. Por último, diluir diacetato de

diclorofluoresceína a 10 μM con la solución peroxidasa de 10 μg/ml.
Aminotriazol (inhibidor de la catalasa): Preparar una solución de stock de 10 mM, es
decir, 84 mg en 10 ml de agua SQ.
Estándar de fluoresceína: Prepare una fluoresceína de 10 mM en el búfer de ensayo.
Diluir 1/100 para obtener 100 μM fluoresceína en el búfer de ensayo. Diluir de nuevo a
1/ 100 para obtener 1 μM. La solución estándar se prepara mezclando 20 μL de 1 μM
fluoresceína con 180 μL del búfer de ensayo.
9.5.2 Procedimiento
En una microplaca para la fluorescencia, mezcla 40 μL de homogeneizar, fracción de
mitocondrias (mejor) o amortiguador de homogeneización (en blanco), 10 μL de tiramina,
20 μL de diclorofluoresceína diacetato/solución peroxidasa, 10 μL Aminotriazol, y 20 μL de
tampón de ensayo. El Aminotriazol previene la hidrólisis de H2O2 por catalasas. Incubar
entre 30 y 60 minutos a 30C y tomar lecturas de fluoresceína a 485 nm de excitación y 525
nm de emisión en cada intervalo de 10 minutos. En pozos separados, se prepara un espacio
en blanco con sólo el sobrenadante, que podría contener trazas de peroxidasa endógena
y H2O2 sin la adición de tiramina (reemplazado por el búfer de ensayo). Para la calibración,
se prepara un búfer en blanco y flúor estándar 0.1 μM en el búfer de ensayo.
9.5.3 Análisis de datos

La actividad enzimática está determinada por la tasa de cambio de unidades de
fluorescencia de fluoresceína (FU) en el tiempo:
[FU muestra − FU en blanco ]en el tiempo t min[FU muestra − FU en blanco]
en el momento t "O" min o en blanco x (1/tiempo t min) = Cambiar FU/min
Las FUs podrían transformarse en nmol fluoresceína/mL multiplicándose con lo

siguiente:
[Concentración estándar de fluoresceína/ (FU standard FU en blanco)] para dar
nmol/(min/mL) fluoresceína formada. A continuación, la actividad enzimática se
normaliza contra proteínas totales o peso homogeneizado tisular para obtener actividad
específica (nmol fluoresceína/min/mg proteínas o g peso del tejido g).
46
9.6 NEUROTRANSMISOR DIRIGIDO ADENILATO ACTIVIDAD CÍCLASE EN SINAPTOSOMAS

Los sinaptosomas consisten en vesículas de membrana de la sinapsis, que son ricas en
receptores (absorción) y transportadores (recaptación) de neurotransmisores y bombas de
sodio/ potasio para mantener la polaridad transmembrana [14]. Por ejemplo, inhibidores de
la recaptación de serotonina utilizados para tratar la depresión inhiben la recaptación de
serotonina en sinapsis. Durante ese proceso, el transportador de serotonina intercambia un
ion de potasio por una molécula de serotonina, que activa la membrana Na/K-ATPasa
actividad para mantener el gradiente electroquímico [15]. La activación de los receptores
bajo el control de GTP/adenilato ciclasa también podría medirse utilizando este sistema.
Por ejemplo, péptidos de opiáceos en los ganglios nerviosos inhibieron Na/K-ATPase
estimulado por dopamina en el mejillón azul [16]. Por lo tanto, los sinaptosomas
representan un interesante modelo neurofisiológico para estudiar los efectos
neuroendocrinos de contaminantes ambientales.
9.6.1 Reactivos
Búfer de homogeneización: Prepare 250 mM de sacarosa (0.5 L) que contenga 10 mM
HEPES-NaOH, pH 7.4, 1 mM EDTA y 1 mM de ditiotreitol (como agente reductor). La
solución de búfer es estable durante 2 semanas a 4°C.
Sacarosa de 0.8 M: Prepare una solución de sacarosa de 0.8 M que contenga 1 mM
HEPES NaOH, pH 7,4 y 0,1 mM EDTA.
Búfer de ensayo: Prepare el búfer HEPES de 10 mM, pH 7.4, que contenga 140 mM
NaCl, 1 mM MgCl2y1 mM KCl.
Ascorbato: Preparar 1% solución (0.1 g/10 mL de agua) al día.
Molibdato: Preparar molibdato de amonio al 1% en 0,9 M H2SO4.
Stock ATP: Prepare ATP diario de 5 mM en agua SQ.
Dopamina y serotonina: Preparar diariamente en tubos separados 5 mM serotonina y
dopamina en agua SQ.
Medios de reacción: Mezclar 1 mL stock ATP, 1 ml de serotonina o dopamina, y 48 ml
de amortiguador de ensayo antes del inicio del ensayo.
Ácido tricloroacético: Preparar una solución del 1% en agua SQ en botella de vidrio.
Estándar de fosfato: Preparar un estándar de fosfato sódico de 0,68 mM en agua SQ.
9.6.2 Procedimiento
Los sinaptosomas están preparados mediante una metodología conveniente de densidad
de sacarosa, aunque otros métodos disponibles están disponibles comercialmente. Los
47
tejidos cerebrales y nerviosos se homogeneizan en el búfer de homogeneización utilizando

