Capitulo 5

5.1.
Introducción
5.2. Electroforesis de zona. Equipo
electroforético
5.3. Factores que afectan a la
electroforesis
5.4. Electroforesis en soportes no
ELECTROFORESIS restrictivos
5.5. lnmunoelectroforesis
5.6. Electroforesis en geles
de poliacrilamida
5.7. Electroenfoque
5.8. Electroforesis bidimensional
5.9. Electroforesis de ácidos nucleicos
5.1 0. Electroforesis capilar
2 12 Técnicas instrumentales d e análisis en Bioquimica
5.1. Introducción
La electroforesis es un transporte bajo la acción de un campo eléctrico. Admiti-

ría, por tanto, un tratamiento similar al de la sedimentación, también un transporte,
salvo que el campo aplicado es eléctrico en lugar de centrífugo. Sin embargo, no
hay un tratamiento teórico tan satisfactorio que describa el comportamiento de las
moléculas en un campo eléctrico. Esto se debe a varias razones, pero la primaria es
que toda molécula sometida a la acción de un campo centrífugo sedimentará (el
coeficiente de sedimentación, S, no puede ser nulo), pero no se desplaza cualquier
molécula sometida a un campo eléctrico, sólo responden aquellas que posean carga
eléctrica. El parámetro que determina el comportamiento de una molécula en un
campo eléctrico es la movilidad electroforética, U, que se define, de modo similar a
S,como la velocidad de migración por unidad de campo (E, en voltios por cm):
Se trata de un parámetro con menor trascendencia que la que tenía S en la centrifu-

gación, pues no hay una relación clara entre U y otros parámetros moleculares. U
depende de la carga, de la forma y del tamaño de las moléculas, pero no de un
modo que se pueda formalizar de una manera sencilla. Por ejemplo, la carga de las
moléculas no es fácilmente evaluable, pues depende del medio (pH, fuerza iónica).
Además, en disolución, las moléculas están rodeadas de un conjunto de iones que
constituyen su esfera de solvatación, y bajo la acción del campo eléctrico, se despla-
za el conjunto, siendo atraida la esfera de solvatación hacia el polo opuesto que la
molécula. No obstante, la ausencia de un tratamiento teórico adecuado no ha impe-
dido el gran uso de la electroforesis en Bioquímica.
O
electrodos
v.- - - - - - - -
-.-------,
O
FIGURA 5.1. En la parte izquierda se muestra un diagrama de una electroforesis libre. Las moléculas cargadas
migran hacia los electrodos, no bien separadas por tratarse de una disolución. Las dos imágenes de la derecha
corresponden a una electroforesis de zona sobre un soporte. Los componentes de la muestra, 1 , 2 y 3, depositados
en una pequeña zona (rectángulo negro), migran según su carga eléctrica. En la imagen de la derecha, los tres com-
ponentes aparecen ya separados (rectángulos sombreados) al finalizar la electroforesis (el rectángulo en trazo dis-
continuo indica la posición original de la muestra).
Capítulo 5: Electroforesis 213
La electroforesis se puede desarrollar de dos maneras (Figura 5.1). E n la llama-

da electroforesis libre, el campo eléctrico se aplica a disoluciones o suspensiones.
Aunque históricamente esta modalidad es el origen de la electroforesis, desarrolla-
da por Arne Tiselius a partir de 1937 (y por lo que recibió el Premio Nobel en
1948), actualmente está en desuso. Su principal problema es que el medio en el que
se desarrolla es un fluido, por lo que es poco resolutiva al incidir mucho la difusión
y la convección. Por contra, la otra modalidad, la electroforesis de zona, es una de
las técnicas más utilizadas en Bioquímica por su gran resolución. Aquí el campo
eléctrico se aplica a un medio o soporte estabilizante, en vez de a un fluido, evitan-
do sus inconvenientes. La muestra se deposita en una reducida zona del soporte, lo
que da nombre a esta modalidad.
5.2. Electroforesis de zona. Equipo electroforético
Para llevar a cabo una separación electroforética zonal se necesitan los elemen-
tos mostrados en la Figura 5.2. Una fuente de tensión (o de alimentación) que pro-
porciona el campo eléctrico, mediante dos electrodos, positivo (ánodo) y negativo
(cátodo), entre los que se establece una diferencia de potencial. Una cubeta o reci-
piente en cuyos extremos se sitúan los electrodos. Un soporte electroforético (gel en
la Figura 5.2). Y, por último, el tampón de electroforesis.
El elemento fundamental es el soporte. Aunque todas las electroforesis respon-
den a un mismo principio, las de zona pueden ser de distintos tipos en función del
soporte que se utilice. E n todos los casos la muestra se dispone inicialmente ocu-
pando una pequeña zona del soporte, y posteriormente lo va recorriendo impulsa-
da por el campo eléctrico. Para que ésta situación sea estable, tanto al comienzo
como a lo largo del proceso de separación, es necesario contrarrestar el efecto de la
fuente de
alimentación
O
muestra
gel
I
* 1
I 1
,papel
cubeta
1 refrigerante 1 tampón
F IGURA 5.2. Equipo electroforético. La cubeta tiene en sus extremos los reservorios para el tampón de electroforesis.
En el centro se aloja el soporte (gel), con la muestra aplicada en su parte central. Por las tiras de papel laterales fluye
el tampón, por capilaridad, manteniendose así humedecido el soporte. El refrigerante disipa el calor generado por el
paso de la corriente eléctrica. La fuente de alimentación proporciona la diferencia de potencial entre los electrodos.
2 14 Técnicas instrumentales de análisis en Bioquímica
difusión y las posibles corrientes de convección. En la centrifugación zonal, que

sería el modo equivalente, la muestra se coloca sobre un gradiente de densidad
para evitar ambos fenómenos. En electroforesis zonal se utilizan reticulados mole-
culares (el soporte de la electroforesis), un entramado tridimensional que impide o
reduce la difusión y la convección. Este ha de ser compatible con los tampones
habitualmente empleados, permitiendo la entrada del agua en sus poros (reticula-
dos hidratables). El tamaño de éstos debe permitir el paso de moléculas volumino-
sas como los ácidos nucleicos y las proteínas. Además, el soporte no debe tener car-
gas que interfieran con la migración de las moléculas de la muestra.
Los distintos tipos de soportes se clasifican en dos grupos, según que el tamaño
del poro no oponga impedimento al paso de las moléculas (soportes no restrictivos:
Tipo o Grupo I) o sí lo haga (soportes restrictivos: Tipo o Grupo II).
Entre los del grupo 1, el agar es el ejemplo más representativo. Se trata de un
soporte que hay que preparar, algo común a la mayoría de los soportes electroforé-
ticos. El agar, en polvo, se añade sobre el tampón de la electroforesis, a 100 "C,
para que se disuelva. La mezcla caliente se deposita sobre un molde colocado sobre
un cristal (Figura 5.3). La disolución gelifica al enfriarse, momento en que puede
retirarse el molde. Las dimensiones y el grosor del soporte corresponderán a las del
molde y a la cantidad de disolución de agar utilizada. La placa de vidrio es un mero
soporte físico del gel de agar, cuyas propiedades se modulan a voluntad variando la
cantidad de agar. En concreto, lo más crítico, el tamaño del poro del reticulado
depende de la concentración empleada, que nunca se conoce con exactitud, pues
durante la preparación del gel hay pérdidas de agua.
1 molde
2
/ IA
agar
F I G U R A 5.3. Preparación de un gel

de agar. (1) El molde de plástico se
adhiere a una placa de vidrio, utili-
zando grasa. (2) La disolución de gel de agt
agar caliente se deposita sobre el
cristal
cristal. (3) Gelificado el agar, se
retira el molde, quedando el gel
preparado para la electroforesis.
Capítulo 5: Electroforesis 2 15
El agar se obtiene a partir de algas marinas y está formado por dos tipos de
polisacáridos, la agarosa y la agaropectina. Esta última posee varios grupos carga-
dos (grupos carboxilo y sulfato) que le hacen inadecuada como soporte electroforé-
tico por el efecto electroendosmótico que produce (apartado 5.3.4). La agarosa
(Figura 5.4) sin embargo se utiliza ampliamente, sobre todo para la separación de
ácidos nucleicos y para el análisis de proteínas plasmáticas. Los distintos tipos de
agarosas se caracterizan por su punto de fusión (35-95 "C), resistencia física y grado
de electroendósmosis (apartado 5.9.1).
También el papel pertenece a este grupo de soportes. El utilizado para electro-
foresis es de apariencia similar al papel de filtro, pero con mayor consistencia y con
un grosor y porosidad estrictamente controlado. Presenta la ventaja de que puede
cortarse con las dimensiones adecuadas, acomodándolo a la forma de las cubetas y
a las necesidades del análisis. Una variedad es el acetato de celulosa que se presen-
F I G U R A 5.4. (Parte A ) : estructura quí-

mica de la agarosa, polisacárido lineal
formado por la repetición de la estruc-
tura básica, agarobiosa, con una masa
molecular media de 120.000 dalton
(correspondiente a unas 400 unidades).
Según los distintos sustituyentes en R,
se modifican las características d e la
agarosa. (Parte B): en el gel las cadenas
lineales del polisacárido forman dobles
hélices que se unen longitudinalmente,
formando filamentos o fibras. Estas
contactan y se entrecruzan, dejando
entre sí espacios (poros) donde se aloja
el líquido, y por los que migran las
moléculas cargadas. Según la densidad
de filamentos, se formará un reticulado
más o menos frondoso, que tendrá un
tamaño de poro medio (habitualmente
entre 100 y 300 nm) menor cuanto más
cantidad de filamentos haya por unidad
de volumen. (Parte C): micrografía elec-
trónica de agarosa al 2%.
2 16 Técnicas instrumentales de análisis en Bioquímica
ta en forma de tiras estrechas y alargadas, de apariencia similar al papel satinado.

Presenta la ventaja de que se vuelve transparente mediante deshidratación con
mezclas de alcohol y agua, con lo que podrá ser densitometrado (Capítulo 2) para
cuantificar las compuestos separados. Se utiliza habitualmente en el análisis de
muestras clínicas (suero, orina y otros líquidos fisiológicos).
El ejemplo característico de los soportes de tipo 11 son los geles de poliacrilami-
da (PA). No sólo evitan la convección y minimizan la difusión, sino que además
participan en el proceso de separación. Los geles de PA son medios porosos en los
que el tamaño del poro es similar al tamaño de las proteínas, de tal modo que existe
un efecto de tamizado molecular, y la separación electroforética depende de la den-
sidad de carga de las moléculas y de su tamaño.
5.3. Factores que afectan a la electroforesis
El resultado de una electroforesis depende de diferentes factores y es necesario

conocerlos para lograr la máxima resolución.
5.3.1. Campo eléctrico
Es lo que posibilita que haya electroforesis. A su vez, como gradiente de potencial

que es, depende de diferentes parámetros, cuya incidencia hay que analizar.
Diferencia de potencial entre electrodos, V. Se mide en voltios y es lo que define
el campo eléctrico (diferencia de potencial entre electrodos referida a la distancia,
d, entre éstos, Vld). Cuanto mayor sea, mayor será la velocidad de migración de las
moléculas. Las electroforesis realizadas a 10-500 voltios se suelen considerar de
bajo voltaje (la gran mayoría), siendo de alto voltaje las que se llevan a cabo entre
500 y 10.000 voltios.
Intensidad, i. Se mide en amperios (A), y cuantifica el flujo de carga eléctrica.
Está relacionada con el factor anterior a través de la ley de Ohm (V = i R) (R, resis-
tencia). Para una diferencia de potencial dada, su valor (habitualmente 5-50 mA)
vendrá determinado por la resistencia del soporte. Por tanto, es lo que, en última
instancia, da cuenta de la distancia recorrida por las moléculas.
Resistencia, R. Se mide en ohmios. Cuanto mayor sea la resistencia del soporte,
menor será la movilidad electroforética, puesto que la intensidad será menor. La
resistencia depende de la naturaleza del soporte, de sus dimensiones (anchura, lon-
gitud, sección) y de la concentración del tampón de electroforesis. Obsérvese que si
se sometiesen dos soportes de diferentes características a la misma diferencia de
potencial, la intensidad que circularía por cada uno de ellos podría ser distinta.
Temperatura. El paso de una corriente eléctrica produce calor (efecto Joule).
Este efecto será tanto mayor, cuanto mayor sea la diferencia de potencial y la resis-
tencia del sistema. Debe controlarse de forma estricta, pues puede afectar a la
muestra (desnaturalizándola), al soporte e incluso al equipo electroforético, si la
temperatura se eleva en demasía. Todo ello justifica la necesidad de un sistema de
refrigeración en las cubetas.
5.3.2. Muestra
La U de una molécula es tanto mayor cuanto mayor sea su carga, y disminuye

según aumenta su tamaño, pues mayor es la fricción de la molécula con el medio y
menor es su carga por unidad de superficie (factor que multiplicado por el valor del
campo daría el de la fuerza que actúa sobre la molécula). Así las moléculas globula-
res se mueven con mayor facilidad que las elongadas (la esfera presenta la mínima
superficie a igualdad de volumen). Por ello moléculas del mismo tamaño y carga,
pero de distinta forma, pueden diferir en U, y ser separables por electroforesis.
5.3.3.Tampón
Durante la electroforesis se produce electrolisis del agua, generándose protones

en la proximidad del ánodo e iones hidroxilo en la del cátodo. Este entorno se haría
más básico, mientras que el anódico, se acidificaría. Un tampón es, por tanto, esen-
cial en toda electroforesis. Su composición no debe afectar a las moléculas a sepa-
rar, aunque en algunos casos se aproveche la unión de alguno de sus iones para pro-
ducir una mejor separación. La fuerza iónica condiciona la U de las sustancias a
separar, pues influye en su esfera de solvatación y en la conductividad del sistema.
Es necesaria, por tanto, una fuerza iónica suficiente para mantener el pH y la con-
ductividad durante todo el proceso. Sin embargo, una fuerza iónica muy elevada
interfiere, por contra, en la electroforesis. Por ello se utilizan tampones con fuerzas
iónicas moderadas (0,05-0,10 M). Pero, es el pH la característica del tampón que
debe ser controlada más cuidadosamente, puesto que determina la carga de la
muestra.
Por último, señalar que hay dos sistemas de electroforesis, atendiendo a la dis-
tribución del tampón: sistemas de tampón continuo, cuando se emplea un único
tampón en el proceso, y sistemas discontinuos, cuando se usan al menos dos tampo-
nes diferentes, en cuanto a pH y composición.
5.3.4. Soporte
La presencia del soporte en las electroforesis de zona hace que éste pueda dar
lugar a una serie de fenómenos, ajenos a la electroforesis en sí, pero de marcada
trascendencia para el resultado del proceso. Tales fenómenos son los siguientes:
Adsorción es una retención inespecífica de las moléculas de la muestra sobre el
soporte. Tiene un efecto negativo sobre la resolución, ensanchando las bandas de
migración.
Electroendósmosis es un fenómeno que se da en algunos soportes (fundamen-
talmente en los del grupo 1), en los que aparecen cargas negativas, debidas a grupos
carboxilo (-COO-) o sulfato (-SO:-), al estar en contacto con una disolución ióni-
ca. Surge así un potencial de Helmholtz sobre la superficie del soporte, y los iones
del tampón se orientan según dicho potencial (Figura 5.5). Al aplicar el campo
eléctrico, los iones y las moléculas se desplazan según su carga. Pero en su migra-
218 Técnicas instrumentales d e análisis en Bioquímica
FIGURA 5.5. (Parte A ) :orientación de iones en una disolución en contacto con una superficie sólida cargada (poten-
cial de Helmholtz). (Parte B): efecto electroendosmótico en la superficie de un soporte cargado negativamente. Los
cationes migran desplazándose por la superficie. Los aniones lo hacen por el centro del poro.
ción se encuentran con un flujo de cationes, desplazándose sobre la superficie del

soporte, y otro de aniones, haciendolo por el centro de los poros (Figura 5.5). Tal
flujo orientado, se denomina flujo electroendosmótico (EEO), y el fenómeno es la
electroendósmosis. El EEO de un soporte se cuantifica sometiendo a electroforesis
una sustancia neutra (un dextrano, Dx), que sería desplazado únicamente por el
EEO, y otra cargada negativamente (la albúmina, Al, proteína ácida del suero san-
guíneo). Midiendo las distancias migradas (d) en unas condiciones preestablecidas,
d(Dx) y d(Al), respectivamente, el EEO se expresa como: -mr= d(Dx)l[d(Dx) +
d(Al)], lo que da una medida funcional del número de cargas presentes en un
soporte. El EEO va en contra de la resolución de una electroforesis, ya que las ban-
das de la muestra se ensanchan y se distorsionan al enfrentarse a una corriente de
iones orientada en sentido contrario. Sin embargo, el EEO contribuirá a una mejor
resolución en las inmunoelectroforesis y en la electroforesis capilar.
Tamizado molecular. Es un efecto debido al mayor o menor reticulado de los
soportes. Cuanto más tupida es la red d e fibras, menores son los poros. El movi-
miento de las moléculas a través del soporte es más o menos fácil en función de su
tamaño respecto al de los poros. Aquellas moléculas cuyo tamaño se aproxima al
del poro, ven impedido su avance respecto a aquellas otras cuyo tamaño es muy
inferior. De esta manera, el soporte actúa como un cedazo que separa o tamiza las
moléculas en función de su tamaño.
5.4. Electroforesis en soportes no restrictivos
Inicialmente se va a describir el caso de las proteínas, tratándose posteriormen-

