“Año de la universalización de la salud”

CURSO:
BIOQUIMICA GENERAL

DOCENTE:
MARÍA LUISA SOCORRO SOLANO TIMOTEO

CICLO:
III
TEMA:
PRÁCTICA N°4 HEMOGLOBINA
ESTUDIANTES:

 CONDOR ESTRADA, JOEL

 CABALLERO ESCOBAR, JOSE
 GABINO MORALES, PAOLA
INTRODUCCION
 MARTIN CHUMPITAZ, JORDAN
 ROCHA QUEVEDO, CRISTINA
 LABORATORIO DE BIOQUIMICA
PRACTICA N°04
HEMOGLOBINA

INTRODUCCION
La determinación de la hemoglobina en sangre es fundamental para el diagnóstico de las anemias y
policitemia, y es uno de los análisis que se practica con más frecuencia en el laboratorio clínico. Sin
embargo, esta determinación, tan sencilla en su procedimiento, está sujeta a una serie de variables,
las cuales de no tomarse en cuenta, afectan en forma considerable los resultados obtenidos.
Las dos principales funciones de la hemoglobina son el transporte de oxígeno y amortiguador del
pH. Las concentraciones de hemoglobina están influidas por variaciones fisiológicas como la edad,
sexo, deshidratación, postura y altitud, y por procesos patológicos. Se encuentran valores
patológicos en anemias y en policitemias.
Existen varios métodos para su determinación, los más utilizados se fundamentan en la capacidad
para absorber luz de la hemoglobina o alguno de sus derivados, como la oxihemoglobina o la
cianmetahemoglobina.
La hemoglobina es oxidada por la acción del ferrocianuro a metahemoglobina y mediante el cianuro
se convierte en cian metahemoglobina.

MARCO TEORICO:
La hemoglobina, proteína compleja, formada por el grupo hemo y la globina. Una molécula de
hemoglobina (masa molecular de 64 000 g/mol (64 kDa), está constituida por cuatro cadenas
globina y cuatro núcleos de hemo donde se encuentra el hierro (Fe 2+) quien a través de su valencia 6
está unido a 4 Nitrógenos de la estructura porfirínica (4 pirroles), una quinta valencia al nitrógeno
de la histidina proximal de la globina y la sexta valencia al oxígeno molecular o a la histidina distal.
La Hemoglobina totalmente saturada contiene alrededor de 1,34ml de oxígeno por gramo. La masa
de eritrocitos de un adulto contiene 600g de hemoglobina, capaz de transportar 800ml de oxígeno.
En los capilares pulmonares existe una presión de oxígeno de 100mmHg, y el 95 ‐ 98% de la
hemoglobina se combina con el oxígeno. En los tejidos, la presión parcial del oxígeno desciende
hasta 20mmHg, de forma que el oxígeno unido a la hemoglobina se disocia fácilmente de ella para
poder ser utilizado por las células tisulares.
La curva de enlace de la hemoglobina con el oxígeno es sigmoidea. Esta forma de curva indica que
la unión de un primer O2 favorece o aumenta la probabilidad de que se enlace otro O 2 a un sitio de
enlace vacío y así hasta completar los 4 monómeros, ese mismo efecto sería cuando se libere el O 2.
A este comportamiento o efecto de cooperativita.
La hemoglobina y la mioglobina son hemoproteínas cuya importancia fisiológica se relaciona
principalmente con su capacidad de unirse al oxígeno molecular. La hemoglobina del adulto es una
hemoproteína tetramétrica [α(2):β(2)] que se encuentra en los eritrocitos, donde es la responsable de
unirse al oxígeno en los pulmones y de transportar el oxígeno al cuerpo donde es utilizado en los
mecanismos metabólicos aeróbicos. La hemoglobina (Hb) es una proteína globular, que está
presente en altas concentraciones en lo glóbulos rojos y se encarga del transporte de O2 del aparato
respiratorio hacia los tejidos periféricos; y del transporte de CO2 y protones (H+ ) de los tejidos
periféricos hasta los pulmones para ser excretados. Los valores normales en sangre son de 13 – 18
g/ dl en el hombre y 12 – 16 g/ dl en la mujer.
En cada eritrocito (hematíes) se encuentran cientos de moléculas de Hb, bajo la forma y
porcentaje de:
 97% por la denominada hemoglobina A1 formada por dos cadenas alfa y dos cadenas beta (alfa
2 beta 2)
 2% está formada por la hemoglobina A2 (alfa 2 delta 2)
 1% de hemoglobina F (alfa 2 gamma 2). 

Complejos de la Hemoglobina:
El grupo hemo se une a otras moléculas como el O2, CO2; NO, S y reciben el nombre de:

 Oxihemoglobina (HbO2)

 Carbaminohemoglobina o carbohemoglobina (HbCO2)

 Metahemoglobiba (MetHb), cuando el Fe está como ión férrico (Fe 3+)

 Sulfohemoglobina (SHb), cuando la hemoglobina oxidada reacciona con sulfuro de hidrógeno.