un aparato triturador de tejidos con mortero de teflón. La homogeneización se completa con
cuatro a seis pasadas sobre hielo. A continuación, el material se centrifuga 1500 x g durante
20 min a 2-4°C. El sobrenadante se recoge y centrifuga a 9000 x g durante 20 min a 2-4°C.
El pellet se retira del sobrenadante y se resuspende en el búfer de homogeneización y
centrifugación a 9000 x g durante 20 min. El pellet se resuspende en un pequeño volumen
(0.25-0.5 mL) del búfer de homogeneización y en capas en la parte superior de 0.5-1 mL
de 0.8 M sacarosa. Centrífuga a 90003 g durante 20 min a 2-4°C, recuperar rápidamente
el sobrenadante (el pellet contiene mitocondrias crudas), añadir 2 volúmenes de agua SQ
para restaurar la osmolaridad, y mantener en el hielo o almacenar a -85°C hasta el análisis.
Na/K-ATPase actividad se determina mediante la determinación de la hidrólisis de ATP
en presencia de sinaptosomas y ya sea añadir dopamina o serotonina. Adición de otros
xenobióticos también podría añadirse para estudiar interacciones en la actividad de los
sinaptosomas. Los fosfatos liberados de la hidrólisis ATP están determinados por el ensayo
colorimétrico de fosfomolibdato (ver ensayo ALP). Premezcla 200 μL de sinaptosomas en
800 μL de medios de reacción (con o sin serotonina o dopamina a concentraciones entre
10100 μM). Transfiera 100 μL de la mezcla en una microplaca transparente e incuba
durante 30 minutos a 2025C. La reacción se detiene es la adición de 5 μL de TCA. El
espacio en blanco consiste en el t 50 min, es decir, 100 μL de los medios de reacción con
sinaptosomas que se añadió inmediatamente a TCA en un pozo de microplaca separado.
También se prepara un estándar en otro pozo que contiene el blanco (t50 min) con 10 μL
de estándar de fosfato (4 μM final concentración).
Fosfato libre total se determina utilizando el ensayo de fosfomolibdato. En una
microplaca transparente (que contiene las muestras), agregue 25 μL de molibdato, 25 μL
de ascorbato y 45 μL de agua. Mezclar durante 5 min y leer absorbancia a 815 y 444 nm
(opcional para este último).
9.6.3 Cálculo y análisis de datos