te el de los ácidos nucleicos (apartado 5.9). Las proteínas son polielectrolitos cuya
carga neta depende del contenido de una serie de aminoácidos (ácido glutámico.
ácido aspártico, lisina, arginina e histidina, fundamentalmente) y del grado de ioni-
zación de éstos al pH considerado. E n los soportes no restrictivos, de tipo 1, el
tamaño de las proteínas, es muy pequeño en comparación con el tamaño d e poro
del soporte, de tal modo que el entramado no interfiere en la migración (soporte no
restrictivo). La separación depende de la densidad de carga, entendida como una
relación entre la carga y la masa, al p H seleccionado. Cuanto mayor sea esa rela-
ción para una molécula, mayor será su velocidad de migración en un campo eléctri-
co, hacia el polo que determine su carga neta.
La primera etapa del proceso es la aplicación de la muestra. En papel o en ace-
tato de celulosa, ésto se puede efectuar de forma puntual o longitudinalmente. La
aplicación puntual permite analizar varias muestras simultáneamente. E n la longi-
tudinal se aplica una sola muestra pero en mayor cantidad (Figura 5.6). La muestra
se aplica disuelta en el tampón de electroforesis, del que está impregnado el sopor-
te y que se encuentra en los reservorios de la cubeta. Se deposita en una pequeña
zona, lo más estrecha posible, en el centro o en un extremo del soporte (si se cono-
ce cuál va a ser la dirección de desplazamiento), de modo perpendicular a la direc-
ción del campo eléctrico (Figura 5.6). Puede utilizarse para ello un tubo capilar o
una pipeta que permita aplicar pequeños volúmenes. Debe evitarse la proximidad
de los bordes del papel, donde el campo eléctrico no es homogéneo y se distorsio-
nan las bandas según avanzan. El volumen aplicado suele ser inferior a 10 p1. Si se
requieren volúmenes mayores, porque la muestra se encuentre a baja concentra-
ción, pueden hacerse aplicaciones sucesivas en la misma zona, secando después d e
cada una de ellas' En los geles de agar o almidón, se perfora el gel con la ayuda d e
un troquel o de una pipeta del diámetro adecuado, y se elimina esa porción por suc-
ción. Puede perforarse de forma puntual (cilíndrica) o rectangular, acorde con el
número y cantidad de muestra que se desee analizar. La muestra se deposita en el
orificio practicado, cuidando que no rebose. En todos los casos, la zona de aplica-
ción debe ser lo mas estrecha posible, pues así aumenta la resolución, al evitarse
solapamientos entre bandas que migren en posiciones cercanas (Figura 5.7). Debe
considerarse que las bandas separadas siempre son más anchas que la zona de apli-
cación inicial, debido a la difusión.
@mG aplicación longitudinal
soporte
E+
muestra
aplicación puntual
E+
muestra
E +
marcador de
electroforesis
F I G U R A 5.6. Aplicación longitudinal, sobre papel (rectángulo horizontal con los electrodos en los extremos), de una
muestra (rectángulo negro vertical), sin llegar a los extremos del soporte. E, hace referencia al campo eléctrico. Apli-
cación puntual de varias muestras (puntos negros); (parte derecha), aplicación de marcadores junto a la muestra.
220 Técnicas instrumentales de análisis en Bioquímica
@ -+
4
-b
4
E
MUESTRA MUESTRA
(A+B+C) (A+B+C)
F IGURA 5.7. Influencia del modo de aplicación de la muestra sobre la resolución. (Parte izquierda): aplicación en
una banda estrecha (barra vertical negra). Los componentes (A, B, C) se separan en zonas independientes (barras
verticales sombreadas). (Parte derecha): aplicación en una banda ancha (barra vertical negra): A y B aparecen sola-
pados en una banda, mostrando una menor resolución.
Una vez aplicada la muestra debe verificarse que el sistema muestra continui-
dad al paso de la corriente eléctrica. E n el caso de los geles de agar, el tampón está
embebido en el soporte (Figura 5.2). E n el caso del papel o del acetato de celulosa.
es necesario humedecer el soporte para que sea conductor. Para ello, el soporte se
impregna de tampón de electroforesis, de forma simultánea por ambos extremos.
para que se desplace por capilaridad hacia la zona donde está aplicada la muestra.
Ambos frentes han de coincidir sobre la zona de aplicación, pero sin que ninguno la
sobrepase. De esta manera contribuyen a estrecharla.
Al aplicar una diferencia de potencial, comienza la electroforesis, y cada com-
ponente de la muestra migrará hacia uno u otro polo en función de su carga. La
electroforesis finalizará cuando se haya producido la máxima separación de los
componentes de la muestra, sin sobrepasar los límites del soporte. E n caso contra-
rio, acabarían mezclados con el tampón de la cubeta. Para evitar esto se usan los
marcadores electroforéticos. Estos son moléculas coloreadas de elevada U (gran
carga respecto a su tamaño), superior a la de cualquier componente de la muestra.
Se aplican a ambos lados de ésta. Su desplazamiento se puede observar por ser
coloreados, y cuando alcanzan los extremos del soporte se da por finalizada la elec-
troforesis. De esta manera se tiene la certeza que ningún componente de la muestra
ha abandonado el soporte. Entre los marcadores mas utilizados se encuentran la
dinitrofenil-lisina (DNP-Lys) y el azul de bromofenol.
Una vez acabada la electroforesis, para conocer el resultado del proceso, se
procede a la etapa de tinción. El soporte se retira de la cubeta, y se sumerge en un
recipiente que contenga una disolución de un colorante que se una de manera
específica a los componentes de la muestra. Esta disolución, además de teñir, pre-
cipita a los componentes separados, en la posición en la se que encuentren. Para
este último fin se utilizan ácidos (tricloracético, sulfosalicílico o acético son los más
habituales) en los que las proteínas son insolubles. Como medios de tinción, en el
caso de las proteínas, son muy utilizadas las disoluciones de Negro Amido al 1%
(p/v) en ácido acético, y de Azul Coomassie al 0,1% (p/v) en metanol/agua/ácido
acético (9:9:2;v/v/v). El proceso de tinción es de duración variable (1-6 horas), en
función de la naturaleza y del espesor del soporte. Una vez finalizado se ha de pro-
ceder a eliminar el exceso de colorante. Para ello se decanta la disolución de teñi-
do y se sumerge el soporte en una de desteñido, habitualmente la misma pero sin
el colorante. Así, el que no se ha unido a las proteínas difunde libremente desde el
soporte. Repitiendo varias veces este proceso de lavado, solo quedan coloreados
los complejos proteína-colorante (Figura 5.8). Con los agentes de tinción citados
pueden detectarse cantidades de proteínas superiores a 1 pg. Posteriormente se
citarán otros con mayor sensibilidad. Si el soporte utilizado hubiese sido acetato
de celulosa (recuérdese que puede transparentarse por deshidratación), una vez
desteñido, se podría estimar el contenido de cada banda por densitometrado
(Figura 5.9).
Si la electroforesis se pretende desarrollar a escala preparativa, es necesario
introducir algunas modificaciones respecto a lo descrito. Como ejemplo de los
cambios necesarios se trata a continuación el caso de la electroforesis sobre papel.
Se ha de utilizar uno de mayor grosor (175 g/m2) que el utilizado en electroforesis
analítica (85-100 g/m2; 0,15 mm de espesor). Esto permite aplicar mayor volumen
de muestra (50-100 pl), acorde con la finalidad preparativa. La electroforesis se
lleva a cabo de manera idéntica a lo descrito previamente. Una vez finalizada, y
antes de proceder a la tinción, se corta longitudinalmente una tira muy estrecha
del papel, y se tiñe del modo habitual (Figura 5.10). Si ahora se vuelve a adosar la
tira al resto del soporte, en la posición correcta, las zonas coloreadas indicarán
donde se encuentran los distintos componentes separados. Puede lograrse mayor
precisión cortando dos tiras, una de cada lateral del soporte (Figura 5.10). Una
vez localizado el componente de interés, se recorta la zona en la que se encuentra,
y se eluye del papel a base de lavados con el tampón. Si el soporte es gel de agar o
de almidón, se procede de manera similar.
F I G U R A 5.8. Electroforesis en agar de 5 muestras de suero

humano (se han aplicado 5 pl en todos los casos). En la parte
superior se indican las cuatro fracciones proteicas en que se
resuelven estas muestras: albúmina (A), a, p y y: El ánodo está
a la izquierda. En el pocillo 1 se aplicó un suero humano nor-
mal, en el que se aprecia la heterogeneidad de la fracción y y
la abundancia de albúmina. En los restantes pocillos se han
aplicado muestras de pacientes con distintas patologías, obser-
vándose un distinto resultado electroforético. La muestra 5
corresponde a una mezcla de albúmina e inmunoglobulina G
(IgG). Los pocillos de aplicación son los puntos blancos que
aparecen en la posición p. El gel está teñido con Negro Amido.
FIGURA 5.9. Electroforesis automatiza-

da en acetato de celulosa, de 30 mues-
tras (suero y orina de origen humano).
(Parte superior): separación de las pro-
teínas séricas en 5 fracciones según su
U: albúmina, al, 02, P y y(Figura 5.8).
La proteína mayoritaria (albúmina)
aparece intensamente teñida, junto al
ánodo. (Parte inferior): densitometra-
do de la muestra marcada (flecha),
indicándose el % de cada fracción.
Con asteriscos se han destacado algu-
nas muestras en las que la composición
proteica muestra alteraciones fácil-
mente observables (**:suero; *:orina).
proteínas tinción tampón
. N I I I
/
/ eiución
O O
..-, - - -, - - ., - - -,
B I I n
electroforesis l+L..: L.:. L-.,
3 , I
L..?
I
(papel) b t i n c i b n proteína
F I G U R A 5.10. Electroforesis preparativa en papel. Los rectángulos en trazo discontinuo (sombreados), indican la
posición alcanzada por las proteínas tras la electroforesis. Posteriormente se cortan dos tiras y se procede a su tin-
ción, lo que permite la localización de las bandas y la obtención de, por ejemplo, la proteína más catódica.
5.5. lnmunoelectroforesis
Es una combinación de una electroforesis en gel de agar (o agarosa) seguida de

una inmunodifusión (Figura 5.11). En la primera se realiza una aplicación puntual de
la muestra, lo que al final se traduce en que los distintos componentes (proteínas)
estarán distribuidos a lo largo del gel según el eje de migración (Figura 5.8). Acabada
la electroforesis, y sin efectuar la tinción, se practica en el gel un canal o "trinchera",
paralelo a la dirección de migración. Para ello se utiliza un bisturí de doble hoja, cuya
separación determina la anchura de la trinchera. En ella se deposita un antisuero que
contenga anticuerpos específicos frente a una o varias de las proteínas separadas en
la electroforesis. Los geles se mantienen así, a temperatura ambiente (20-22 "C),
durante 24-48 horas. Los anticuerpos y las proteínas (antígenos) difunden y, si se
encuentran en la proporción adecuada, producen complejos insolubles (complejos
antígeno-anticuerpo) que precipitan y aparecen en el gel como bandas elipsoidales
(Figura 5.12). Los complejos solo se producen cuando ambos componentes se hallan
en lo que se conoce como relación de equivalencia. Estas no son idénticas para todas
las proteínas presentes en una muestra. Por eso deben determinarse, en experimen-
tos preliminares, las cantidades idóneas del antisuero y de la muestra, así como las
distancias entre el pocillo (de aplicación de la muestra) y la trinchera. Si las distancias
son muy pequeñas, el antígeno (proteínas) difunde rápidamente y puede no formarse
el precipitado. Si la distancia es mayor, la posibilidad de formación del precipitado
también lo es, pero hay que emplear mayor cantidad de antisuero, y la duración del
proceso se alarga. Se elige la distancia entre el pocillo y la trinchera que permita
obtener el máximo número de bandas de precipitación. Una vez formadas éstas, el
gel puede lavarse para eliminar las proteínas que no estén inmunoprecipitadas, y
posteriormente teñirse, como se ha descrito previamente. Cada proteína de la mues-
tra produce una banda de precipitación independiente, por lo que es posible identifi-
car el número de constituyentes de la muestra que son reconocidos por los anticuer-
pocillo trinchera proteínas

aplicación muestra (anticuerpo)
f
/\
í3 ~7 3 8 .
L7
--,
C,
-3
O E O
(".)PO (,)
electroforesis (agar) inmunodifusión bandas de precipitación
FIGURA 5.11. Fases de una inmunoelectroforesis. (Parte izquierda): electroforesis en agar sin teñir la muestra. Los
óvalos en trazo discontinuo indican la posición final de las proteínas. (Parte central): difusión de los anticuerpos de
la trinchera y de las proteínas separadas, en las direcciones indicadas por las flechas. (Parte derecha): formación de
complejos antígeno-anticuerpo que aparecen como bandas de precipitación.
F IGURA 5.12. Fotografía de las bandas de precipitación en una

IEF de dos muestras de suero humano. (1),pocillos de aplicación
de las muestras. (2),trinchera sobre la que se deposita el antisue-
ro. (A), albúmina. (G): IgG. La flecha señala una alteración en la
banda de precipitación de la IgG, indicando la presencia de un
componente monoclonal.
pos (antisuero). La gran especificidad y sensibilidad de las reacciones de precipi-

tación permite diferenciar sustancias con movilidades electroforéticas idénticas. !-
detectar componentes que se encuentren a concentraciones mínimas (pg). Así, las 5-6
fracciones clásicas que se observan al analizar las proteínas del suero humano por
electroforesis en agar o acetato de celulosa (Figuras 5.8 y 5.9), se convierten en más
de 30 bandas de precipitación independientes tras una inmunoelectroforesis (IEF).
La elevada resolución de la IEF proviene de las características de las bandas de
precipitación. Estas son impermeables sólo a las dos sustancias que la forman (la
proteína o antígeno y su correspondiente anticuerpo), pero son permeables a las
otras sustancias (otras proteínas y otros anticuerpos) presentes en el gel. Por eso.
proteínas diferentes pueden formar bandas de precipitación que se crucen, lo cuaI
permite distinguir entre una multitud de proteínas antigénicamente diferentes aun-
que tengan movilidades electroforéticas idénticas (Figura 5.12). La superposición o
la confluencia de bandas es muy improbable que ocurra. Dos bandas de precipi-
tación no pueden superponerse, a menos que las generen dos sustancias con idénti-
ca movilidad electroforética e idéntica velocidad de difusión (que depende inversa-
mente del tamaño molecular), y, además, cuyas relaciones de equivalencia sean
tales que las líneas de precipitación se formen en el mismo sitio. La probabilidad de
que todo ésto coincida, siendo proteínas diferentes, es mínima.
Hay que señalar que el número de bandas observado en una IEF debe enten-
derse como el número mínimo de componentes presentes. Puede haber más, que
no sean detectados por el antisuero empleado o que no hayan alcanzado la relación
antígeno-anticuerpo adecuada. Por ello, hay que tener presente que con distintos
antisueros se pueden identificar distintos componentes de una misma muestra.
E n resumen, la IEF es una técnica eminentemente cualitativa, que se desarrolla
en condiciones nativas, y es especialmente apropiada para el análisis de líquidos
fisiológicos y extractos celulares. Permite identificar sustancias en mezclas muy
complejas, aun estando presentes en muy baja concentración. Pero, requiere que
tales sustancias sean inmunogénicas, y depende de los antisueros utilizados, por lo
que es difícil de estandarizar.
5.6. Electroforesis en geles de poliacrilamida
La electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE, del inglés PolyAcrylamide