 Carboxihemoglonina (HbCO). La hemoglobina tiene mayor afinidad por el monóxido de

carbono

Métodos para determinar Hemoglobina:

 Fotométricos o colorimétricos.

 Gasométricos.

 Químicos.

 Densito métricos
En la práctica se hará por espectrofotometría con el método del cianuro de hemoglobina (HiCN),
con el reactivo de Drabkin que contiene K3Fe(CN)6 + KCN + medio alcalino.
La hemoglobina se oxida a metahemoglobina la cual a su vez pasa a cian
metahemoglobina. La intensidad de color de este compuesto se mide por espectrofotometría a
540nm.
MATERIALES
1. Equipos

 Espectrofotómetro

2. Materiales

 Tubos de ensayo
 Gradilla
 Cubetas
 Gradilla
 Micropipeta

3. Reactivos

 Reactivo de Drabkin
 Sangre(Hemoglobina)

PROCEDIMIENTO N°2:
PROCEDIMIENTO DEL ESPECTRO DE ABSORCIÓN DE LA HEMOGLOBINA

1. Utilizando agua y la disolución de hemoglobina, prepara distintas diluciones y analiza su

espectro UV-VIS completo.

2. Para ello, llenamos una cubeta con hemoglobina y en las otras dos cubetas preparamos
sendas mezclas diferentes de hemoglobina con agua. Todas las cubetas deben tener un
volumen total de 3 mℓ.

Cubeta N°1 N°2 N°3

Volumen de Hb 1ml 2ml 3ml

Volumen de Agua 2ml 1ml 0ml

3. A continuación, introducimos al espectrofotómetro las cubetas, de una en una, y pulsa el
botón para registrar el espectro entre 200 y 800 nm

TUBO 1

TUBO 2

TUBO 3
 TUBO 3
ANALIZIS CUALITATIVO DE RESULTADOS

Compara los 3 espectros. ¿Qué efecto se observa al diluir la hemoglobina de partida?

¿Cambia la posición (λ) de los picos de absorción máxima? Describe lo que observas
Al bajar la concentración de hemoglobina aumentando cantidades de agua, se observa que la
composición de los picos de absorbancia máxima, se mantiene registrado en los 400 nm, pero el
tamaño se reduce considerablemente mientras menos sea la cantidad de hemoglobina usada. De
manera numérica, se tiene una absorbancia sobre el 1.5 en la primera cubeta, en la segunda cubeta
la absorbancia esta sobre 1 y en la tercera sobre 0.5 Lo que indica que la menor concentración,
menor absorbancia.

2ª MEDIDA

Observando el espectro, anota dos longitudes de onda (de la región visible, no

ultravioleta) en las que haya un pico (un máximo local de absorción). A continuación,
mide y anota la absorbancia de las 3 cubetas a cada una de esas dos longitudes de
onda. Representa tus resultados en una gráfica, considerando que la concentración de
partida de hemoglobina (en la botella) es de 200 mg/ℓ.

Cubeta C (mg/l) A400 A420

1 55.9 0.215 0.434

 2 128.5 0.494 0.935
3 200 0.769 1.426

GRAFICO A400

GRAFICO A420

ANALISIS CUANTITATIVO DE LOS RESULTADOS

 ¿Cómo puedes describir las conclusiones de lo observado? ¿Cuál de las longitudes de

onda sería útil para determinar la concentración de muestras problema de hemoglobina?
Basándonos en el valor de r2 que indica la linealidad de las rectas, se escoge el de valor cercano a 1,
ya que indica una menor dispersión de los datos, es decir mayor precisión. Por lo tanto, ambas
longitudes de onda A400 y A420 serían buena opción.
 PROCEDIMIENTO N°3
ESPECTRO DE ABSORCIÓN DE LAS DIVERSAS FORMAS REDOX DE LA
HEMOGLOBINA
Ensayo:

- Se trata de comparar el espectro de absorción en la región de luz visible entre las diversas
formas de la hemoglobina.

- Añade a cada una de las cubetas 3 mℓ de una de las muestras: desoxihemoglobina,

oxihemoglobina, metahemoglobina, carboxihemoglobina o cian metahemoglobina.

- Introduce cada una en el espectrofotómetro y registra su espectro, guardando la imagen

obtenida al pulsar foto. Anota las longitudes de onda de los máximos de absorción de cada
muestra:

CUBETA 1 2 3 4 5
TIPO DE HEMGLOBINA DesoxiHb OxiHb MetaHb CarboxiH CianmetaHb
b
λ MÁXIMOS DE 555 575 - 340-570 540
ABSORCIÓN

- Seguidamente lo introducimos al espectrofotómetro las 5 cubetas.

1 - DesoxiHb
 3 - MetaHb

2 - OxiHb

4- CarboxiHb

5- CianmetaHb

INTERPRETACIÓN:

 Las distintas hemoglobinas tienen espectros de absorción características que se

determina en un espectrofotómetro. La identificación de las diferentes formas de la
hemoglobina con la determinación de sus espectros de absorción puede realizarse de
una manera muy sencilla.
 PROCEDIMIENTO N°2:
PRIMERO SE PREPARA EL REACTIVO DE DRABKIN

El reactivo de Drabkin que produce la conversión tiene la siguiente composición:

 Ferrocianuro potásico 200 mg

 Cianuro potásico 50 mg
 Bicarbonato potásico 1 g
 Agua destilada qsp 1 l.
 Estable durante un mes a 4 °C y en oscuridad.