El complejo de fosfomolibdato absorbe a 815 nm. La absorbancia a 444 nm podría medirse
si la turbidez está presente en los pozos para corregir la absorbancia de fondo de la
siguiente manera [6]:
Corregido A815 nm = (1.045 x A815) – (0.043 x A444):
La actividad Na/K-ATPase se determina de la siguiente manera:
(A815 corr 30 min - A815 en blanco corr) x 5 μM fosfato/ (A815 estándar - A815 en blanco) x
1/30 min x factor de dilución (200/10 x 1000/200)) = fosfatos liberados/min/ml.
48
La actividad enzimática se normaliza contra las proteínas totales de los sinaptosomas

aislados para obtener la actividad Na/K-ATPase: hidrólisis ATP/proteínas min/mg.
9.7 ACETILCOLINESTERASA
La acetilcolina es un neurotransmisor implicado en el tono muscular y la contracción y sus

niveles están regulados por acetilcolinesterasa (AChE), que hidroliza el grupo de acetato
para formar colina: acetilcolina-acetato de colina1 [16]. AChE era y sigue siendo un
biomarcador comúnmente utilizado en estudios de ecotoxicología acuática. Al principio, los
pesticidas organofosfato, organocloruro y carbamato fueron diseñados como inhibidores de
esta enzima que conduce a una contracción muscular sostenida, parálisis y muerte debido
al desacoplamiento entre la pérdida de actividad enzimática y el aumento de la vida media
de la acetilcolina en los tejidos. De hecho, esta enzima se utilizó ampliamente como
biomarcador de la exposición de estos pesticidas en organismos no objetivo como peces
[17], mejillones [18]y erizos de mar [19]. Más recientemente, esta enzima se utilizó como
un marcador de actividad neuronal en camarones Artemia, mejillones de agua dulce [20,21]
y anfípodos [22]. Los cambios en esta actividad enzimática podrían conducir a un
comportamiento alterado y actividad neuromuscular en los organismos y podrían servir
como un biomarcador de la neurotoxicidad en los organismos. Sin embargo, esta enzima
podría ser mal utilizada en algunos casos como un sustituto de los niveles de acetilcolina y
precauciones / validación debe tomarse para asegurarse de si los cambios en la actividad
enzimática están correlacionados con los niveles de acetilcolina. Por ejemplo, una
disminución de actividad enzimática podría ser el resultado de la reducción de la
señalización acetilcolina o la inhibición de la enzima por xenobióticos (pesticida
organofosforado), que tiene diferentes consecuencias fisiológicas.
9.7.1 Reactivos
Tampón de tris-acetato: Prepare una solución de 100 mM a pH 7.2. Disolver 1.21 g de

base TRIS en 90 ml de agua, ajustar el pH a 7.4 con un 10% de ácido acético y completar
a 100 ml con agua. Se podría preparar un tampón tris-acetato de 50 mM diluyéndolo con
un volumen de agua SQ.
Reactivo de acetiltiocolina: Preparar una solución de trabajo de 1 mM en búfer trisacetato
de 50 mM. (9.9 mg en 50 ml de tampón tris-acetato de 50 mM). Reactivo de Ellman:
Prepare una solución de stock de 5 mM de DTNB en el búfer fosfato EDTA. Disolver
1,36 g de KH2PO4 y 4.5 mg EDTA en 80 ml de agua bidestilada. Ajuste el pH a 7.2 con
NaOH y agregue 0.2 g DTNB.
49
Completo a 100 mL con agua. Esta solución de stock es estable durante 2 meses en la
oscuridad. El reactivo de Ellman se prepara diluyendo cinco veces la solución de stock
DTNB en búfer tris-acetato de 100 mM.
Estándar de Tiol: Preparar una solución de stock de1 mM disolviendo 3 mg de GSH en