Gel Electrophoresis) se utiliza mayoritariamente para la separación de proteínas.
Capítulo 5: Electroforesis
aunque también es útil para ácidos nucleicos (apartados 5.9.10 y 5.9.11). Es el

método zona1 más utilizado debido a sus numerosas ventajas. La fundamental es
que posee un gran poder de separación. Los geles de poliacrilamida (PA) son
soportes restrictivos, del tipo 11. No solo evitan la convección y minimizan la difu-
sión, como los otros soportes, sino que, además, participan directamente en el pro-
ceso de separación. Se preparan de modo que sus poros sean de un tamaño compa-
rable al de las proteínas, de manera que produzcan un efecto de tamizado
molecular. La separación electroforética depende entonces de la densidad de carga
de las moléculas y de su tamaño. De esta forma, dos proteínas con idéntica densi-
dad de carga, pero de tamaño diferente, no se separarían en papel, por ejemplo,
puesto que su movilidad electroforética sería igual, pero sí en un gel de PA. Este
soporte dificultaría más el avance de la de mayor tamaño.
Pero, además, los geles de PA tienen otras ventajas, que justifican su uso priori-
tario. Son químicamente inertes frente a las moléculas biológicas. Son transparentes,
lo cual facilita su densitometrado. Son estables en un amplio intervalo de valores de
pH, temperatura y fuerza iónica. Son resistentes a los agentes desnaturalizantes,
como urea o detergentes. No presentan efecto electroendosmótico, lo cual redunda
en una mejor resolución. Son mecánicamente estables, por lo que pueden ser deshi-
dratados, quedando reducidos a una fina película, lo que facilita su almacenamiento
y la realización de autorradiografías si alguno de los componentes era radiactivo
(Capítulo 1). Pueden prepararse con tamaños de poro muy variado, acomodándolo
al tamaño de las proteínas a separar. Por último, los componentes (monómeros)
necesarios para formar (polimerizar) el gel pueden adquirirse con un elevado grado
de pureza.
5.6.1. Preparación del soporte
El soporte se prepara a partir de un compuesto de bajo peso molecular (acri-

lamida, CH,=CH-CO-NH,) o monómero, que forma largas cadenas lineales
(polímero). Estas poseen abundantes grupos polares (-CO-NH,) que las hace
solubles en medios acuosos. Al no estar unidas entre sí, tales cadenas formarían
un gel sin consistencia mecánica, inmanejable. Para unirlas se utiliza otro monó-
mero, la N,N'-metilen bisacrilamida o abreviadamente bisacrilamida (CH,=CH-
CO-NH-CH,-NH-CO-CH=CH,). Esta puede formar parte de dos cadenas, que
estarían así unidas covalentemente (Figura 5.13). Aunque es la más utilizada, ade-
más de la bisacrilamida hay otros compuestos que realizan su misma función. Se
puede destacar a la N,NY-bisacriloilcistamina (CH,=CH-CO-NH-CH2-S-S-CH2-
CH2-NH-CO-CH=CH,) que posee un enlace disulfuro que puede ser roto por
agentes reductores (P-mercaptoetanol, ditiotreitol). Así es posible solubilizar el gel
una vez realizada la electroforesis, para recuperar con facilidad alguno de los com-
ponentes separados.
En función de la concentración de acrilamida se obtienen entramados más o
menos densos, mientras que la cantidad de bisacrilamida condiciona el grado de
entrecruzamiento de las cadenas. Ambos componentes, en conjunto, determinan
las características físicas del gel resultante: resistencia mecánica, fragilidad, elastici-
C=O C =O
I I
NH NH 2
I
CH 2
I
'NH
I
5.13.
F~GUR A Estructura de la (a) acrilarnida, (b) bis-acrilarnida, y (c) poliacrilarnida.
dad, grado de reticulación (tamaño del poro), etc. La polimerización de la acrilami-

da se consigue por la adición de catalizadores que, a través de la formación de radi-
cales libres, inician y aceleran la formación de un gel tridimensional. El proceso se
inicia habitualmente por la adición de persulfato amónico, a una disolución acuosa
(tampón) de ambos monómeros (acrilamida + bisacrilamida). El anión persulfato
tiene una elevada tendencia a descomponerse espontáneamente, y de forma homo-
Iítica, formando radicales sulfato que son poco estables y tienden a recombinarse.
Aunque ésto inicia la reacción de polimerización, se requiere la adición de
N,N,N',N'-tetrametilendiamina (TEMED) como propagador. El T E M E D forma
radicales libres estables en presencia de radicales sulfato, lo que contribuye a que la
reacción de polimerización se propague y no se extinga. Es necesaria la base libre
del TEMED, por lo que el proceso debe realizarse a pH básico. Valores ácidos de
pH retardan la polimerización. Ajustando las cantidades de persulfato y de
TEMED. puede controlarse la velocidad de polimerización. La polimerización tam-
bién puede lograrse con riboflavina en lugar del persulfato. Al iluminar la riboflavi-
na con radiación UV, se produce su fotodescomposición, lo que genera radicales
libres que inician la polimerización. En este caso no es imprescindible el TEMED,
pero puede añadirse pues favorece el proceso. Siempre se debe evitar la presencia
de oxígeno, ya que inhibe la polimerización al bloquear los radicales libres. Por
ello, la mezcla de polimerización debe desgasificarse a vacío. Así, además, se impi-
de que queden atrapadas burbujas durante la polimerización, lo que distorsionaría
el gel y alteraría el campo eléctrico. La temperatura óptima de polimerización es de
25-30 "C. El proceso, mayoritariamente, ocurre en pocos minutos, pero es reco-
mendable dejar transcurrir más tiempo para que no queden restos de monómeros o
de pequeñas cadenas libres.
Los monómeros (en polvo o en disolución) son neurotóxicos, por absorción a
través de la piel o por inhalación. Por ello, deben manejarse en una campana
extractora, con guantes y mascarilla. Una vez que ha tenido lugar la polimerización,
la toxicidad es muy reducida, pero es recomendable que se usen guantes durante la
manipulación de los geles, debido a la posible presencia de monómeros libres.
El tamaño del poro en los geles de PA viene determinado por la concentración
total de monómeros. Obsérvese que la bisacrilamida participa no sólo en el entre-
cruzamiento sino también en las cadenas lineales. Así, un gel de PA se define por
dos parámetros: el reticulado, (% T), que es la concentración total de monómeros
(acrilamida + bisacrilamida, % p/v), y la dureza, % C, que viene dada por la relación
de la cantidad de bisacrilamida al total de monómeros. Este valor suele ser bastante
constante, y normalmente inferior al 1%, de manera que es el otro el decisivo.
Incrementando % permaneciendo % C constante, el tamaño del poro decrece, y
viceversa. Sin embargo, hay unos límites, pues los geles con % T inferiores a 2,5-
3,0% son casi líquidos, con una flaccidez que impide su manejo. En el otro extre-
mo, los geles con un % T del 30% presentan un reticulado tan denso que, moléculas
con una masa tan pequeña como 2.000-3.000 Da, difícilmente pueden atravesarlos.
Además son poco flexibles y se fracturan con facilidad. El escoger el % T óptimo es
crítico para conseguir una buena separación. Se estima que el tamaño medio del
poro es 800 A, 50 A y 20 A, para valores de 2,5, 7,5 y 30 % T, respectivamente. En
el Cuadro 5.1 se muestran los tamaños aproximados de un conjunto de proteínas y
los geles que se suelen utilizar para su análisis.
Al polimerizar la acrilamida, adquiere la forma del recipiente. Por ello se nece-
sita un molde para preparar el gel. Los hay de dos tipos: tubo y placa. E n el primer
caso $e trata de un tubo de vidrio de dimensiones variables (siendo las más habitua-
les 15-20 cm de largo y 0,s-0,s cm de diámetro interno) abierto por los dos extre-
mos. Se tapa el orificio inferior y se rellena con la disolución de polimerización
sobre la que se deposita, suavemente, una pequeña cantidad de butanol. Así, el gel,
al polimerizar, no formará menisco sino que adquiere forma plana donde aplicar la
muestra de manera uniforme. Además, el butanol excluye al oxígeno, que interferi-
ría en la polimerización. Una vez formado el gel, se elimina el butanol y se retira la
tapa inferior del tubo. Es imprescindible la absoluta limpieza del interior del tubo,
para que no haya canales entre el gel y la pared, por los que podría avanzar la
muestra sin atravesar el soporte.
Aunque las primeras electroforesis en geles de PA se realizaron en tubo, hoy su
uso ha quedado restringido a la primera dimensión en electroforesis bidimensiono-
les, la PAGE preparativa y algunos casos de análisis de proteínas radiactivas.
CUADRO 5.1
Tamaño aproximado de algunas proteínas y concentración de acrilamida (%TI
utilizada en PAGE, en función de los distintos tamaños
Proteína M [kDa) Longitud [A) Diámetro
Albúmina 69 150 38
Tronsferrina 90 190 37
B1-lipoproteina 1.300 185 185
lnmunoglobulina 160 235 44
Fibrinógeno 400 700 38
Concentración de acrilamida (%TI kDa
3-5 > 100

5 - 12 2 0 - 150
1 0 - 15 10-80
> 15 < 15
5.6.2. PAGE en placa
Es la forma habitual en que se desarrolla la PAGE. Puede llevarse a cabo en

posición vertical u horizontal, según el tipo de cubeta empleada. Lo más habitual.
máxime para la separación de proteínas, es el modo vertical, que se puede desarro-
llar de dos maneras.
Geles Homogéneos. El molde se ensambla a partir de dos tipos de elementos:
dos placas de vidrio de tamaño variable (generalmente 20 x 20 cm) entre las que se
colocan tres pequeños listones, o espaciadores, de grosor igualmente variable (entre
0,5 y 1,5 mm). El grosor del gel vendrá determinado por el de los espaciadores.
Estos se colocan entre las dos placas de vidrio (Figura 5.14). Mediante pinzas se
mantiene fuertemente unido el conjunto. D e esta forma se consigue un recipiente
definido por las dos láminas de vidrio, los dos listones verticales y uno horizontal.
El gel se prepara introduciendo el volumen adecuado de la disolución de monóme-
ros desgasificada. E n la parte superior se coloca un peine (Figura 5.14) del mismo
grosor que los espaciadores, con un número variable de dientes, que se introducen
en la parte superior de la disolución que formará el gel. Terminada la polimeriza-
ción, se retira el peine, quedando la parte superior del gel con una serie de entran-
tes, pocillos, que servirán para depositar las muestras a analizar. Así, se consigue un
gel con la forma descrita en la Figura 5.14. Sus dimensiones pueden variarse utili-
zando cristales y espaciadores de distintas dimensiones, según las necesidades de la
L
peine
'\ ; ' espaciadores
'
1 cristal 2
F IGURA 5.14. Electroforesis en placa: elementos para ensamblar el molde. (Parte A), los espaciadores colocados
entre las placas de vidrio 1 y 2 forman el molde (parte B), que se presenta con los elementos separados para mayor
claridad. En la realidad, se mantienen unidos mediante pinzas de presión. Tras añadir la disolución de monómeros,
se coloca el peine en la parte superior. (Parte C), el gel formado presenta los pocillos donde aplicar las muestras.
Las dimensiones habituales del gel son: 1 = 10-20 cm; a = 10-15 cm; e = 0,5-1,5 mm. Se indica la dirección del campo
eléctrico (E) durante la electroforesis.
electroforesis, en función de la muestra. El campo eléctrico está orientado en la

vertical. Por eso, si se aumenta la longitud del gel, aumenta la resolución de la elec-
troforesis, aunque también se incrementa su duración. Cuanto mayor sea la anchu-
ra del gel, mayor será el número de pocillos y el de muestras que se pueden anali-
zar. Esta es una de las ventajas de la PAGE en placa frente a la de tubo. En la placa
se analiza un gran número de muestras simultáneamente, y por tanto en idénticas
condiciones. El espesor del gel y las dimensiones de los pocillos, que vienen condi-
cionados por el grosor de los espaciadores y el tamaño del peine, determinan la
cantidad de muestra que puede aplicarse. Aunque la PAGE es una técnica emi-
nentemente analítica, puede utilizarse de forma preparativa construyéndose geles
de mayor grosor (hasta 3 mm). Una vez conseguida la polimerización del gel, se
retiran el peine de la parte superior y el espaciador inferior, para permitir el esta-
blecimiento del campo eléctrico. El conjunto resultante, con el gel emparedado
entre las dos placas de vidrio, se coloca en la cubeta de electroforesis.
230 Técnicas instrumentales d e análisis en Bioquimica
La segunda modalidad es la de geles en gradiente, en los que la concentración

de acrilamida (% T ) aumenta progresivamente desde la parte superior del gel hasta
la inferior (el tamaño de poro decrece de forma inversa). El gradiente de concen-
tración de acrilamida puede ser lineal o no (cóncavo, en pasos, etc.), aunque los
lineales son los más utilizados. Con un gel de concentración homogénea, el interva-
lo de tamaños de proteínas que pueden separarse es relativamente restringido
(Cuadro 5.1). Con geles en gradiente, tal intervalo se expande considerablemente.
Por otro lado, estos geles presentan una mejor resolución. E n ellos, las proteínas
migran hasta que llegan a una zona cuyo tamaño de poro no les deja progresar.
Además, las moléculas de la zona delantera de la banda se frenan más (encuentran
antes los poros más pequeños) que las moléculas de la parte trasera, con lo que la
banda se estrecha, concentrándose sobre su parte delantera. Esto produce bandas
muy finas y una gran resolución.
5.6.3. Cubeta para PAGE en placa
Las hay de diferentes tamaños, según el gel empleado (se llegan a usar "minige-
les" de 5 x 5 cm para análisis rápidos). Además, pueden incorporar sistemas de refri-
geración para disipar el calor producido durante la electroforesis. E l modelo básico
(Figura 5.15), construido en metacrilato, consta de dos recipientes o reservorios,
superior e inferior, unidos por una misma pieza central común. Estos alojan el tam-
pón de la electroforesis, que es el mismo que el utilizado en la preparación del gel
(excepto en algunas modalidades de PAGE descritas más adelante). Cada reservo-
rio lleva dispuesto longitudinalmente (para asegurar un campo eléctrico uniforme)
un electrodo de platino. El conjunto de las placas de vidrio con el gel se adosa a la
pieza central, de modo que contacten con el tampón de los reservorios. D e esta
manera hay una continuidad entre el tampón del recipiente superior, el que impreg-
na al gel, y el del recipiente inferior. Una de las placas de vidrio, la que se coloca
adyacente a los reservorios, lleva un rebaje en su parte superior (cristal 2; Figuras
5.14 y 5.15) para permitir el contacto del tampón con el gel. Con esta disposición, al
aplicar una diferencia de potencial entre ambos electrodos, se establecerá un campo
eléctrico a lo largo del gel de PA.
5.6.4. Aplicación de la muestra
Tal como se ha descrito (Figura 5.15), el tampón del reservorio superior cubre
el gel y los pocillos en los que se ha de cargar la muestra. Con el fin de que ésta,
disuelta en el mismo tampón, no difunda al depositarla en los pocillos, se le añade
un compuesto (habitualmente sacarosa o glicerol) que aumente su densidad. El
volumen de muestra que puede aplicarse en cada pocillo (10-100 pl, con un máximo
de 200 pl) depende de su tamaño. La aplicación se realiza mediante pipetas o jerin-
gas que permitan dispensar estqs pequeños volúmenes. La masa aplicada es del
orden de 1-20 pg, aunque pueden aplicarse cantidades menores (hasta unos pocos
nanogramos) si se dispone de métodos de detección (tinción) suficientemente sen-
FIGURA 5.15. Cubeta para PAGE. A través de los bornes, la cubeta se conecta a la fuente de alimentación. El tubo
de goma sobresale de la superficie de la pieza central. Al colocar los cristales que contienen el gel (parte B), presio-
nan la goma, sellando el contacto entre ambas superficies. El rebaje del cristal 2 coincide con el de la pieza central
(parte A), en el reservorio superior, de forma que es el cristal 1 el que cierra esa apertura, permitiendo que el tam-
pón (no dibujado) contacte con el gel. El conjunto de la parte B, se mantiene ensamblado mediante pinzas de pre-
sión, no incluidas en la Figura. Las pinzas mantienen también el conjunto B adosado a la pieza central de la cubeta
(parte C). Obsérvese aquí que el espaciador inferior (visible en la parte B) se ha retirado para permitir el paso de la
corriente. La muestra puede cargarse en el gel tanto en (B) como en (C).
232 Técnicas instrumentalesde análisis en Bioquímica
sibles. E n el tampón de la muestra, también se añade el marcador electroforético

para determinar el final del proceso. El Azul de Bromofenol es el marcador más
utilizado.
5.6.5. PAGE en condiciones no desnaturalizantes en sistemas de tampón continuo
La modalidad de PAGE más sencilla es la descrita en los apartados previos:

un gel de PA de concentración uniforme y un único tampón. La muestra se carga
directamente en el gel en el cual se va a producir la separación. La duración del
proceso es variable, pudiendo oscilar entre 1-8 horas, dependiendo de la intensi-
dad que circule en el sistema. E n las electroforesis en soportes no restrictivos, la
muestra podía aplicarse en el centro o en uno de los extremos, de forma q u e los
compuestos con carga negativa se desplazaban al ánodo y viceversa. Si se invirtie-
ra la posición de los electrodos el resultado sería el mismo. Sin embargo, en
PAGE, la posición de los polos determina el resultado, ya que las muestras se
aplican en un extremo, en la zona superior del gel. Muchas proteínas poseen pun-
tos isoeléctricos (apartado 5.7) entre 4 y 7, de forma que se suelen utilizar tampo-
nes débilmente básicos (pH 8-9) en los que estarán cargadas negativamente. Por
ello el ánodo se coloca en el reservorio inferior y el cátodo en el superior. Hay
proteínas muy básicas, como las histonas, que en las condiciones descritas tienen
carga positiva. La electroforesis se desarrolla entonces en condiciones ácidas en
las que las histonas están cargadas positivamente. E n estos casos se invierte la
posición anterior de los electrodos.
La PAGE descrita se desarrolla en condiciones en las que no tiene porque alte-
rarse la conformación nativa de las proteínas separadas (por ello se dice que se
lleva a cabo en condiciones no desnaturalizantes, a diferencia de otro modo electro-
forético, también en este tipo de soportes, pero en condiciones desnaturalizantes;
apartado 5.6.12). Por eso, finalizada la electroforesis, puede estudiarse la funciona-
lidad de las proteínas separadas (actividad enzimática, capacidad de unión de anti-
cuerpos, unión de hormonas a su receptor, etc.).
5.6.6. PAGE en condiciones no desnaturalizantes en sistemas

de tampón discontinuo
En esta modalidad, el tampón presente en los reservorios es diferente al que