Preparar la muestra de hemoglobina

 Ahora procederemos preparar la muestra de hemoglobina

 El reactivo de Drankbin en ambos tubos en una medida de 5ml y colocamos en la rejilla
 Cogemos la sangre a la medida de 0.02ml y lo echamos en el tubo

 Ponemos el Parafilm en los tubos mesclamos y dejamos y dejamos incurara 10min a Ret

 El estándar se lee directamente sin mesclar con reactivos

 Echamos los reactivos en las cubetas de colorimetría

 Leemos en el Espectrofotómetro a 540 nm

  Por último realizamos los cálculos

Formula:

DO PR Hb
x 20=g
DO ST dl

RESULTADOS

CUESTIONARIO
Oxihemoglobina (HbO2) o la anemia por deficiencia de hierro es un tipo frecuente de anemia,
trastorno en el cual la sangre no tiene la cantidad suficiente de glóbulos rojos sanos. Los glóbulos
rojos transportan oxígeno a los tejidos del cuerpo. En general, la anemia por deficiencia de hierro se
puede corregir con suplementos de hierro. A veces es necesario realizar pruebas o tratamientos
adicionales para la anemia por deficiencia de hierro, especialmente, si el médico sospecha que
puede haber sangrado interno
Carboxihemoglonina (HbCO)La toxicidad de este gas es debida a la alta afinidad de la hemoglobina
(Hb) por el CO, formando la carboxihemoglobina (COHb), incapaz de transportar O2 y
produciendo hipoxia tisular3. Los niveles de COHb dependen de múltiples factores, incluida la
magnitud de la exposición, el grado de ventilación alveolar, el volumen sanguíneo y la actividad
metabólica. Un nivel de COHb superior al 3% en los no fumadores o superior al 10% en los
fumadores confirma la exposición4.
Diagnóstico

 Análisis de sangre
 Electroforesis de hemoglobina
Tratamiento

 En ocasiones, transfusiones de sangre

 El tratamiento varía según los síntomas y su gravedad. En algunos de los casos no es
necesario el tratamiento.
 Las personas afectadas por enfermedad de la hemoglobina C pueden requerir en algún caso
transfusiones de sangre.
 Cuando se necesita tratamiento para la enfermedad de la hemoglobina S-C, éste es similar
al de la anemia de células falciformes.
 La mayoría de las personas afectadas por enfermedad de la hemoglobina E no requieren
tratamiento. Sin embargo, las personas con una forma grave de la enfermedad pueden
necesitar transfusiones sanguíneas regulares o la extirpación del bazo.
2. ¿Por qué el color de las carnes de vacuno vistos en los mercados de venta cambia de color con el
tiempo?
La mioglobina, es la proteína responsable del color rojo. La mioglobina no circula en la sangre pero
se fija en las células del tejido y es púrpura en color. Cuando se mezcla con oxígeno, se convierte en
oximioglobina y produce un color brillante. El color restante proviene de la hemoglobina, la cual se
encuentra principalmente en la sangre que circula.
3. Busque datos actualizado (últimos 5 años) sobre la evolución del estado de anemia en niños y en
mujeres en el Perú
CONCLUSIONES
• Concluimos después de realizar la práctica que la hemoglobina es una proteína muy
importante ya que se encarga de llevar el oxígeno desde la atmosfera a los tejidos y de igual forma
recoger el anhídrido carbónico desde los tejidos para llevarlos a los pulmones.
• Al analizar los espectros de absorción de biomoléculas de la hemoglobina en un rango de
luz visible. Las regiones más importantes del espectro, para la bioquímica, son el ultravioleta que
se encuentra en el rango de 180-350 nm y el visible, entre 350-800 nm.

BIBLIOGRAFÍA:

 FACULTAD DE CIENCIAS MEDICAS -UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE

GUATEMALA. (2017, octubre). Determinación de hemoglobina (N.o 8). Baynes.
https://bioquimica11usac.files.wordpress.com/2012/10/lab_8_manual_2017.pdf

 INSTITUTO NACIONAL DE SALUD, & Jordán Lechuga, T. (2013, marzo).

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE LA HEMOGLOBINA MEDIANTE
HEMOGLOBINÓMETRO PORTÁTIL (N.o 1). Centro de Información y Documentación
Científica del INS.
https://web.ins.gob.pe/sites/default/files/Archivos/cenan/van/tecnica_vigilancia_nutricional/bio
quimica/Determinaci%C3%B3n_hemoglobina_mediante_hemoglobin
%C3%B3metro_portatil.pdf

 8miri28. (2012, 9 febrero). Determinación de Hb en sangre [Vídeo]. YouTube.

https://www.youtube.com/watch?app=desktop&v=hWdAventAAc