10 mL de 0.1 N HCl. Estable durante 1 semana en la oscuridad a 4°C. Prepare una
solución estándar de 25 μM diluyendo 0.25 ml del stock GSH en 10 ml de tampón Tris-
acetato. Prepárense todos los días.
9.7.2 Procedimiento
Los tejidos se homogeneizan utilizando un mortero de tejido de teflón en tris-acetato de 10
mM, pH 7.4, que contiene un inhibidor de la proteasa (10 μg/mL apoprotinina), 140 mM
NaCl y 1 mM EDTA. Cualquier otro búfer de homogeneización podría ser utilizado. El tejido
se homogeneiza usando un triturador de tejidos con mortero de teflón (cuatro a seis
pasadas) sobre hielo y se pondera 1 ml del homogeneizado. El homogeneizado se
centrifuga a 12,000 x g durante 20 minutos a 2-4°C. El sobrenadante (S12) se elimina con
una pipeta y la capa lipídica superior desechada. La fracción S12 podría almacenarse a
85°C.
En una microplaca clara de 96 pozos, mezcle 50 μL de extracto de tejido (S12) con 100
μL de acetiltiocolina de 1 mM y 100 μL del reactivo de Ellman. Incubar a 30°C para 0, 5, 10,
20 y 40 min y medir la absorbancia a 412 nm en cada momento. El espacio en blanco es t
- 0 min o la fracción S12 de la que no se agregó acetiltiocolina (reemplazado por 100 μL
buffer). La calibración se logra mediante la preparación de un estándar de tiol de 25 μM en
volumen total de250 μL. El espacio en blanco analítico es el Tampón de tris-acetato.

El aumento de la absorbancia por la reacción entre el reactivo y la tiocolina del Ellman se
mide dentro de la porción lineal en el tiempo de la siguiente manera:
[(A412muestra − A412 en blanco)20 min − (A412 muestra − A412 en blanco)0 𝑚𝑖𝑛]
1 25 𝑛𝑚𝑜𝑙
min 𝑥 ( ) nmol de tiocolina formada 250
20 𝑚𝐿
X (A412 estándar− = 𝑥 factor de dilución ( 50 )
A412 en blanco) (min x mL)
Este valor se normaliza con el total de proteínas en el S12 (mg/ml) o el peso

homogeneizado para dar nmol tiocolina formada/ (min x mg proteínas o g).
Luego este valor se normaliza frente a las proteínas totales en el S12 (mg/mL) o
homogeneizar en el peso para dar nmol de tiocolina formada/(mín 3mg de proteínas o g).
50
9.8 ANÁLISIS DE ESTEROIDES POR CROMATOGRAFÍA DE CAPA DELGADA DE ALTO RENDIMIENTO

La capacidad de los homogeneizados de gónada para producir esteroides sexuales
(testosterona y estradiol-17β) podría determinarse mediante el uso de cromatografía de
capa delgada de alto rendimiento (HP-TLC). Este enfoque podría reemplazar la evaluación
de inmunoensayos esteroides como se muestra anteriormente, Aunque es menos sensible
y podría utilizarse para determinar los niveles totales de colesterol en extractos de tejido.
HP-TLC tiene mayor sensibilidad y es más agradable a la cuantificación porque los picos
son compactos (forma una línea delgada) y no manchados (manchas) como con la
cromatografía normal de capa delgada. Este ensayo también podría utilizarse para medir
la producción de esteroides en tejidos gónada responsables de la esteroidogénesis.
Extractos de homogeneización de Gónada se exponen in vitro a testosterona o
progesterona y NADPH donde la formación de estradiol-17β o testosterona podría ser,
respectivamente, seguido por el análisis de imágenes HP-TLC. Esta técnica también podría
utilizarse para determinar la presencia de otros compuestos como coprostanol (productos
reducidos de ácidos biliares por microflora intestinal, un marcador de contaminación de la
materia fecal), nonilfenol, y análisis general de esteroides en varios organismos. El ensayo
para estradiol-17β biogénesis en la gónada enriquecida con testosterona se presenta como
un marcador de la actividad aromatasa.
9.8.1 Reactivos
Búfer de homogeneización: Prepare 125 mM NaCl, 10 mM KH2PO4, pH 7.4, 1 mM EDTA,
y 1 mM ditiotreitol. Estable durante 4 semanas a 4°C.
Búfer de ensayo: Preparar 100 μM testosterona (o progesterona para la producción de
testosterona) y 0,1 mM reducido NADPH en 10 mM KH2PO4, pH 7.4, que contiene 125
mM NaCl y 1 mM NaHCO3.
HCl: Preparar 1 M de concentrado (8 M) en agua: 1.2 ml de HCL concentrado en agua
de 10 ml (campana de humo, usar ropa protectora, guantes y gafas).
Placa HP-TLC: HP-TLC a base de sílice para máxima resolución y sensibilidad (Sigma
Chemical Company o Merck) que mide 8 x 10 cm.
Resolución de disolvente: Preparar 60% hexano y 40% acetato de etilo en una campana
de humo.
Spray de fosfomolibdato: 1-10% fosfomolibdato en etanol 100%.
9.8.2 Procedimiento
Los tejidos gónada se recogen y ponderan y una porción se mantiene a un lado para el
análisis histológico (identificación sexual y estado de maduración gónada). La gónada se
51
mole usando una trituradora de tejido pestle de teflón en 5 volúmenes de amortiguador de