impregna el gel. Este, tampoco es homogéneo, ya que hay dos geles diferentes. El
de resolución (donde tiene lugar la separación de las proteínas) se polimeriza sin
colocar el peine, de modo que su parte superior presenta un frente plano. Sobre él
se polimeriza (quedando fundidos) otro pequeño gel (1-3 cm) en el que están los
pocillos de aplicación de la muestra, y cuya finalidad es concentrarla (gel de concen-
tración) en la zona de contacto con el gel de resolución. Aquel tiene un tamaño de
poro muy grande (2,5-3,O % T), no restrictivo, mucho mayor que el del gel de reso-
lución, cuyo poro sí es restrictivo. El gel de concentración se prepara en un tampón
con una composición de iones y de pH distintos (habitualmente pH 6,5) que el pre-
Capítulo 5: Elecfroforesis 23 3
sente en el gel de resolución (pH 8,O-8,5). Su elevada resolución hace que esta
modalidad sea más empleada que la que se desarrolla en los sistemas de tampón
continuo.
El mecanismo de concentración fué estudiado en 1964 por Davis y Ornstein,
que aplicaron a la electroforesis en geles de PA la teoría desarrollada por Kohl-
rausch (Figura 5.16). Su aplicación al caso de proteínas se describe en las Figuras
5.17 y 5.18.
FIGURA 5.16. Teoría de Kohlrausch. Sea un tubo en el que se sitúa una disolución de un electroli-
to fuerte R (compartimento 1) bajo otra de un electrolito débil A (compartimento S). En disolu-
ción, A y R están disociados: A e a- + N+; R w P- + N+. Sea U a la movilidad electroforética del
ion a- y Up la de B-. Si en el tubo se establece un campo eléctrico, los iones a- y p-migrarán
hacia la zona inferior, con una velocidad V = E . U. En la velocidad influirá los correspondientes
grados de disociación, X, y Xp. Por tanto, V = Es U,. Xa y V = EI Up . Xp: siendo Es y EI el
campo eléctrico en S e 1,respectivamente. E = i/K a, siendo K y a la conductividad y el área del
tubo, respectivamente, e i la intensidad eléctrica. Los valores de i y a son iguales en S que en 1,
puesto que ambas zonas están en serie y no hay pérdidas de carga. Sin embargo la conductividad
es distinta, ya que las disoluciones son diferentes. K viene dada por la expresión K = eZCi . Ui .
Zi, siendo e la carga del electrón, Cila concentración de cada ion, Ui su movilidad electroforéti-
ca, y Zi su carga. Si se establece una diferencia de potencial, tanto a- como p- se moverán hacia
el ánodo. Kohlrausch determinó las condiciones en las que las velocidades de migración (no
movilidades) de a- y P- son iguales. Si a- y P- tuvieran velocidades iguales, las dos disoluciones,
A y R, no se mezclarían. Su superficie de separación se seguiría manteniendo, pero habría des-
cendido hacia el ánodo. Para que V a = VD, habida cuenta que Ca = CN= [A]Xa, y algo análogo
para p-, debe cumplirse que [A]I[R] = U,. Z p . [U, - uN]/Up. Za[Up - UN] (ecuación de Kohl-
rausch). Esta muestra la relación de concentraciones para que a- y p- migren a igual velocidad
hacia el ánodo. Supóngase que se aplica esta ecuación al caso en el que A sea glicocola (Gly) y R
sea KCI, y que el sistema esté a pH 8,O (en este caso N+ no es único, pues habría K+ y H+; no obs-
tante, a este pH, [K+]>> [Hf], por lo que se puede prescindir de este último). Experimentalmen-
te se obtiene que UGly= -15, UCI= -37, y UK = 37. Así, la ecuación de Kohlrausch, en este caso
concreto, se convierte en [Gly]/[KCI] = 0,58. Esto significa que, a pH 8,0, si se coloca una disolu-
ción de Gly en S y una disolución de KCI en I, de forma que la relación de sus concentraciones
molares sea 0,58, se cumple la ecuación de Kohlrausch, y las velocidades de G l y y C1- serían
iguales. Verificar esta situación en un sistema de electroforesis libre es difícil, pero puede hacerse
utilizando un soporte de poliacrilamida.
F IGURA 5.17. Aplicación de la ecuación de Kohlrausch a una mezcla de proteínas. Considerese que las proteínas del
suero humano, cuyas U a pH 8,O están comprendidas entre -0,6 y -0,75, están junto con Gly, en las condiciones
reflejadas en la Figura 5.16. En este caso, UGly= -0,5 < -0,6. Al aplicar el campo eléctrico, las proteínas adelantan a
la Gly- (parte izquierda) y progresivamente ( t = O, t = 1 y t = 2) alcanzan el límite con la zona del CI-. Sin embargo'
no entran en esa zona porque Ucl > -0,6. Las proteínas no tienen otra alternativa que permanecer en el límite ya
que V , < Vp,,,, < VP.Así, como no pueden pasar a la zona del C1- porque se retrasarían, ni a la zona de la Gly- por-
que se adelantarían, lo que se consigue es juntar las proteínas ( t = 2). En la práctica la muestra puede concentrarse
hasta 500 veces, lo cual supone que si se aplican 500 p1 se llegaría a 1 pl, con lo que todas las proteínas parten, prac-
ticamente, del mismo punto.
gel de
concentración
(3,5%)
gel de
resolución CI -
(7,5%)
O O
F IGURA 5.18. Se trata ahora de una situación real en la que la zona de la Gly y las proteínas están aplicadas sobre el
gel de concentración (3,5% de acrilamida), y éste es seguido del gel de resolución (7,5% de acrilamida; pH 8,9). Al
establecer el campo eléctrico las proteínas se concentran en el límite de la zona de la Gly (Figura 5.17). La zona de
contacto proteínas/Gly va descendiendo a través del gel de concentración hasta que llega al gel de resolución. Al
entrar en él, las proteínas disminuyen su velocidad debido al reticulado. En el gel de resolución, a pH 8,9, la movili-
dad de la Gly aumenta porque lo hace su X a este pH, y adelanta a las proteínas (Figura 5.18, derecha). En el gel al
7,5% tiene lugar una auténtica electroforesis de zona. Con las proteínas séricas, la muestra se concentra intensa-
mente y las 5 bandas que se obtenían en un gel de agarosa (Figura 5.8), o de acetato de celulosa (Figura 5.9), se
resuelven ahora en más de 30 bandas.
5.6.7. focalización de los componentes separados: tinción
Finalizada la PAGE hay que separar el gel de las placas de vidrio que habían
servido como molde. Esto se logra haciendo palanca entre ambas placas con una
espátula. Antes de retirar el gel definitivamente, es muy conveniente hacerle una
pequeña marca, o muesca, para poder localizar correctamente cada pocillo (y la
muestra que en él se ha aplicado) durante la manipulación posterior a que se va a
someter el gel. Alternativamente, puede haberse cargado una muestra conocida en
el pocillo de un extremo, para así orientar el resto del gel. Para la visualización de
las proteínas separadas en el gel es necesario precipitarlas y teñirlas (como se ha
mencionado anteriormente). El colorante mas utilizado en PAGE, para proteínas,
es el Azul Coomassie (Coomassie Brilliant Blue R250) y alguno de sus derivados.
Es un compuesto no polar, que posee grupos cargados (-SO;) mediante los que se
une electrostáticamente a las proteínas, aunque también haya otras interacciones.
La disolución de teñido se prepara con el colorante a1 0,1% (p/v) en metanol:agua:
acético (9:9:2; vlvlv). La duración del proceso de tinción es variable (de pocos
minutos a varias horas) y aumenta con el grosor del gel y la concentración de acrila-
mida. Es una práctica común dejar sumergido el gel en la disolución del colorante
durante una noche a temperatura ambiente (20-22 "C), pero el proceso se acorta a
40-50 "C. Tras la tinción, todo el gel aparece con un tono azul intenso, y es necesa-
rio eliminar el exceso de colorante (desteñir el gel) como ya se ha descrito. El resul-
tado final son bandas azules sobre un fondo transparente (Figura 5.19). El Azul
Coomassie permite visualizar 0,1-0,5 pg de proteína por banda. Finalmente, los
geles pueden conservarse en ácido acético a1 7% (vlv).
La tinción mediante sales de plata es un método también muy extendido. Su
principal ventaja es que permite detectar hasta 0,1 ng de proteína por banda, lo que
F I G U R A 5.19. Análisis por PAGE (gel de acrilamida al 7%) de

cinco muestras de proteínas diferentes, tras tinción con Azul Coo-
massie. La proteína H tiene una M de 150 kDa y la B de 90 kDa.
La acción enzimática de D (26 kDa), sobre la proteína B, produce
dos fragmentos, Bb (57 kDa) y otro de 33 kDa. A la derecha se
muestran los marcadores de M (valores en kDa).
supone una sensibilidad al menos 100 veces superior a la tinción con Azul Coomas-
sie. Sin embargo presenta varios inconvenientes. Es más laboriosa y cara. El gel
difícilmente queda con un fondo incoloro. Presenta baja reproducibilidad y algunas
proteínas no se tiñen. Además no es totalmente específico de proteínas, pues tam-
bién tiñe a lipopolisacáridos, ácidos nucleicos y polisacáridos. La tinción con plata
se utiliza, por tanto, cuando la cantidad de muestra disponible sea muy escasa.
Cuando se efectúa esta tinción, la precipitación previa de las proteínas, permite eli-
minar otros compuestos (Gly, detergentes) que pueden unirse a los iones Ag+
dando un fondo coloreado inespecífico. El mecanismo de la reducción del ion plata
Ag' a plata metálica ~ g (en ' lo que se basa esta tinción) no ha sido dilucidado. Es
conocido que participan las cadenas laterales de aminóacidos como Cys, Lys o Met,
y que hay una diferencia en el potencial redox entre las regiones ocupadas por las
proteínas y el resto del gel, lo que induce la reducción de Ag' a A~O,dando una
imagen en positivo. Hay dos procedimientos para llevar a cabo esta tinción, según
que las condiciones iniciales sean básicas (empleando hidróxido sódico y amónico)
o ligeramente ácidas (pH 6,O). En ambos casos se utiliza nitrato de plata, y los iones
Ag , unidos a las proteínas se reducen a plata metálica con formaldehído. No obs-
f
tante, hay multitud de variantes. Un método alternativo más breve (30 min) utiliza
una sola disolución ácida y la energía de la luz para producir la reducción. Sin
embargo tiene menor sensibilidad.
La tinción con plata produce bandas de color marrón grisáceo oscuro con la
mayoría de las proteínas. Variando ligeramente las condiciones de tinción, pueden
generarse colores particulares: azul para las lipoproteínas, amarillo para algunas
glicoproteínas, etc. Esto proporciona una información adicional, pero no son méto-
dos generales ni estrictamente reproducibles.
Un inconveniente de esta tinción es que cantidades iguales de proteínas dife-
rentes no se tiñen con igual intensidad. Algunas proteínas, especialmente las que
poseen pocas Cys, se tiñen muy débilmente o nada. Esta variabilidad se da en
menor medida cuando la PAGE se realiza en condiciones desnaturalizantes. Por
contra, una ventaja notable es que puede hacerse sobre geles previamente teñi-
dos con Azul Coomassie, y la doble tinción es aún más sensible.
Un método, de sensibilidad comparable al anterior, emplea compuestos fluores-
centes que se unen especifícamente a las proteínas. La unión puede realizarse pre-
viamente a la electroforesis o una vez finalizada ésta. La unión previa permite
observar la migración de las bandas a través del gel, pero altera la carga de las pro-
teínas, pues la mayoría de los compuestos fluorescentes utilizados reaccionan con
los grupos E-NH;,de las proteínas. Entre estos compuestos destacan el cloruro de
dansilo, capaz de detectar 10 ng de proteínalbanda, la fluorescamina (3-5
nglbanda), y el MDPF (2-metoxi-2,4 difenil-3(2H)furanona) capaz de detectar 1
nglbanda. Los complejos MDPF-proteína presentan otras ventajas adicionales. Son
muy estables, manteniendo sus características fluorescentes durante meses (en el
caso de la fluorescamina sólo son horas). Además su intensidad de fluorescencia es
lineal en el intervalo de 1-500 ng de proteína, lo que es muy útil con fines cuantitati-
vos. En cualquier caso, esta tinción se utiliza mucho menos que las previamente
descritas, quizás por que su uso requiere disponer de sistemas de iluminación y
seguimiento.
Marcar proteínas con algún radioisótopo, es el método de detección más sensi-

ble actualmente disponible. Además, no excluye a los otros métodos. La detección
de bandas radiactivas en PAGE puede hacerse sobre el gel entero o fraccionándolo
en pequeños trozos. Con el gel completo la detección se lleva a cabo mediante
autorradiografía o fluorografía, en función del radioisótopo utilizado para el marca-
je. Ambas pueden realizarse con los geles húmedos según se obtienen al finalizar la
electroforesis, o tras haberlos secado, que es lo más habitual. Para ello los geles se
tratan previamente con glicerol para evitar que se fragmenten. El secado se realiza
por simple evaporación, colocando el gel húmedo entre dos láminas de celofán y
sometiéndolo a la corriente de aire de un ventilador. O bien, utilizando un secador
de geles, en el que el gel se somete a vacío a elevada temperatura (60-80 "C), colo-
cado sobre una lámina de plástico o de papel Whatmann, quedando el gel-seco
sobre ésta.
E n la autorradiografía, el gel seco impresiona la película, produciéndose bandas
oscuras en las zonas correspondientes a la posición de las proteínas en el gel. La
autorradiografía directa puede hacerse cuando las proteínas están marcadas con
'1, 14c,"s, Ó 3 2 ~Si. el marcaje es con 3 ~e1 proceso
, es muy lento o inexistente y es
preferible realizar una fluorografía (Capítulo 1). Esta se utiliza cuándo los radioisó-
topos utilizados son emisores P débiles ( 3 ~ , ' 4 ~ , 3 ? 3cuyas
) , emisiones no atraviesan
el gel. Este se impregna en una disolución que contenga un fluoróforo, que será
excitado por las partículas P. Los fotones emitidos impresionan la película, dando
una imagen fotográfica de la posición de las proteínas marcadas en el gel. El fluoro-
foro más utilizado es el PPO (2,5-difeniloxazol). También el salicilato sódico es de
amplio uso, pero produce bandas más difusas que el PPO, por lo que su resolución
es peor. Para desarrollar la fluorografía, se sumerge el gel (teñido o no) en una
disolución de dimetilsulfóxido (DMSO) que contiene el PPO. Este se precipita tra-
tando el gel con agua. Posteriormente se pone en contacto con la película fotográfi-
ca, como en el caso de la autorradiografía. Finalmente, mediante detectores elec-
trónicos también pueden localizarse las proteínas radiactivas directamente sobre
los geles húmedos (Capítulo 1).
Como alternativa a todo lo anterior, también puede cortarse el gel en peque-
ños trozos y contarse su radiactividad en un contador apropiado (Capítulo 1).
Los geles en tubo se cortan en rodajas de 1-2 mm, utilizando un bisturí. E n el
caso de las placas, se cortan primero los carriles correspondientes a cada pocillo,
y posteriormente cada carril se trocea en pequeños fragmentos de 1-2 mm.
Además de los métodos generales descritos, hay otros específicos para la detec-
ción de glicoproteínas, fosfoproteínas y lipoproteínas. También pueden detectarse
específicamente aquellas proteínas que posean actividad enzimática (u otra activi-
dad biológica), directamente en el gel (hay algunos métodos descritos para casos
concretos) o cortando las bandas del gel y eluyendolas.
5.6.8. Transferencia a membranas
Finalizada la PAGE, se puede también obtener información acerca de la identi-

dad de las proteínas si éstas se transfieren desde el gel a una membrana (Figuras
238 Técnicas instrumentales d e análisis en Bíoquímica
5.20 a 5.22). El proceso de transferencia se suele denominar blotting (pues un blot-

ting-paper es un papel secante, y en la transferencia se "seca" el gel, al pasar las
bandas a la membrana). Una vez en la membrana, las proteínas están accesibles
(cosa que no ocurre en el gel) para interaccionar con otras moléculas que permitan
su identificación. En la mayoría de los casos se trata de anticuerpos (el procedi-
miento se conoce como immunoblotting), pero también pueden ser lectinas, recep-
tores, ácidos nucleicos o cualquier otro ligando. Incluso, se puede determinar la
secuencia de aminoácidos de las proteínas transferidas a la membrana, o llevar a
cabo digestiones enzimáticas o tratamientos químicos para la obtención de pépti-
dos. Igualmente pueden ser utilizadas como inmunógenos para la obtención de
anticuerpos.
La transferencia de moléculas desde geles a membranas fue originalmente des-
crita por E. M. Southern para el caso de DNA (transferencia de Southern; apartado
5.9.4). Posteriormente se describió para el caso de RNA (se denominó transferen-
cia tipo northern), y, continuando con la misma terminología, la transferencia de
proteínas se denominó tipo western (western blotting). Esta última, en conjunto,
consta de cuatro fases (transferencia, bloqueo de la membrana, unión del ligando, y
detección) que se describen a continuación y en las Figuras 5.20 a 5.22. Conviene
señalar también que el reconocimiento de proteínas inmovilizadas en membranas
con fragmentos de DNA, que posean secuencias específicas para ellas, se conoce
como southwestern, y será tratada posteriormente.
La transferencia puede llevarse a cabo por distintos métodos (por difusión, apli-
cando vacío, por capilaridad); pero, para proteínas separadas en geles de PA, se
-&
suele recurrir a un campo eléctrico que se aplica perpendicularmente al plano del
- peso
1 4 - cristal
p
.
-
-
. - . --
-. . -
-
-
- - - papel absorbente
-
-
-
-
-
-
-
- papel de filtra
FIGURA 5.20. (Parte A), transferen- A - rnernbrana