homogeneización helada. El homogeneizado se ahorra a 12,000 x g durante 30 minutos a
2°C. El sobrenadante (S12) se mantiene en hielo.
La fracción S12 se agrega a 5 volúmenes de búfer de ensayo y se permite incubar durante
0, 60 y 120 min a 25°C. La reacción se detiene por la adición de 0.2 volumen de HCl 1 M y
se coloca en hielo durante 30 minutos para permitir la hidrólisis de cualquier esteroide
conjugado(s). Se añaden dos volúmenes de acetato de etilo a la mezcla de reacción y se
mezclan y centrifugan brevemente a 3000 x g durante 2 minutos para separar la fase. A
continuación, se elimina y evapora la fase de acetato de etilo bajo corriente de nitrógeno.
El material se suspende en 50-100 μL acetato de etilo y se detecta 5 x 10 μL (aire seco
entre aplicaciones) en la placa HP-TLC. A continuación, las placas se colocan en cámaras
que contienen 15 ml de disolvente resolución. Después de la migración del disolvente
durante al menos el 80% de la altura de la placa, las placas se retiran y se secan en una
campana de humo. A continuación, las placas se rocían con spray de fosfomolibdato y se
secan a 80100C en un horno. Si no hay horno disponible, se podría utilizar un secador de
aire portátil. Los puntos (Figura9.3) se escanean con un escáner convencional y la
intensidad de las bandas analizadas por el software de análisis de imágenes (Naciones
Unidas – Análisis de gel Scan-It). Otro medio de cuantificación consiste en raspar el polvo
de sílice de la banda manchada y eluyendo con etanol y medir la densidad óptica a 660810
nm (pico de absorción de complejo de fosfomolibdato reducido).
Coprostanol
colesterol
progesterona
testosterona
Estradiol-17β
estriol
Gónada T0 60min 120min muestra (Testosterona añadida)
Figura 9.3 Representación de un cromatograma HP-TLC para la producción de esteroides sexuales.
52
Para la calibración, soluciones estándar de testosterona, colesterol, progesterona, y

17β-estradiol a 100 μM concentración en etanol se incluyen en un carril separado, ya sea
juntos o en diferentes carriles al principio para validar una buena separación entre ellos.
Las densidades de banda se toman para la calibración.

La intensidad de la banda se determina y se compara con una solución estándar de
estradiol-17β y testosterona y se resuelve en las placas HP-TLC. Las cantidades en
nanogramos de estradiol-17β se convierten en concentraciones dividiendo con el volumen
aplicado (50 μL) para dar la concentración ng estradiol -17β/mL. A continuación, la
concentración se normaliza frente al contenido total de proteínas del Fracción S12 o la
densidad del tejido (g / mL) para dar proteínas ng / mg o tejidos ng/g.
9.9 EVALUACIÓN DE GLUTAMATO Y γ-AMINOBUTIRATO