T i -gel
cia por capilaridad. Las moléculas
embebidas en el gel son arrastradas
hasta la membrana por el tampón papel de filtro
(flechas), que fluye desde el reci- B
-
piente inferior por el papel de fil- CATODO ,placa de grafito
tro. (Parte B), sistema de transfe-
rencia semi-seco. El gel, adyacente
a la membrana, queda emparedado
entre dos conjuntos de papel, limi-
tados por las placas de los electro-
dos. Por la acción del campo eléc- papel whatman
trico, las proteínas migran (elec- placa de grafito
trotransferencia) hacia el ánodo,
desde el gel a la membrana. 1
proteínas
grifa-
I I IIII I I 1 I I
membrana C C CCCC C C 4 CC transferencia
I I I IIII I I I I I
membrana
saturada
F IGURA 5.21. Transferencia de proteínas a membranas (Western blotting). Las proteínas en el gel no están accesi-
bles, mientras que en la membrana pueden interaccionar con moléculas específicas (anticuerpos, lectinas, etc.), lo
que permite su identificación. Finalizada la electroforesis, los geles se equilibran en un tampón de transferencia,
variable según los casos. Aplicando un campo eléctrico, las proteínas migran desde el gel a la membrana (electro-
transferencia; Figura 5.20). La superficie de la membrana no ocupada por las proteínas se bloquea, para evitar la
unión inespecífica de los anticuerpos (u otros ligandos). Para ello se usa seroalbúmina bovina (3-5%, p/v), leche en
polvo desnatada (3%, plv) o el detergente no iónico Tween 20 (0,1%), plv). El método de detección más habitual
emplea anticuerpos específicos (monoclonales o policlonales) frente a la proteína que se pretende identificar. Para
ello, el gel se sumerge en una disolución que lleva los anticuerpos primarios (Acl). Estos no se modifican para no
alterar su capacidad de reconocimiento. Se utiliza un segundo anticuerpo (secundario; Ac2), que se une al primario,
al que se conjugan compuestos que generan sobre la membrana productos coloreados, de tal forma que así se visua-
lice la posición de la proteína de interés. Al anticuerpo secundario pueden unirse sustancias muy diversas: com-
puestos fluorescentes, radioisotópos (frecuentemente lZ51), enzimas, etc. Alternativamente, el anticuerpo secunda-
rio puede sustituirse por proteínas bacterianas que interaccionan específicamente con los anticuerpos primarios
(proteína A y, especialmente, la proteína G, que reconoce a la gran mayoría de las clases y subclases de IgG de gran
número de especies animales). A su vez, éstas proteínas pueden marcarse radiactivamente o unirse a enzimas, al
igual que los anticuerpos secundarios. Entre los métodos de detección más empleados están los que utilizan el anti-
cuerpo secundario unido a una enzima, habitualmente peroxidasa (HRP) o fosfatasa alcalina (AP). Estas enzimas
convierten sustratos solubles en precipitados coloreados, que delatan así las zonas o bandas en las que los anticuer-
pos están unidos. Utilizando diaminobenzidina (DAB) y el 4-cloro-naftol, como sustratos de la HRP, pueden detec-
tarse 50-100 pg de proteína. Con los sustratos de AP, una mezcla de BCIP (5-bromo-4-cloro-indoil fosfato) y azul de
tetrazolio, puede detectarse 10-50 pg de proteína.
gel (electrotransferencia). Hay dos sistemas para llevarla a cabo. En el primero, se

emplea una cubeta similar a las de electroforesis de tipo vertical, en la que los elec-
trodos son un conjunto de hilos de platino. El gel y la membrana están empareda-
dos entre un conjunto de hojas de papel de filtro y láminas de esponja, mantenidas
por un marco o armazón de plástico. En el segundo (denominado sistema semi-
seco), se emplea una cubeta horizontal (Figura 5.20), y los electrodos son placas de
grafito o metálicas; el gel, la membrana y un conjunto de hojas de papel de filtro a
cada lado, quedan emparedados por los electrodos, siendo uno de ellos la propia
membrana saturada
FIGURA 5.22. Transferencia a membranas: detección por quimioluminiscencia. Este es el método más sensible pues
permite detectar < 1 pg de proteína. El reconocimiento de la proteína de interés (P) por el anticuerpo primario
(Acl) lo lleva a cabo el anticuerpo secundario (Ac2). Este puede estar conjugado a peroxidasa (HRP). En presen-
cia de peróxido de hidrógeno, la peroxidasa oxida un compuesto fluorescente (luminol) que emite fotones. La
intensidad de la emisión puede incrementarse 1.000 veces en presencia de derivados fenólicos potenciador que se
incluyen en el tampón de la reacción. La emisión de fotones es detectada por autorradiografía. Un sistema similar
emplea anticuerpos unidos a fosfatsa alcalina. Esta desfosforila a un compuesto conocido abreviadamente como
AMPPD, lo que desestabiliza a la molécula, que emite fotones de 477 nm, que se detectan como en el caso anterior.
base de la cubeta. El sistema semi-seco es más utilizado porque presenta varias

ventajas: mejor eficacia de transferencia, utiliza voltajes más reducidos (necesita
menor refrigeración), es más rápido, y permite la transferencia de varios geles si-
multáneamente.
La primera membrana utilizada para transferencias fue de nitrocelulosa. Esta
posee una buena capacidad de unión de proteínas (250 pg/cm2), y hay variedades
con distintos grados de porosidad (según el tamaño de las proteínas a transferir), y
modificadas para evitar la fragilidad que adquieren al secarse. Las proteínas que-
dan unidas de modo no covalente, mediante interacciones electrostáticas e hidrofó-
bicas. Las membranas de naturaleza hidrofóbica (difluoruro de polivinilideno o
PVDF), recientemente desarrolladas, presentan ventajas sobre las de nitrocelulosa.
Retienen mayor cantidad de proteínas, son compatibles con la mayoría de los siste-
mas de detección, y mecánicamente son más estables. Además presentan una gran
resistencia química a los reactivos utilizados para la caracterización estructural de
proteínas.
5.6.9. Caracterización de bandas. l a PAGE como criterio de pureza
Una vez teñido un gel de PA, la imagen que se obtiene es un conjunto de ban-
das coloreadas sobre un soporte transparente (Figura 5.23). Su análisis permite
- - - -
1 2 3 g'.el
- --
,proteínas
-
-
F IG U R A 5.23. Caracterización de bandas en PA-
GE. LI, L2, L3... son las distancias migradas por
- --marcador
las diferentes proteínas y L' por el marcador de
electroforesis.
identificar el número mínimo de componentes (bandas) de cada muestra. Cada

banda se caracteriza por su movilidad electroforética relativa (U,), U, =
L(muestra)lL'(marcador), siendo L y L'las distancias recorridas por la muestra y
el marcador de electroforesis, respectivamente (Figura 5.23).
La PAGE es un criterio de pureza negativo, pues permite saber si una muestra
no es homogénea (aparecen varias bandas en el gel; Figura 5.23, carriles 1 y 3), pero
no permite establecer que lo sea. La presencia de una única banda (carril 2, Figura
5.23) indica que todas las moléculas de la muestra presentan la misma U, pero allí
pueden coexistir proteínas distintas.
5.6.10. Estimación de masas moleculares de proteínas por PAGE

en condiciones no desnaturalizantes. Representaciones de Ferguson
En PAGE, la U de una proteína depende de su carga neta y de su tamaño. Si se

elimina la influencia de la carga (condiciones desnaturalizantes, que se tratarán
posteriormente), U dependerá exclusivamente del tamaño, representado por el
radio molecular (r, radio de Stokes). Pero, también en condiciones no desnaturali-
zantes la PAGE puede utilizarse para la estimación de masas moleculares, M, de
proteínas. Si se determina la U, de una proteína, analizándola en una serie de geles
de diferente concentración de acrilamida, (% T), y se representa el log U, frente a
(% T), que determina el tamaño del poro, se obtiene una línea recta (representación
de Ferguson; Figura 5.24) cuya ecuación es:
en la que U, es movilidad electroforética relativa, y log Yoes la intersección con el

eje de ordenadas (Y,, sería la movilidad electroforética a concentración de acrilami-
da nula, y equivaldría a una estimación de la que tendría la proteína en electrofore-
sis libre; apartado 5.1). KR es la pendiente de cada recta. Obsérvese que cada una
FIGURA5.24. Representaciones d e Ferguson. (A) Las líneas correspondientes a las proteínas 1 y 2 son paralelas.
Las proteínas tienen el mismo tamaño (igual K R ) pero diferentes movilidades. Es el caso de diversas isoenzimas
(como la láctico deshidrogenasa) o variantes de carga (como algunas hemoglobinas). (B) Líneas con igual Yo: las
proteínas tienen igual densidad d e carga c idéntica U en electroforesis libre, pero diferente masa molecular. Es la
situación que ocurre en PAGE-SDS (apartado 5.6.13). (C) Líneas con distinta Yo que no se cruzan: la proteína con
mayor Yo (mayor densidad d e carga) posee menor tamaño. (D) Líneas con distinta Yo que se cruzan: la proteínz
con Yo mayor es la de mayor tamaño.
de ellas se caracteriza por unos valores de KRe Yo, y relaciona la movilidad electro-
forética de la proteína con el tamaño del poro del gel, sin que influya para nada la
carga eléctrica, que siempre es la misma. Por ello, KR es una medida de como se
retarda la proteína al avanzar a través del gel, en función de su M e independiente-
mente de su carga. Es, por tanto, un coeficiente de retardo directamente relacionado
con el tamaño molecular. Utilizando un conjunto de proteínas patrón de M conoci-
do, puede construirse una recta de calibrado, representado M frente a KR. Así.
puede estimarse el valor de M de una proteína a partir de su KR,analizándola en
geles de PA con distintos valores de (% T), por interpolación en la anterior recta de
calibrado. Para una determinación precisa de KR,la proteína debe analizarse en, al
menos, cinco geles de diferente concentración de acrilamida. Este método presenta
el inconveniente de que sólo es aplicable a proteínas globulares, como lo son las
proteínas patrón usadas para la construcción de la recta de calibrado, pues todas
han de tener la misma forma, grado de hidratación y volumen específico parcial.
Esto excluye del análisis a algunas proteínas (especialmente glicoproteínas, lipo-
proteínas y proteínas fibrosas elongadas), pero es válido para muchas otras, exis-
tiendo una relación lineal entre KRy M en un intervalo de 40.000-400.000 Da.
5.6.111. PAGE preparativa
Cuando la PAGE se quiere desarrollar a escala preparativa (separación de mg

de muestra), se suelen utilizar columnas de vidrio de longitud variable (10-20 cm; a
mayor longitud mejor resolución) y diámetro entre 1,O-2,5 cm (Figura 5.25). A
F IGURA 5.25. PAGE preparativa. (Parte A ) , el gel de PA se sustenta sobre una placa porosa, situada en la parte
inferior de la columna de vidrio, que suele estar rodeada de una camisa de refrigeración. Los electrodos (+,-) van
situados en ambos extremos del soporte. La entrada del tampón, por (a), arrastra a las proteínas según van saliendo
del gel, y las dirige, a través de (b), a un espectrofotómetro de flujo continuo que genera el perfil de absorbancia
(parte B), y posteriormente a un colector de fracciones (parte C), que va recogiendo las proteínas separadas. El
contenido proteico en cada fracción recogida se puede deducir a partir de su absorbancia.
pesar de los multiples diseños de cubetas aparecidos en los últimos años, ninguno
ha sido plenamente satisfactorio y su utilización está muy poco extendida. Las gran-
des cantidades de muestra y la difusión de las bandas, especialmente a la salida de
la columna del gel, hacen que la resolución de la PAGE preparativa sea inferior a la
de la analítica. Recientemente han aparecido equipos de PAGE preparativa auto-
matizados, que han solucionado parte de los problemas de los aparatos iniciales,
pero su elevado coste y la posibilidad de métodos alternativos ha restringido mucho
su utilización.
5.6. 12. PAGE en condiciones desnaturalizantes
En presencia de algunos compuestos químicos las proteínas pierden su estructu-

ra nativa. Tales compuestos, agentes desnaturalizantes, producen el desplegamiento
de la proteína que aparece así sin la organización tridimensional característica de su
funcionalidad biológica. En algunas proteínas hay puentes disulfuro, enlaces cova-

lentes formados por la oxidación de dos grupos -SH de la cadena lateral de resi-
duos de Cys. Estos enlaces pueden establecerse de modo intracatenario (entre re-
siduos de una misma cadena polipeptídica) o entre distintas cadenas polipeptídicas
(intercatenarios), en algunos casos de proteínas con estructura cuaternaria. Todos
estos enlaces se pueden romper mediante tratamiento con agentes reductores como
el P-mercaptoetanol (P-ME) ó el ditiotreitol (DTT). La combinación de agentes
desnaturalizantes y reductores es la que se emplea para conseguir las condiciones a
las que se refiere este apartado.
Aunque hay un gran número de agentes desnaturalizantes de proteínas, para
PAGE se utilizan fundamentalmente la urea y diversos tipos de detergentes. La
urea interfiere con las interacciones hidrofóbicas de las proteínas. A elevadas con-
centraciones de urea (8 M), muchas proteínas se encuentran totalmente desnatura-
lizadas, particularmente si además han sido reducidos sus puentes disulfuro. La
urea debe incluirse en el tampón de la muestra y en todos los que se empleen para
la preparación de los geles. Puede utilizarse una menor concentración de urea en el
tampón del gel (por ejemplo 4 M) que en el de la muestra (6-8 M), y no es necesa-
rio añadirla en el tampón de los reservorios. La urea se descompone con el tiempo,
produciendo cianato (HCNO; su concentración en urea 8 M es 0,02 M, y se elimina
con resinas cambiadores de aniones; Capítulo, 6), particularmente en disolución a
pH básico y a alta temperatura. Este reacciona con los grupos E-NH2 de las Lys,
bloqueando su carga positiva (reacción de carbamilación) y alterando la carga total
de la proteína. Por ello, una muestra de proteínas en presencia de urea no debe
calentarse.
La PAGE en urea tiene dos aplicaciones principales. La primera es la separa-
ción de una serie de proteínas peculiares, como las histonas (muy básicas), para las
que se combina el uso de la urea con medios ácidos donde son muy solubles. Tam-
bién se utiliza para otras proteínas nucleares, así como para las proteínas ribosoma-
les. Estas proteínas tienen una gran tendencia a agregar y son insolubles, excepto
en presencia de agentes disociantes. Se han desarrollado varios sistemas, combinan-
do la presencia de urea con medios ácidos (acético1urea) o con detergentes iónicos
(dodecilsulfato sódico, SDS) o no iónicos (Tritón X-100) (sistema Tritón/ácido/
urea), aunque se obtiene mejor resolución mediante geles bidimensionales (aparta-
do 5.8).
La segunda aplicación está orientada al análisis conformacional de proteínas.
Se utilizan geles con un gradiente transversal de urea, a lo ancho del gel (Figura
5.26). La proteína se aplica a todo lo ancho del gel (no se utilizan pocillos). Las
moléculas situadas en la parte izquierda, al empezar a migrar, se encuentran con
una baja concentración de urea, mientras que las situadas en la derecha se
encuentran con una concentración elevada (8 M) que las desnaturaliza totalmen-
te (a mayor concentración de urea mayor desnaturalización de la proteína). Las
moléculas no desnaturalizadas (izquierda, Figura 5.26), migran más rápidamente
que aquellas que sí lo están (derecha, Figura 5.26), obteniéndose una banda con-
tinua de proteína, de distinta movilidad a la ancho del gel. La variación en U
(disminución) es una indicación del grado de desnaturalización. Puede así obte-
nerse información acerca del proceso de desnaturalización. Distintas proteínas
pH 4.0
proteína
F IGURA 5.26. PAGE en un gradiente transversal de urea. La
.
movilidad electroforética de la proteína decrece según aumen-
ta la concentración de urea (de izquierda a derecha), debido a
la desnaturalización de la molécula. Por ello resulta una banda
como la representada por la Iínea negra. El intervalo de con-
centraciones de urea en el que se produce el cambio brusco en
movilidad corresponde al de desnaturalización de la proteína.
En el ensayo se incluye una proteína de referencia, que se
OM urea 8M afecta muy poco por la urea (Iínea gris). A pH distinto del
indicado, el perfil de la banda de proteína puede variar.
tienen una susceptibilidad diferente a la desnaturalización por urea y, por tanto,

puede conocerse su estabilidad conformacional.
También los detergentes son agentes desnaturalizantes. Afectan a la estructura
nativa de las proteínas y a las interacciones con otras moléculas (proteínas, Iípidos,
etc.). Por ello son muy utilizados para la solubilización y disociación de proteínas. Las
interacciones hidrofóbicas en la proteína son sustituidas por interacciones detergente-
proteína, y ésta se desnaturaliza. Existen tres tipos principales de detergentes, en fun-
ción de su carga y de su capacidad desnaturalizante. Los detergentes no iónicos son
débilmente desnaturalizantes y no alteran la carga de las proteínas a las que se unen.
Se pueden utilizar en geles con urea y en electroenfoque (apartado 5.7). El Tritón X-
100 y el octilglucósido son los más empleados, particularmente para solubilizar proteí-
nas de membrana. Se utilizan a concentraciones de 0,l-3,0% (plv) y deben incluirse
en el tampón de la muestra y en el del gel. Entre los detergentes iónicos, unos poseen
carga positiva (catiónicos) como el CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio) y se usan
para la separación de proteínas muy ácidas o muy básicas. Otros de uso mucho más
generalizado, poseen carga negativa (aniónicos) y un caracter fuertemente desnatura-
lizante. El SDS (dodecilsulfato sódico o lauril sulfato sódico) es el detergente de
mayor uso. La PAGE en presencia de SDS (PAGE-SDS) es muy utilizada para el
análisis de proteínas, por lo se le dedica un apartado exclusivo. Los detergentes anfóte-
ros son débilmente desnaturalizantes y no afectan a la carga de las proteínas. Algu-
nos, como el CHAPS (3-(cloroamido propi1)-dimeti1amonio)-l-propanosulfato),solu-
bilizan muy bien las proteínas de membrana. Al ser, además, compatibles con la
utilización de urea, su uso es frecuente como alternativa a los detergentes no iónicos.
5.6.13. PAGE-SDS
Al inicio del capítulo se comentó que la electroforesis no permitía el cálculo de
parámetros moleculares, por no existir una relación entre éstos y U. La PAGE-SDS
es una excepción, pues los complejos SDS-proteína se separan estrictamente según
su tamaño molecular y, así, es posible estimar su masa molecular. El SDS interaccio-
na con la gran mayoría de las proteínas formando complejos con características
comunes, independientemente de las de cada proteína. En presencia de una concen-