El γ-aminobutirato (GABA) es un transmisor neuroinhibidor que involucra a dos tipos de
receptores, GABA1 y GABA2, que son ionotrópicos y metabotrópicos receptores para la
acción. La última forma requiere la transducción de señales (acoplada a la proteína G). Se
produce a partir del glutamato, que se considera, a la inversa, un neurotransmisor
neuroexcitador. GABA se produce a partir de la descarboxilación. de glutamato catalizado
por glutamato descarboxilasa:
L-glutamato + piridoxal 5-fosfato→GABA + CO2
GABA + α-ketoglutaato para formar semi-aldehído de sucinto y glutamato en presencia
de gaba transaminasa:
GABA + α-ketoglutaato→succinato semi-aldehído + Glutamato
El semi-aldehído de sucinto reacciona, a su vez, con NADP + en presencia de semi-
aldehído deshidrogenasa de sucinto para producir sucinto + NADPH.
Succinato semi-aldehído + NADP+-sucinto + NADPH (fluorescente)
Por lo tanto, un ensayo acoplado basado en enzimas se muestra para medir los
niveles de GABA y glutamato como con la actividad de descarboxilasa gaba.
9.9.1 Determinación de la actividad de glutamato descarboxilasa

Glutamato decarboxilasa es la enzima responsable de la conversión de glutamato en
GABA, que es un neurotransmisor inhibitorio. El ensayo se basa en la reacción multi-
enzimática que implica GABA transaminasa y succinato semi-aldehído deshidrogenasa.
53
9.9.1.1 Reactivos
Tampón de fosfato sódico (1 L): Preparar 0,1 M NaH2PO4 y ajustar el pH a 7 con NaOH.
Solución de material de glutamato: Preparar glutamato de 0.5 M en 1 M NaOH: 0.7 g de
ácido glutámico en 10 ml de NaOH 1 M (puede requerir algo de calentamiento a 4050C
durante 5 min).
Stock AET 10 x: Preparar solución de 10 mM de bromuro de 2- aminoetillisothironium
(AET) en 0.1 M KH2PO4, pH 7 (tampón de fosfato de sodio).
Stock piridoxal 5-fosfato (PP; 50 x): Preparar 1 solución mM (100 ml) en tampón de
fosfato sódico: 25 mg en 100 ml. Estable durante 1 mes cuando se mantiene en 4C en
la oscuridad.
Búfer de ensayo: Preparar 5 ml de AET (10 x), 1 mL PP (50 x), 0.05 g Tritón X-100 y
completar a 50 ml con 0.1 M de tampón de fosfato sódico.
Sustrato GAD: Añadir 10 ml de glutamato 500 mM a 25 ml de PP. Añadir 0.1 g de
ditiotreitol y completar a 100 mL con 0.1 M tampón de fosfato sódico.
9.9.1.2 Procedimiento
Preparar siete tubos denotado Rx, T0, T15, T30, T45, T60, y GABA endógeno. Precalentar
2 baños de agua: uno a 30°C y el otro a 90°C.
Diluir la fracción S12 12 en el búfer de ensayo en el tubo Rx— 60 μL de S12 y 60 μL de
búfer de ensayo.
Comience la reacción añadiendo 120 μL de sustrato GAD. Incubar a 30°C para 0, 15,
30, 45 y 60 min. En cada momento, transfiera 40 μL de la mezcla de reacción en el tubo
correspondiente y agregue 20 μL de 0,2 N HCl. Calentar por 5 a 100°C para destruir NADPH
endógeno. Mantener en 280°C para el ensayo gaba (ver más abajo).
9.9.2 Determinación de GABA endógeno

En los tubos de microcentrífuga, mezcle 20 μL de S12 con 20 μL de tampón de fosfato
sódico y 20 μL de 0.3 N HCl. Calentar 5 min a 90-100C para eliminar NADPH endógeno.
Mantener en -80°C para el ensayo GABA.
Nota: Los niveles de glutamato endógeno podrían determinarse ejecutando el ensayo

sin la adición de glutamato durante 60 minutos para convertir el glutamato endógeno en
GABA. Sin embargo, el glutamato podría formarse a partir de αendógeno-ketoglutaato por
α-ketoglutaato deshidrogenasa en presencia de NADH. Si gaba descarboxilasa es
54
(comercialmente disponible) añadido entonces la fracción S12 podría ser pinchado por la
enzima en exceso para forzar la conversión completa de glutamato en GABA.
9.9.3 Detección de GABA