tración de SDS superior a 8 mM, las proteínas unen 1,4 g de SDS por gramo de pro-
teína, lo que equivale a la unión de una molécula de SDS por cada dos aminoácidos.
Las cargas propias de las proteínas quedan así enmascaradas o anuladas. Como cada
molécula de SDS proporciona una carga negativa (del grupo SO,), los complejos
proteína/SDS están cargados negativamente de forma uniforme. Una proteína que
tuviera 100 aminóacidos uniría 50 moléculas de SDS y tendría 50 cargas negativas.
Otra con 200 aminóacidos tendría 100 cargas negativas. La carga por unidad de masa
es prácticamente constante para todos los complejos proteína/SDS. Hidrodinámica-
mente todos se comportan como elipsoides prolatos, de unos 18 A de diámetro
menor, independientemente de la proteína de que se trate. Solo difieren en su longi-
tud, acorde con el tamaño de cada proteína. La U en PAGE es función del tamaño
(por el efecto de tamizado molecular que produce el gel) además de serlo de la carga
por unidad de masa. Como ésta es constante para todos los complejos proteína/SDS
que, además, tienen la misma forma, su U será sólo función de la masa molecular, M.
La separación ocurre sólo como resultado del tamizado molecular a través del gel, de
manera que cuanto menor sea la masa mayor será U, y viceversa.
E n resumen, (1) la gran mayoría de las proteínas es soluble en SDS. (2) Si tam-
bién se tratan con agentes reductores, sólo quedan presentes cadenas polipeptídicas
individuales. (3) Todos los complejos proteína-SDS tienen carga negativa y migran.
por tanto, en el mismo sentido. (4) Además, su densidad de carga es muy elevada.
por lo que su velocidad de migración también lo es y las electroforesis son muy
rápidas. (5) La separación depende de un parámetro físico-químico, la masa mole-
cular, que se puede calcular. (6) Los complejos proteína-SDS se tiñen fácilmente.
Por todo ello, la PAGE-SDS es la electroforesis más utilizada para el análisis de
proteínas.
La preparación de la muestra es de la máxima importancia para asegurar que
todo lo anterior se cumple. Al tampón en el que va disuelta la muestra (Tris/HCI
0,05 M, pH 6,8), se añade un exceso de SDS (2% plv). Para facilitar la unión a las
proteínas, la muestra se calienta (100 "C) durante al menos 3-5 minutos, y opcional-
mente se añade P-ME (5%, v/v) ó DTT (20 mM) si se requieren condiciones reduc-
toras (éstos no deben incluirse en los tampones de preparación del gel, pues inter-
fieren en la polimerización de la acrilamida). Con el fin de incrementar la densidad
de la disolución de la muestra, se le añade glicerol o sacarosa al 10% (p/v), y como
marcador Azul de Bromofenol al 0,001% (p/v). La cantidad de muestra a aplicar
depende de la sensibilidad de la tinción que se vaya a utilizar. Con geles de 1,5 mm
de espesor (20 x 20 cm) y tinción con Azul Coomassie, 1-10 pg de cada proteína son
cantidades adecuadas. Más de 100 pg de proteína total por pocillo, suponen una
sobrecarga del gel, especialmente cuando hay algún componente en exceso sobre
los demás. El SDS debe incluirse en el tampón de los reservorios, en los de los geles
(de concentración y de resolución), y en el de muestra, para mantener las condicio-
nes disociantes.
La electroforesis puede desarrollarse en un sistema de tampón continuo y gel
de una concentración homogénea, pero lo habitual es utilizar sistemas discontinuos
por sus ventajas ya descritas. El mecanismo de concentración que opera en estos
casos varía ligeramente de lo descrito para condiciones no desnaturalizantes. Como
los complejos proteína/SDS tienen la misma densidad de carga y el gel de concen-

tración no es restrictivo, todos migran con idéntica U, concentrándose automática-
mente.
La PAGE-SDS puede realizarse en condiciones reductoras o no reductoras. La
ausencia de reductores se traduce en que, si las proteínas poseen puentes disulfuro,
el SDS sólo producirá una desorganización parcial de la estructura (Figura 5.27). Si
son dos o más cadenas unidas por puentes disulfuro intercatenarios, en presencia
de SDS, quedarán más o menos desplegadas en función de la posición de los disul-
furos.
E n las Figuras 5.27 y 5.28 se esquematizan varios casos de proteínas con puen-
tes disulfuro de distintos tipos, que ilustran estas situaciones.
proteína nativa
(no disulfuro)
(disulfuro intracatenario)
FIGURA 5.27. Efecto del SDS y el DTT en la Urde proteínas monoméricas. En una proteína nativa de 25 kDa, caren-
te de puentes disulfuro, el tratamiento con SDS (línea quebrada con el signo -) o SDS + DTT, producen idéntico
resultado: una banda en el gel (rectángulo vertical) en la posición correspondiente a la M de la proteína, 25 kDa. El
SDS despliega la proteína convirtiéndola en una molécula aproximadamente lineal. La proteína con un disulfuro
intracatenario, en presencia de SDS, se desnaturaliza parcialmente, manteniendo sin desplegar la zona que abarca el
disulfuro. La proteína se comporta como si fuera de menor tamaño, apareciendo en la posición correspondiente a un
valor de M de 22 kDa. Cuanto mayor sea el segmento englobado por el disulfuro (cuanto más distantes estén en la
estructura primaria las Cys que lo forman), mayor es el cambio observado en la posición de la banda. En trazo dis-
continuo se señala la posición de 25 kDa. El tratamiento con SDS + DTT rompe el enlace disulfuro y permite el des-
pliegue total de la proteína, que aparece en la posición correspondiente a 25 KDa. El cambio de posición de la
banda, con ambos tratamientos, permite identificar la presencia de uno (o más) puentes disulfuro intracatenarios.
(no disulfuro)
(disulfuro intercatenario)
(disulfuro inter e intracatenario)
F I G U R A 5.28. Efecto del SDS y del DTT en la Ur de proteínas oligoméricas. (Parte superior): representación de un2
proteína dimérica, de 25 kDa cada subunidad. La adición de SDS (línea quebrada con el signo -) separa sus subuni-
dades, suprimiendo las fuerzas no covalentes (en punteado) entre ellas. Sobre cada subunidad, el efecto es el descri-
to en la Figura 5.27. En el gel se observa una sola banda en la posición de 25 KDa. El resultado es idéntico con SDS
+ DTT, al no haber puentes disulfuro. (Parte central): dímero con un puente disulfuro intercatenario. El SDS des-
pliega las subunidades que, mantenidas por el disulfuro, aparecen en el gel como una banda de unos 50 kDa. El tra-
tamiento con SDS + DTT reduce el disulfuro y despliega cada subunidad (idénticas), obteniéndose una sola bando
de 25 kDa. (Parte inferior): la proteína tiene, en este caso, además, un enlace disulfuro intracatenario en cada subu-
nidad. El SDS despliega parcialmente cada subunidad. La banda aparece en la posición correspondiente a 44 kDz
debido a la presencia del disulfuro intercatenario. El tratamiento con SDS + DTT destruye ambos tipos de disulfu-
ro, apareciendo, nuevamente, una única banda a 25 kDa.
5.6.14. Estimación de masas moleculares de proteínas por PAGE-SDS
Como ya se ha indicado, el SDS, junto con tratamiento con agentes reductores.

elimina las diferencias de carga y de forma de las distintas proteínas y minimiza sus
posibles diferencias en volumen específico parcial e hidratación. E n estas condicio-
nes, si se representan los valores de log M frente a U, de un conjunto de proteínas.
se obtiene una relación lineal (Figura 5.29). Puede utilizarse eqtonces un conjunto
F IGURA 5.29. Representación semilogarítmica que muestra la

relación entre Ur y M de proteínas en PAGE-SDS (%T = 10).
Los puntos representan proteínas de masa molecular conocida,
en un intervalo de 14-70 kDa.
de proteínas de masa molecular conocida (marcadores de M), y someterlo a

PAGE-SDS en el mismo gel en el que se analicen también las proteínas cuya M se
desea conocer (Figura 5.30). El análisis se efectúa en la misma placa de PA para
asegurar iguales condiciones para todas las proteínas (patrones y problema), garan-
tizando la validez del resultado.
Es importante señalar que la relación lineal entre log M y U, se mantiene para
una concentración dada de acrilamida (% T), y sólo en un corto intervalo de M. De
forma estimativa, en geles del 15 (% T), la relación lineal es válida para proteínas
con M comprendida entre 12.000 y 45.000 Da; en geles del 10 ( % T ) ,el intervalo
F IGURA 5.30. Cálculo de masas moleculares de proteínas por PAGE-SDS. En el gel, los marcadores de M (1-5), apli-
cados en el pocillo A, avanzan acorde con su M (en orden decreciente de 5 a 1). La representación de log M frente a
Ur produce una línea recta. El M de la proteína X (carril B) se obtiene interpolando su Ur en la recta patrón.
lineal va de 15.000 a 70.000 Da, y en los de un 5 (% T), de 25.000 a 200.000 Da. Pue-
den obtenerse comercialmente conjuntos de proteínas marcadoras que cubren una
amplia gama de M (5.000 a 200.000 Da).
Sin embargo, hay proteínas con un comportamiento anómalo en PAGE-SDS.
Las glicoproteínas y las lipoproteínas, que llevan unidos azúcares o lípidos, respecti-
vamente, son los ejemplos más representativos. La parte no proteica, que puede
constituir una proporción importante de la masa total, no une SDS y puede impedir
el acceso del mismo a la proteína. Así, las glicoproteínas unen menos SDS que la
mayoría de las proteínas. Esto hace que la relación carga/tamaño de estos complejos
sea menor, y también su U,, con lo que se comportan como si tuvieran una M mayor.
También se observa un comportamiento anormal en proteínas muy básicas o muy
ácidas, cuya carga intrínseca no queda totalmente enmascarada por el SDS, o éste no
se une en las zonas de elevada carga.
El empleo de gradientes lineales de PA evita, en parte, estos inconvenientes,
pues esos casos particulares suelen pasar a comportarse ya de modo homogéneo,
aunque las razones no estén bien explicadas. En PAGE-SDS desarrollada en gra-
diente de PA, la relación lineal se establece ente el log M y el log (% T ) (Figura 5.31).
En estos casos el procedimiento de estimación de M es similar al ya descrito, cons-
truyendo una recta de calibrado con proteínas marcadoras de M conocido. La distan-
cia migrada por cada proteína sirve para conocer, no su U, sino el (% T ) hasta el que
ha llegado, mediante una sencilla relación de proporcionalidad, al ser el gradiente
lineal. La única dificultad del método reside en la preparación de los geles en gra-
diente de forma reproducible. Por ello es esencial analizar en una misma placa las
proteínas marcadoras y las proteínas de M desconocida.
F IGURA 5.31. Relación doble logarítmica de M y %T en

geles de PA en gradiente, para una serie de diferentes
proteínas (puntos).
5.7. Electroenfoque
El electroenfoque (EEF) es un tipo particular de electroforesis en la que los

compuestos anfóteros (esencialmente se usa para el análisis de proteínas) se sepa-
Cap;tulo 5: Electroforesis 25 1
ran según su punto isoeléctrico, pI (pH al cual su carga neta es nula), en un gradien-
te continuo de pH. La carga neta de una proteína es función del pH (Figura 5.32).
A valores de pH > pI la proteína está cargada negativamente, mientras que a valo-
res de pH < pI su carga es positiva, siendo cero cuando pH = pI. En ésto es en lo
que se basa el electroenfoque. En un soporte en el que se hubiera establecido un
gradiente continuo de pH, al aplicar un campo eléctrico, las proteínas migrarían
según su carga neta, hasta alcanzar la zona de pH en la que ésta se anulase (pI).
Cada proteína se detendría en ese punto particular y quedaría focalizada (concen-
trada) en una estrecha banda.
F IGURA 5.32. Curva de titulación de una proteína.

Representación de la variación de la carga neta (Q)
de una proteína en función del pH. El pI (5,s en
este ejemplo) corresponde al pH al que Q = O. La
forma de la curva puede ser característica de la pro-
tei'na. La proteína más ácida descrita es una glico-
proteína de chimpancé (pI = 1,8). La más básica es
la lisozima de placenta humana, cuyo pI es 11,7.
Supóngase que se ha establecido un gradiente de pH, de pH 2 a pH 10, a lo

largo de un soporte (Figura 5.33), sobre el que va a actuar un campo eléctrico. El
polo (+) se sitúa en la zona de pH ácido (pH 2) y el negativo (-) en la zona de pH
básico (pH 10). Situemos la muestra, compuesta por dos proteínas (proteína A, pI
= 6,O; proteína B, pI = 7,0), en el extremo de pH 2. Al establecer el campo eléctrico,
como ambas están a un pH < pI, tendrán carga positiva (Figura 5.32) con lo que
tienden a moverse hacia el polo (-). Cuando la proteína A llega a la zona del gra-
diente con pH 6,0, su carga es nula y su movilidad también, quedando allí detenida.
La proteína B sigue desplazándose, porque a pH 6,O está por debajo de su pI (7,O) y
sigue teniendo carga negativa. Cuando alcanza la zona del gradiente con pH 7,O su
carga neta será cero y su movilidad nula, por lo que allí se detiene. Las dos proteí-
nas se han separado en función de su pI.
Supóngase que la muestra (proteínas A y B) se aplica ahora en la zona de pH
básico (pH lo), junto al cátodo. Allí, pH > pI, por lo que ambas proteínas tendrán
carga negativa, y se desplazarán hacia el polo (+) bajo la acción del campo eléctri-
co. Cuando la proteína B llegue a la zona de pH 7,0, su carga neta se hace cero
(está en su pI) y se detiene. La proteína A continuará hasta la zona de pH 6,O. En
suma, el resultado es idéntico al anterior, e igual hubiera ocurrido si la muestra
hubiera ocupado la totalidad del soporte electroforético (Figura 5.33). Esto pone
de manifiesto que el EEF es un proceso en el que se alcanza el equilibrio, y no es
dependiente del punto de aplicación de la muestra.
252 Técnicas instrumentalesd e análisis en Bioquímica
O muestra O O
P H ~
pH7
F IGURA 5.33. La zona de aplicación de la muestra (proteínas A y B) en E E F no afecta al resultado de la separa-

ción. La aplicación en la zona ácida (parte izquierda), básica (parte central) o a lo largo del soporte (parte dere-
cha), conduce en todos los casos al mismo resultado.
E n todos los métodos electroforéticos previamente descritos, la difusión es un

fenómeno con efectos negativos, que tiende a ensanchar las bandas, disminuyendo
la resolución. En E E F el efecto de la difusión es mínimo y por ello posee una enor-
me resolución, pudiendo llegar a separar proteínas que difieran en 0,001 unidades
de pI. Ello se debe a que, si una proteína focalizada en su pI se desplazase por difu-
sión, adquiriría carga, positiva o negativa según hacia el polo que lo haga, y por
efecto del campo eléctrico volvería a la zona de su pI. Esto es el llamado efecto
focalizante del E E F y explica la elevada resolución que posee.
Por otro lado, en E E F la resolución aumenta al reducir el intervalo del gradien-
te de pH. Supóngase que la muestra anterior se analiza en un gradiente más reduci-
do, entre pH 5 y p H 7, por ejemplo. La separación de las bandas se incrementa
notablemente (Figura 5.34). Además, si se aumentase la longitud del soporte, nue-
vamente se lograría una mejor resolución.
Sea como fuere, el disponer de un gradiente estable de pH es lo esencial del
EEF. Para ello se emplean compuestos anfóteros de baja masa molecular, llamados
anfolitos (anfolitos portadores). Son poliaminas de ácidos policarboxílicos, con
abundantes grupos ácidos y básicos. Sus pI abarcan un amplio intervalo, que va
desde 2,5 a 11,O. Su capacidad de tamponación, en la cercanía de su pI, es elevada.
Además presentan una gran solubilidad, incluso en su pI. Su masa molecular (el
promedio es de 750 Da) es muy inferior a la de las proteínas, por lo que son fácil-
mente separables, y no interaccionan con ellas. Por último, incluso en su pI mues-
tran una buena conductividad. Por todo ello, son compuestos idóneos para el esta-
blecimiento de gradientes de pH estables para el desarrollo de un EEF.
Una disolución de una mezcla de estos anfolitos, cuyos pI cubran un cierto
intervalo de pH, tendrá un p H próximo al promedio de los pI. Si esta disolución se
F IGURA 5.34. Incremento de la resolución

en E E F al reducir el intervalo de pH (los
símbolos son los mismos de la Figura ante-
rior). En un gradiente extendido (pH 2 - pH
10) la resolución de dos proteínas A y B, con
pI próximos, es baja. En un gradiente redu-
cido (pH 5 - pH 7) la resolución incrementa
notablemente.
emplea para la preparación de un gel de poliacrilamida, al aplicar una diferencia

de potencial, cada molécula de anfolito migrará hacia uno u otro polo en función
de su carga, hasta alcanzar la zona de su pI. Como las moléculas tienen capacidad
tamponadora, el pH de esa zona será el del pI correspondiente. Cuando se alcanza
el equilibrio, queda formado un gradiente de pH a lo largo del gel. El gradiente de
pH, por tanto, se genera y se mantiene, por el establecimiento de un campo eléc-
trico. Si debido a la difusión, los anfolitos abandonasen la zona de su pI, adquirirían
carga y experimentarían el efecto focalizante antes mencionado. Así, siempre se
mantiene estable el gradiente de pH mientras exista una diferencia de potencial
entre los electrodos. También el gel de PA contribuye a la estabilización del gra-
diente, al restringir la difusión de todas las moléculas.
Los gradientes de pH generados en algunos soportes, como los geles de PA,
muestran el fenómeno de la deriva catódica. Esta consiste en que el gradiente se
hace inestable con el tiempo y se desplaza, junto con las proteínas, hacia el cátodo.
Esto se debe fundamentalmente al flujo electroendosrnótico. Se había indicado que
los geles de PA carecían de este efecto; pero pueden llegar a presentarlo si hay una
contaminación de ácido acrílico (poco probable si se emplea acrilamida de suficien-
te pureza), o si se producen desamidaciones (a pH extremo y durante un tiempo
prolongado, siempre ocurren), o si quedan en el gel moléculas con carga negativa
procedentes de los catalizadores de la polimerización. En una electroforesis con-
vencional todo ésto no tiene trascendencia, pero en EEF sí puede tenerla, pues la
duración del proceso es mayor que la de una electroforesis convencional.
La deriva catódica puede evitarse variando la naturaleza química del gel o utili-
zando gradientes de pH inmovilizados. En el primer caso se usan derivados de acri-
lamida (como el 3-dimetilaminopropil metacrilamida) que posee cargas que contra-
rrestan las negativas, neutralizando en parte el efecto electroendosmótico. En lo
referente a los gradientes inmovilizados, éstos se forman simultáneamente con el
gel, copolimerizando con la acrilamida los compuestos químicos que establecerán el
gradiente. Así, las moléculas que forman el gradiente están fijas sobre las propias
fibras de la poliacrilamida. Los compuestos utilizados para este fin tienen la estruc-
tura general CH,=CO-NH-R (el doble enlace le permite incorporarse a las cade-
nas de poliacrilamida), dónde R varía entre tres grupos ácidos débiles (con pK de
3,6,4,4 ó 4,6) y cuatro grupos amino terciario (con pK de 6,2,7,0, 8,5 y 9,3). E n con-
junto, se abarca así un intervalo de pH 3-10, aunque puede extenderse hasta pH 2 y
12, añadiendo otros compuestos con pK extremos. Estos gradientes tienen la venta-
ja adicional de que son muy estables, pero tienen el inconveniente de que la prepa-
ración del gel es más compleja y el desarrollo del E E F necesita tiempos y voltajes
mayores que cuando se emplean anfolitos.
5.7. l . Electroenfoque analítico
La variedad de E E F más utilizada es la analítica, e implícitamente es a la que

se ha venido aludiendo. El gel se prepara a partir de una disolución de acrilamida
y bisacrilamida en agua, a la que se añaden los anfolitos. Deben utilizarse reacti-
vos de la máxima pureza para evitar al máximo el efecto electroendosmótico.
Como las proteínas van a ser focalizadas en la zona de su pI, no es necesario el
efecto de tamizado molecular del gel. Por ello se usan pequeñas concentraciones
de acrilamida (3-5 % T), para facilitar la movilidad. La preparación de la placa de
PA es idéntica a Ia descrita para PAGE. También puede llevarse a cabo e n cube-
tas horizontales, en cuyo caso la preparación de los geles difiere ligeramente. E n
este caso los geles son de muy poco grosor (< 0,5 mm), y se polimerizan sobre
láminas de plástico tratadas especialmente para que se adhiera el gel. La lámina
de plástico se pega a una de las placas de vidrio, y posteriormente se ensambla el
conjunto de los espaciadores y la segunda placa. Esta puede llevar pequeños seg-
mentos (de forma rectangular) de cinta adhesiva pegados en uno de sus extremos.
Al polimerizar la PA alrededor de ellos, quedarán formados los pocillos de apli-
cación de la muestra. Al finalizar la polimerización y separar las placas, el gel de
PA queda formado sobre la lámina de plástico. Estos geles pueden adquirirse
comercialmente listos para su uso.
El E E F puede llevarse a cabo en condiciones que preserven el estado nativo de
las proteínas, o en condiciones desnaturalizantes/disociantes. E n el primer caso, el
gel de PA contiene exclusivamente anfolitos, mientras que en el segundo se incor-
pora, además, urea (8 M, libre de cianatos) o detergentes no iónicos o anfóteros
(nunca detergentes iónicos como el SDS).
Si se analizan mezclas complejas de proteínas conviene utilizar gradientes
extendidos de pH (3-lo), y posteriormente reducir el intervalo de p H a una ó dos
unidades para determinar con exactitud el pI de aquellas de interés.
Para gradientes extendidos, en el reservorio del ánodo (+) se coloca una disolu-
ción de pH ácido (habitualmente ácido fosfórico 1 M) y en el reservorio del cátodo
(-) una disolución básica (habitualmente NaOH 1 M). E n los otros casos se suelen
utilizar mezclas de anfolitos que proporcionen un pH similar al de los extremos del
gradiente.
Si el E E F analítico se va a desarrollar en un gel con un gradiente de pH inmovi-
lizado, la preparación de éste es similar a la de un gel en gradiente de poliacrilami-
da. Se utiliza un formador de gradiente (sistema de vasos comunicantes ya descrito

en el capítulo 4), y dos disoluciones con distinta densidad. La de caracter ácido con-
tiene glicerol a1 25% (disolución densa), siendo la básica de menor densidad (glice-
rol al 5 % ) . D e esta forma, la región ácida del gradiente, más densa, quedará en la
parte inferior del gel (y la básica en la parte superior), si éste se polimeriza en posi-
ción vertical.
El E E F en placa puede realizarse en cubetas verticales u horizontales. Las pri-
meras no difieren de las ya descritas, pero deben tener un sistema de refrigeración
eficaz, ya que los voltajes utilizados en E E F son mayores que en otros tipos d e elec-
troforesis (1.000-1.500 V). E n las cubetas horizontales, la situación es similar a la
descrita en la Figura 5.2.
E n las cubetas verticales la aplicación de la muestra es similar a la descrita en
PAGE. Idealmente, la muestra debe ir disuelta en agua y no en tampón, para no
interferir con el gradiente de pH. E n la mayoría de los casos, ésto no es posible
pues las proteínas son muy poco solubles en medios d e baja fuerza iónica. Pero
deben utilizarse tampones con la menor fuerza iónica posible. En las cubetas hori-
zontales la aplicación de la muestra es diferente. Los geles, o no tienen pocillos
para no alterar el campo eléctrico ni el gradiente de pH, o si los hay son de poca
profundidad, no llegando a perforar el gel. Si no hay pocillos, las muestras se apli-
can directamente sobre el gel, utilizando moldes diminutos (colocados sobre el gel)
para evitar que la muestra se extienda.
El desarrollo del E E F es más complejo que el de la PAGE. En E E F se utilizan
voltajes variables. Según se va formando el gradiente, los anfolitos van perdiendo
carga hasta llegar a su pI, con la consiguiente reducción en la conductividad del
medio. Por la misma razón, las proteínas van perdiendo movilidad, lo que alarga el
proceso. Por todo ello es necesario incrementar el voltaje para mantener la intensi-
dad constante. Para el E E F se necesitan fuentes de alimentación capaces de gene-
rar 3.000 V, para proporcionar intensidades constantes del orden de 50-150 mA.
Estos voltajes tan elevados se traducen en un importante incremento de temperatu-
ra, por lo que el soporte debe estar refrigerado (4 "C). Si el E E F se realiza en pre-
sencia de urea, que precipita a esa temperatura, deben utilizarse temperaturas no
inferiores a 10 "C.
El proceso d e tinción presenta algunas diferencias respecto a la PAGE. Antes
d e introducir el gel en la disolución del colorante hay que eliminar los anfolitos,
pues también pueden teñirse, particularmente con Azul Coomassie. Para ello,
primeramente se fijan las proteínas mediante precipitación con ácido como ya se ha
descrito. Posteriormente se eliminan los anfolitos mediante sucesivos lavados, y
luego ya se realiza la tinción como en la PAGE.
Una de las aplicaciones fundamentales del E E F es el cálculo de pI. Para ello es
necesario evaluar el gradiente de pH. Esto se puede llevar a cabo con un electrodo
de superficie, que mide el p H directamente poniéndolo en contacto con la superfi-
cie del gel. Si en éste se incluyeron marcadores de pI conocido, puede verificarse
que ocupan la posición que les corresponde en el gradiente. También puede cono-
cerse el gradiente d e pH por otro procedimiento. Se corta una tira del gel, longitu-
dinalmente (en la dirección del gradiente de pH), y se trocea en pequeños fragmen-
tos transversales (1-2 mm). Cada uno, individualmente y por orden, se coloca en un
tubo y se añade un volumen fijo de agua destilada o de una disolución de KCI 10

mM. Cuando los anfolitos han difundido al agua destilada, se mide el p H en cada
tubo con un pH-metro. De esta forma se puede construir una gráfica que enfrente
pH y distancia, que es el reflejo del gradiente de pH. Midiendo la distancia recorri-
da por la proteína que se está analizando, e interpelando este valor en la gráfica
anterior, se determina el pI de dicha proteína (Figura 5.35). Una alternativa es utili-
zar proteínas marcadoras de pI conocido, que también servirían para construir
dicha gráfica (Figura 5.35).
F IGURA 5.35. Determinación del punto isoeléctrico. (Parte A ) , en el pocillo 1 se aplican marcadores de pI, y en el 11
la muestra X cuyo pI se desea conocer. El carril 111 (sombreado) se emplea para determinar el gradiente de pH.
(Parte B), se trocea el carril 111 y cada segmento (1-2 mm) se introduce en 1 ml de agua, determinándose su pH.
(Parte C), se representa el pH de cada fracción, frente a su posición en el gel. La distancia migrada por X se inter-
pela en la recta obtenida, determinándose así su pI.
El E E F es un criterio de pureza negativo. Varias bandas indican que la muestra

es heterogénea, pero la aparición de una única banda no permite afirmar que Ia
muestra sea homogénea, pues pueden coexistir proteínas diferentes con igual pI.
Cuanto más reducido sea el gradiente de p H utilizado (que proporciona mayor
resolución), si aparece una sola banda, mayor será la probabilidad de que la mues-
tra sea homogénea.
La aparición de varias bandas en EEF debe manejarse con cautela, si por otro
criterio se ha comprobado la homogeneidad de la muestra, pues, por ejemplo, pue-
den corresponder a variantes genéticas de una misma proteína (polimorfismo;)
(Figura 5.36), o a distintos grados de glicosilación de la misma proteína, etc.
F IGURA 5.36. Electroenfoque de las variantes de una proteí-

na en distintos individuos (1 y 2 homocigotos; 1,2 heterocigo-
to) y esquema de las bandas distinguibles en cada caso (parte
derecha). En la parte inferior se observa la misma proteína
sometida a PAGE-SDS (electroforesis bidimensional). Se
obtiene una sola mancha indicando la homogeneidad de la
muestra en cuanto a M.
5.7.2. Electroenfoque preparativo
El E E F preparativo se utiliza mucho menos que el analítico, aunque es un

método eficaz para la purificación de proteínas. Es un método caro, pues consume
gran cantidad de anfolitos, ya que se desarrolla en una columna de vidrio, de forma
similar a la PAGE preparativa. El gradiente de pH se estabiliza frente a la difusión,
en lugar de con un gel de PA, mediante un gradiente de densidad formado con
sacarosa. Las disoluciones de sacarosa llevan incorporados los anfolitos, e incluso
también puede incluirse la muestra, aunque ésta puede aplicarse una vez llena la
columna.
Por su cáracter preparativo, se utiliza para procesar una cantidad considerable
de proteína (mg). Ello hace que la proteína pueda precipitar cuando está en su pI,
ya que ahí exhibe el mínimo de solubilidad. En ese caso, aparecen bandas de preci-
pitación visibles, a modo de estratos, lo que puede distorsionar la separación si el
precipitado sedimenta a través del gradiente. La aparición de tales bandas es una
señal de que el EEF ha finalizado; pero, si no se observan, puede saberse cuando
ha finalizado el EEF siguiendo la variación de la intensidad del campo eléctrico a lo
largo del tiempo. Cuado la intensidad alcance un valor mínimo de forma estable, el
E E F ha finalizado (téngase en cuenta que cuando el sistema ha alcanzado el equili-
brio, la conductividad es mínima y también lo es la intensidad eléctrica). A pesar de
que se lleva a cabo a elevados voltajes, el proceso puede durar varios días.
Una vez concluido, se procede al vaciado de la columna. Puede hacerse por suc-
ción, mediante una bomba peristáltica (Capítulo 6), o inyectando líquido (normal-
mente agua, que no se mezcla con la sacarosa por la diferente densidad) por la parte
superior. Colocando a la salida de la columna un detector de flujo continuo (que
mida la absobancia a 214 ó 280 nm) y un colector de fracciones, se identifican y reco-
gen las proteínas separadas. Para eliminar los anfolitos que contaminan a las proteí-
nas, se suele recurrir a la precipitación de éstas por los procedimientos habituales.
5.8. Electroforesis bidimensional
La electroforesis bidimensional es una sucesión de dos electroforesis distintas

(o en distintas condiciones), realizadas sobre una misma muestra. E n la primera de
ellas (primera dimensión) se separan los componentes de la muestra según un cri-
terio (carga, o tamaño, o pI), y en la segunda (segunda dimensión) según un pará-
metro distinto al anterior. De esta manera, se combinan dos modos de separación
diferentes, y se consigue el máximo de resolución posible mediante técnicas elec-
troforéticas. La primera dimensión puede llevarse a cabo en condiciones no desna-
turalizantes y la segunda en condiciones desnaturalizantes. Por ejemplo, las proteí-
nas ribosomales se separan en un gel discontinuo en la primera dimensión, seguido
por otro continuo en la segunaa, y ambos en presencia de urea. Las histonas se
separan en geles con urea y ácido en la primera dimensión, y utilizando
Tritón/ácido/urea en la segunda.
Sin embargo, la idea de electroforesis bidimensional suele referirse, de modo
específico, a la combinación de los dos tipos de electroforesis más resolutivos:
PAGE-SDS y EEF. Aunque nada lo impone, lo habitual es que el E E F sea la prime-
ra dimensión y la PAGE-SDS la segunda. El E E F puede realizarse en tubo o en
placa, y normalmente empleando gradientes de pH expandidos. Una vez terminado,
se saca el cilindro de PA del tubo y se sumerge en el tampón de muestra de la
PAGE-SDS, para que se equilibre en el tampón de la segunda dimensión. Si la pri-
mera dimensión se hizo en placa, se corta el segmento correspondiente a un carril de
los dos en los que habitualmente se ha cargado la muestra (Figura 5.37). El resto del
gel se tiñe, lo que permite comprobar el resultado de la primera dimensión. El carril
que se ha cortado se introduce de forma ajustada entre las dos láminas de vidrio que
mantienen la segunda placa de PA. Finalizada la segunda dimensión se procede a la
tinción como se ha descrito anteriormente.
En el gel teñido, las proteínas separadas aparecen como manchas y no como
bandas, ya que proceden de las bandas de la primera dimensión que se han "aplica-
do" perpendicularmente en la segunda (Figura 5.37).
La electroforesis bidimensional puede considerarse como un criterio de pureza
positivo, por Su gran poder de resolución, aceptándose que la aparición de una sola
mancha indica una muestra homogénea.
Capitulo 5: Electroforesis 259
F I G U R A 5.37. Electroforesis
bidimensional. (Parte A ) , pri-
mera dimensión (PAGE-SDS).
En los pocillos 2 y 3 se aplica la
muestra, y en el 1 los marcado-
res de M. El carril del pocillo 3
(sombreado) se corta y el resto
del gel se' tiñe (parte B). El
carril 3 se coloca sobre un
nuevo gel, que se polimeriza
sin pocillos, y donde se desa-
rrolla la segunda dimensión
(EEF), perpendicular a la pri-
mera. Las mismas proteínas
visibles en el carril 2 de la parte
B, están presentes en el carril 3
(sombreado) d e la parte C.
Obsérvese que algunas bandas
producen más de una mancha
en la segunda dimensión.
5.9. Electroforesis de ácidos nucleicos
La electroforesis de ácidos nucleicos es el método habitual para separar, identi-

ficar y purificar moléculas o fragmentos de DNA y RNA. Abarca aplicaciones tan
diversas como la determinación de la estructura primaria (secuencia de nucleoti-
dos) de un segmento de DNA, la separación de cromosomas enteros, o la identifi-
cación de las regiones de unión de proteínas al DNA.
E n los tampones habitualmente utilizados, los ácidos nucleicos están cargados
negativamente y migran hacia el ánodo. Cada nucleótido aporta una carga negativa,
procedente del grupo fosfato, por lo que la relación cargaltamaño es prácticamente
idéntica para todas estas moléculas, independientemente de su tamaño. Un nucleóti-
do tendría la misma movilidad que un fragmento de doble cadena de 800 bp (pares
de bases) o uno de 5 Kb (kilobases). Por tanto, en un soporte no restrictivo, todas se
moverían a la misma velocidad y no serían separables; pero en un soporte restrictivo
la situación cambia, por las diferencias de tamaños.
La electroforesis de DNA se lleva a cabo en geles de agarosa o de PA, y rara
vez en mezclas de ambos. Ambos soportes son restrictivos para los ácidos nuclei-
cos, de modo que los fragmentos de DNA, al tener esencialmente la misma relación
cargaltamaño, migran en función de su tamaño, pudiendo, además, influir su con-
formación y carga neta. Conviene recordar que los ácidos nucleicos son un conjun-
to heterogéneo de moléculas en cuanto a formas y tamaños. El D N A de doble
cadena más frecuente es lineal. Pero hay estructuras circulares, bien formando un
círculo cerrado o presentando alguna mella (un enlace fosfodiester roto). Los D N A
circulares de doble hélice pueden estar superenrrollados, formando estructuras

muy compactas. El DNA de cadena simple puede ser también lineal o circular. El
RNA presenta una mayor versatilidad estructural que el DNA. Hay RNA de cade-
na simple, habitualmente con diversos grados de estructuración, con segmentos en
doble (o triple) hélice y otros lineales, etc. Por todo ello, el utilizar PA o agarosa
como soporte depende esencialmente del tamaño de los fragmentos o moléculas a
separar (Cuadro 5.2).
CUADRO 5.2
Concentraciones de agarosa o acrilamida utilizadas para /a separación electroforética
de Fragmentos lineales de DNA de distintos tamaños
agarosa (%) Intervalo de tamaños separables [Kb)
0,3 5-60
0,6 1 -2 0
07 0,8 - 10,O
0,9 0,5 - 7,O
1,2 0,4 - 6,O
1,5 0,2 - 3,O
2,0 0,l - 2,0
acrilamida (%) Intervalo de tamaños separables [bp)
3,5 1.000 - 2.000