El ensayo se basa en la reacción de GABA con α-ketoglutaato que conduce a la formación
de semialdehído de sucinto y glutamato (GABA transaminasa o GABase). El semialdehído
de sucinto se oxida con NADP para formar sucinto y NADPH, que se detecta por
fluorescencia.
9.9.3.1 Reactivos
1. Búfer de ensayo: Prepare 300 mM Tris-HCl en pH 8.4 (1 L).
2. Solución de α-Ketoglutaato: Preparar 100 mM en agua SQ (10 mL).
3. GABA transaminasa/succinato semi-aldehído deshidrogenasa: Diluir el polvo
comercial de stock GABase (incluye semi-aldehído deshidrogenasa de sucinto) a 3.35
U/mL (5 mg/ml) en búfer de ensayo ajustado con el pH reajustado a 7.4 con HCl.
Prepare 100 μL alícuotas y guárdelos durante 1 mes a -20°C.
4. Stock Ditiotreitol: Preparar solución de 100 mM en agua SQ (5 ml).
5. Stock NADP+: Preparar solución de 25 mM en agua SQ (10 mL). Prepare 10 μL
alícuotas y guárdelos durante 1 mes a -20°C.
6. Gaba de stock: Preparar una solución de 10 mL 25 mM en el búfer de ensayo (A).
9.9.3.2 Procedimiento
Preparar diariamente la mezcla de detección (10 ml) mezclando 8.7 ml de solución A, 1 ml

de solución B, 0.1 ml de solución D y 0.2 ml de solución E. Mezclar bien y eliminar 1 ml
para los espacios en blanco (sin enzima). Precaliente el rango de muestra del lector de
microplacas a 30°C si está disponible.
En un tubo de 15 ml, mezclar 8.83 ml de la solución anterior y añadir 270 μL de solución
C. Condiciones finales: Tris-HCl de 300 mM, pH 8.4, 10 mM α- cetoglutarato, 1 mM
Ditiotreitol, 0.5 mM NADP+, 100 mU/mLBase.
En una microplaca transparente, añadir 10 μL de muestra (GABA formado y gaba

endógeno), en blanco, y estándar (0.1 mM GABA para dar 100 nmol / mL concentración
final). Comience la reacción añadiendo 150 μL de la mezcla de detección y leer la
fluorescencia (formación de NADPH) a 350 nm de excitación y 450 nm de emisión a 0 y 20
55
min. Si se sospechan efectos de matriz en la muestra, el estándar se eleva a la muestra

para proporcionar un estándar interno.
9.9.3.3 Análisis de datos

La actividad enzimática está determinada por la siguiente relación:
Fluorescencia NADPH (Muestra en blanco) x (20 nmol/mL GABA/
Fluorescencia NADPH (estándar – blanco) x 1/tiempo de incubación
x factor de dilución (160/10 x 60/40 x 240/60) = nmol GABA formado/min/mL:
La actividad se normaliza contra el total de proteínas en la fracción S12 o el peso
homogeneizado para dar nmol GABA / min / mg proteínas o g tejidos.
REFERENCIA
[1] Gagné F, Blaise C. Efectos de los efluentes municipales sobre los niveles de serotonina y
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Traduccion-Bioquímica - Capitulo 2-9

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FACULTAD DE

Semana 5: Traducción del capítulo 2 y 9

FERNANDO CAMILO JOAQUIN RODRIGUEZ

Cajamarca, junio de 2021

Esquema del capítulo

2.1Tipos de tampones de homogeneización 22

la actividad proteasa/ribonucleasa para que se brinde especial cuidado trabajando a bajas

2.1 TIPOS DE BÚFERES DE HOMOGENEIZACIÓN

Table 2.1 Lista de tampones de uso común en la investigación bioquímica

Tris Tris-(hidroximetil) 8.06 at 25C 7.069-06

MOPS Ácido propanesulfónico 3-(N- 7.2 6.2-8.2

2.1.2 Queladores de iones

2.1.5 Inhibidores de DNase/RNase

el yodoacetato (10 mM). La eficacia de cada uno de ellos dependerá de la naturaleza de

2.1.7 Agentes crioprotectores

2.2 MÉTODOS DE HOMOGENEIZACIÓN

2.2.1 Mortero de tejido del teflón

Figure 2.1 Un triturador de tejidos con mortero de teflón.

Este método es conveniente para los tamaños relativamente pequeños de tejidos

Figure 2.2 Molinillo de tejido a base de polítrones.

2.2.5 Fraccionamiento Subcelular por Centrifugación Diferencial

Bolita (núcleos, sobrenadante

Pelotilla (mitocondrias, Sobrenadante (vesículas de

15–20000 x g 20–30 min 2–4°C

Pelotilla (vesículas sobrenadante

Figure 2.3 Esquema General de centrifugación para el aislamiento de fracciones intracelulares.

dependiendo del tipo de tejido o especies de prueba bajo investigación. El homogeneizado

Table 2.2 Enzimas marcadoras para los orgánulos principales

2.2.6 Conservación de muestras biológicas para biomarcadores

2. Padh H. Organelle aislamiento y ensayo de enzimas marcadoras. En: Goldman CA,

9.8.3 Análisis de datos 166

La presencia de sustancias químicas que pueden interrumpir los sistemas de señalización

9.1 EVALUACIÓN DE VITELLOGENINA COMO MARCADOR DE ESTROGENICIDAD

Estándar de fosfato: Disolver 1.74 g de fosfato monobásico de potasio en 100 ml de

Reactivo de molibdato: Disolver 1 g de molibdato de amonio (Sigma A7302) en 100 ml

Los fosfatos inorgánicos liberados se determinan a continuación mediante un ensayo

microplaca transparente, 20 μL del espacio en blanco (solo NaOH), estándar (20 μL de

9.1.3 Cálculo de datos

Y μg/mL/g peso del tejido/ml o mg/proteína mL

= Z μg fosfato/g o Z μg fosfatos/mg proteínas)

mostraban la banda de proteína de alto peso molecular femenino especifico después de

9.2 ESTRADIOL-17β O SITIOS DE UNIÓN DE ESTEROIDES

La aparición de estradiol-17β sitios de unión podría determinarse por el potencial de

Búfer de aislamiento del receptor: 10 mM HEPES, pH 7.4, que contiene 50 mM NaCl,

9.2.3 Cálculo de datos

9.3 ENSAYO FLUOROMÉTRICO PARA CATECOLAMINAS E INDOLAMINAS

Catecolaminas (dopamina y adrenalina) e indolaminas (serotonina) pueden ser

Búfer de homogeneización: Los tejidos se homogeneizan en cualquier amortiguador

Diluir 1/100 el día del análisis mezclando 20 μL en 2 ml de agua.

Estándares: Preparar por separado una solución de 5 μmol/ml (5 mM) de serotonina,

Solución NaHCO3: Preparar una concentración de NaHCO3 de 100 mM en agua, ajustar

9.3.2 Extracción de aminas biogénicas

En los tubos microcentrífugados duplicados, agregue 100 μL de GSH R a 250 μL de

Se podría realizar un paso de preconcentración facultativo si las aminas biogénicas

9.3.3 Determinación de indolaminas (Serotonina)

En una microplaca oscura para lecturas de fluorescencia, pipeta 25-100 μL de la fase

9.3.4 Determinación de 5-HIAA

En un tubo de microcentrífuga, mezcle 200 μL de la fase superior de hexano con 100 μL

9.3.5 Determinación de adrenalina y dopamina

En un tubo de microcentrífuga, retire 100 μL de la fase acuosa y agregue 390 μL de agua

9.3.6 Cálculo de datos

9.4 ENSAYOS INMUNOLÓGICOS COMPETITIVOS PARA LA DOPAMINA Y LA

presente en la muestra de prueba [13]. El ensayo competitivo se basa en el siguiente