5,0 80 - 500
8,0 60 - 400
12,O 40 - 200
15,O 25 - 150
20,O 6 -1 O0
Los geles de PA (en cubetas verticales) se emplean para fragmentos pequeños

de DNA y oligonucleótidos (5-500 bp), así como para la gran mayoría de los RNA.
Dos fragmentos de alrededor de 500 bp que difieran en tan solo 1-2 pares de bases
pueden ser discriminados en este soporte.
Los geles de agarosa (en cubetas horizontales) se utilizan para fragmentos gran-
des de DNA (desde 500 bp hasta 10 Mb). Utilizando agarosa de distintas concen-
traciones (distinto grado de reticulación) pueden separarse fragmentos de hasta 50
Kb, aplicando un campo eléctrico constante en intensidad y dirección. Para separar
fragmentos de tamaños > 50 Kb, se utiliza la electroforesis de pulsos o de campo
pulsante (apartado 5.9.6), en la que la dirección e intensidad del campo eléctrico
cambia periódicamente.
5.9.1. Electroforesis en geles de agarosa
Se trata del método más común para el análisis de DNA. Pero también es un
método habitual para su purificación y obtención. Las agarosas disponibles comer-
Capitulo 5: Electroforesis 26 1
cialmente presentan una amplia gama de grados de pureza. La presencia de polisa-

caridos sulfatados, contaminantes de algunas agarosas, puede ser perjudicial. Tales
polisacáridos son inhibidores de las enzimas con las que va a tratarse el DNA puri-
ficado en la electroforesis (polimerasas, ligasas, endonucleasas de restricción). Los
distintos tipos de agarosas deben escogerse en función de la finalidad de la electro-
foresis. Así, multitud de aplicaciones requieren el tratamiento del DNA en el pro-
pio gel, por lo que éste debe ser compatible con tales tratamientos.
Un aspecto importante de las agarosas es su estado físico. La estándar gelifica a
35 "C y funde a 80-90 "C. Pero las hay modificadas, por adición de grupos hidroxieti-
lo, que funden a 65 "C y gelifican a menos de 30 "C. Estos datos son importantes,
pues finalizada la electroforesis el gel se puede licuar a temperatura superior a ia de
fusión, y así separar el DNA en disolución. Pero hay que considerar que, a 80-90 "C,
el DNA se desnaturaliza. Por ello, según el caso, se puede usar una u otra agarosa.
También hay que tener en cuenta la fragilidad del gel. Su resistencia mecánica se
expresa en g/cm2,el peso que puede soportar 1 cm2 de un gel de agarosa al 1%. La
agarosa estándar tiene una resistencia de 1.000-2.000 g . cm-'. Las de bajo punto de
fusión 200 g . cm-', y las de alta resistencia llegan hasta 6.000 g . cm-'.
Hay agarosa de gran reticulado, para fragmentos de pequeño tamaño molecu-
lar. Utilizadas a concentraciones de 2,O-4,5% (y mantenidas a 4 "C) separan eficaz-
mente fragmentos de DNA de 700-3.000 bp. También señalar que algunas son
transparentes, lo que facilita el proceso de detección.
Finalmente, en cuanto a las características de la agarosa, indicar que en ella el
flujo electroendosmótico va en contra de la dirección de migración del DNA, hacia
el ánodo, lo que perjudica la resolución.
El modelo más habitual de cubeta horizontal, en la que se realiza la electrofore-
sis en geles de agarosa, (Figura 5.38) es similar al descrito en la Figura 5.3, pero hay
multitud de variantes.
F I G U R A 5.38. Electroforesis submarina en

geles de agarosa. La cubeta aloja en su parte
central al soporte (gel). La flecha horizontal
indica la dirección de migración de la mues-
tra. Los signos (+) y (-) corresponden a los
electrodos, situados en los reservorios del
tampón. El molde empleado para la forma-
ción del gel se muestra en la parte superior.
Habitualmente, en la cubeta se colocan am-
bos, molde y gel, como una unidad.
Los geles de agarosa se pueden formar sobre una lámina de vidrio, utilizando
un molde (Figura 5.3). Sin embargo, es más habitual utilizar una pequeña bandeja o
molde de plastico (transparente a la radiación UV), abierta en los extremos (Figura
5.38). Estos se tapan con cinta adhesiva durante la polimerización del gel. El peine
se coloca perpendicularmente sobre la bandeja (Figura 5.49). La profundidad de
los dientes del peine es menor que la profundidad de la bandeja para que los poci-
llos no lleguen hasta el fondo (1-2 mm menos). Así se evita que las muestras pasen
entre el gel y la bandeja. La agarosa en polvo se disuelve en el tampón de electrofo-
resis, calentando a 100 "C. Una vez disuelta, se añade sobre el molde, donde al
enfriarse gelifica (30-40 minutos a temperatura ambiente). Cuanto .más concentra-
da esté, antes gelifica. Una vez formado el gel, se retiran la cinta adhesiva y el
peine, para permitir el paso de la corriente. Si se van a utilizar geles de muy baja
concentración de agarosa (< O.S%), que tienen muy poca consistencia, es preferible
preformar una pequeña capa de agarosa más consistente (al 1%), a modo de plata-
forma sobre la que se prepara después el gel de baja concentración. Esto permite
manipularle con más facilidad. Alternativamente, pueden utilizarse las agarosas de
elevada resistencia antes mencionadas.
El gel adherido a la bandeja se coloca en la parte central de la cubeta, con la
zona de los pocillos junto al cátodo. La electroforesis se lleva a cabo de modo que
el tampón cubra totalmente el gel (electroforesis submarina; Figura 5.38). Con esta
disposición se disipa mejor el calor generado por el paso de la corriente, y se consi-
gue un campo eléctrico muy eficaz. Para conseguir el máximo de resolución, suelen
emplearse geles de 15-20 cm de largo y 3-4 mm de grosor.
La separación de fragmentos lineales de DNA de doble cadena se realiza a un
p H cercano a la neutralidad (están cargados negativamente), pero para la de D N A
monocatenario se utiliza NaOH 50 mM (electroforesis alcalina).
La muestra de DNA se carga en los pocillos, en una disolución (idealmente en
el mismo tampón de la electroforesis) a la que se le incrementa la densidad y se le
añaden uno o varios marcadores. Así se posibilita la aplicación en el gel que está
cubierto por el tampón. Sacarosa (40% plv), glicerol (30% p/v) o Ficoll (15% p/v),
son los compuestos utilizados para aumentar la densidad. Como marcadores se uti-
lizan Azul de Bromofenol (0.25%) y Xylene Cianol F F (0.25%). Ambos poseen
carga negativa. El Azul de Bromofenol tiene una U comparable a un segmento de
D N A bicatenario de 300 bp. Para geles alcalinos se prefiere como marcador el
Verde de Bromocresol (0.15%), porque se ve mejor a pH básico que el Azul de
Bromofenol. El volumen máximo de muestra que puede cargarse depende de las
dimensiones de los pocillos practicados, pero no suele superar los 50 pl. La canti-
dad máxima de DNA que puede cargarse por pocillo depende del tamaño de los
fragmentos de DNA y de su diversidad. Cuanto mayor sea el tamaño menos canti-
dad puede cargarse por pocillo. Para pocillos de tamaño medio (0,5 x 0,5 x 0,15 cm)
pueden cargarse 500 ng - l p g de un único tamaño. Cuando existen tamaños diferen-
tes, la cantidad puede incrementarse hasta 30-50 pg, especialmente si hay una dis-
tribución continua de tamaños. La cantidad mínima de DNA que puede cargarse
depende del límite del método de detección utilizado. Con bromuro de etidio
(EtBr) (Figura 5.39), cantidades menores de 5 ng/pocillo son escasamente visibles y
se fotografían con dificultad. Otros compuestos fluorescentes permiten detectar 10
F I G U R A 5.39. Electroforesis en agarosa de dos muestras de DNA. La tin-

ción se ha efectuado con EtBr. Sobre el gel se aprecia la fluorescencia de
las bandas de DNA teñido. En los carriles 1 y 2 se cargaron 100 y 300 ng,
respectivamente, de una de las muestras, y en los carriles 3 y 4, 50 y 200
ng, respectivamente, de la otra. A la izquierda aparecen los marcadores
de tamaño.
pg/banda, y pueden cargarse aún cantidades menores si el DNA está radiactiva-

mente marcado.
Para estimar el tamaño de los fragmentos de DNA analizados, se incluye en el
gel (habitualmente en los pocillos de los extremos) un conjunto de patrones, frag-
mentos de D N A de tamaño conocido. Suelen ser fragmentos de restricción de
D N A virales o de plásmidos (pBR322, pAT153, Bacteriófago A, etc.) y pueden
adquirirse comercialmente.
Por último, también pueden realizarse electroforesis bidimensionales en geles
de agarosa. Por ejemplo, la muestra de DNA se digiere con una endonucleasa de
restricción, y los fragmentos se separan en una primera dimensión. Se tratan des-
pués con una segunda enzima de restricción, sobre el gel o transferidos a una mem-
brana de DEAE-celulosa (lo más habitual), y los subfragmentos obtenidos se sepa-
ran en la segunda dimensión, de modo similar al descrito para proteínas (apartado
5.8). Esta modalidad es frecuente en estudios de mapeo génico.
5.9.2. Factores que afectan a la movilidad elecfroforética del DNA
El voltaje que se aplica en los geles de agarosa depende de la resolución reque-

rida y del tamaño de los fragmentos a separar. Entre 1-10 V/cm (los cm se refieren
a la distancia entre los electrodos), la U de fragmentos lineales de DNA de doble
cadena es proporcional al voltaje aplicado (véase más adelante). Si se incrementa el
voltaje, los fragmentos grandes, cambian su U sin que ésta guarde relación con su
tamaño. E n general, la separación de fragmentos grandes de DNA es mejor a bajos
voltajes, aunque ésto incremente el tiempo de electroforesis. Sin embargo, voltajes
elevados producen bandas estrechas y bien resueltas, cuando se trata de fragmentos
pequeños, ya que éstos difunden rápidamente, y al aumentar el voltaje se reduce la
duración del proceso.
Un D N A lineal de doble cadena se mueve en un gel de agarosa a una velocidad
que es dependiente del tamaño del poro del gel. A mayor concentración de agaro-
sa, menor diámetro de poro, y menor movilidad, de modo que se cumple una rela-
ción similar a la descrita para proteínas en PAGE (representación de Ferguson)
(Figura 5.40). La U de los fragmentos de DNA es inversamente proporcional al
logaritmo de su tamaño, expresado en pares de bases (Figura 5.40).
FIGURA 5.40. Relación entre el tamaño de los fragmentos de

DNA lineal (número de pares de bases: no bp) y su movilidad
z
a
m 3
2
4
$ 0.5%
0.7%
0.9%
1.2%
1.4%
electroforética, para distintas concentraciones (%T)de agarosa. 1 2 3 4 5 6

Se cumple que log Ur = log Yo - KR (%T), siendo KR el coefi- DISTANCIA (cm)
ciente de retardo, e Yola movili-dad en electroforesis libre.
El DNA lineal en disolución, en ausencia de fuerzas externas, se comporta

como una cadena flexible, dispuesta al azar (conformación relajada). Así, su paso a
través del gel, está determinado por el radio de giro (radio de la sección circular del
volumen que barre). Cuanto más se aproxime éste al tamaño del poro, más dificul-
tad tendrá para atravesarlo. Sin embargo, ésta no parece ser la conformación pre-
ponderante del DNA durante la electroforesis. Por la acción del campo eléctrico.
los fragmentos de DNA se elongan en la dirección del campo y migran con una
orientación cabeza-cola. Así, todos avanzan presentando la misma superficie fron-
tal, el diámetro de la sección transversal de la doble hélice del DNA (18 A).Los
fragmentos "reptan" y la separación ocurre en función del tamaño, pues los más
cortos lo hacen con mayor facilidad. Cuanto mayor es el fragmento de DNA (pre-
senta mayor superficie de rozamiento), más se retarda a lo largo del recorrido por
el gel. Así, los fragmentos se van ordenando hacia el ánodo en relación a su tama-
ño. Por encima de alrededor de 50 Kb, son tan largos que avanzan prácticamente
con la misma velocidad, y no se separan. Pero, además, el movimiento de reptación
puede no ser idéntico para todos ellos. Los extremos del fragmento tienen más faci-
lidad para moverse y cambiar de dirección que la parte central, de modo que la
estructura lineal puede combarse. Adoptaría una forma de horquilla, que puede
engancharse en las fibras del gel dificultando su migración. E n los fragmentos
pequeños, el acodamiento revierte fácilmente y en los muy largos es muy díficil que
se produzca. Sin embargo, afecta mucho a los de tamaño intermedio. Esto es la
causa del fenómeno conocido como inversión de banda, por el cual estructuras de
tamaño intermedio migran más lentamente que otras mayores. El fenómeno es más
acusado a elevada concentración de agarosa y a bajos voltajes.
Si se-incrementa el voltaje para intentar acelerar la separación, las estructuras
pierden flexibilidad, se deforman y se estiran en la dirección del campo eléctrico.
adoptando una forma de varilla rígida. Así ya no se aprecian diferencias de tama-
ños y no hay separación.
Capitulo 5: Electroforesis 265
Cuando se trata de estructuras circulares, la U aumenta con el grado de enrolla-

miento. Cuanto más "retorcido" está el DNA circular, más compacto es (menos
volumen ocupa), y atraviesa mejor el gel, siendo mayor su movilidad. Las estructu-
ras circulares superenrrolladas de DNA se mueven, por tanto, con una velocidad
que depende del número de enlace (L,, grado de superenrrollamiento). Aquellas
con L, cero se mueven más lentamente que las de mayores valores de L, (positivo o
negativo), porque, cuanto mayor es éste, más compactas son. De esta forma, estruc-
turas superenrrolladas con distinto L,, pero de idéntico tamaño, pueden ser separa-
das por electroforesis en geles de agarosa y estimarse su L, (Figura 5.41). La U de
distintas formas circulares de un DNA, en relación a la de un fragmento lineal del
mismo tamaño, se muestra en la Figura 5.42.
F IGURA 5.41. Relación entre movilidad elec-

troforética y grado.de superenrrollamiento de
estructuras circulares de DNA. (Parte iz-
quierda): DNA circular, con distintos LK,
analizado en un gel de agarosa al 1.5%, y
teñido con EtBr. Las estructuras con mayor
LK presentan mayor U. (Parte derecha): re-
presentación esquemática de estructuras cir-
culares de DNA bicatenario con distintos
grados de superenrrollamiento.
La temperatura no afecta a la U entre 4 y 30 "C, lo que contrasta con la influen-

cia que ejerce en la electroforesis de pulsos (véase más adelante). Por ello la elec-
troforesis se lleva a cabo a temperatura ambiente, salvo que se utilice agarosa de
bajo punto de fusión. En este caso la electroforesis conviene realizarla a 4 "C. A los
voltajes habitualmente empleados (1-10 Vlcm), los pequeños aumentos de tem-
peratura debidos a la resistencia del gel, no afectan al DNA ni al gel (si influyeran,
se producirían distorsiones de las bandas).
Como se ha indicado, el EtBr se utiliza para la tinción del DNA, lo que a veces
se efectúa antes de la electroforesis. Es un compuesto que se intercala entre pares
de bases contiguos del DNA (Capítulo 3), y aumenta la longitud de éste. Esto redu-
ce la U del fragmento considerado en un 15%. Ello se debe a que al introducirse
entre las bases, la doble hélice del DNA queda menos girada, con lo que crece su
longitud, y se hace menos flexible. Es algo similar a convertir una escalera de cara-
266 Técnicas instrumentales de análisis en Bioquírnica
F I G U R A 5.42. Posiciones relativas de

diferentes formas de DNA de la
misma longitud (no representadas a
escala) en un gel de agarosa. La dis-
tancia entre las distintas bandas varía
en función de las condiciones de la
electroforesis (% de agarosa, voltaje,
tiempo, etc.). Forma (O): circular
cerrado monocatenario; (1): circular
superenrrollado (la línea más gruesa
que en las otras formas, indica que
corresponde a la doble hélice); (11):
circular mellado (flecha) bicatenario; A
(111): lineal bicatenario; (IV): circular @ gel agarosa
cerrado bicatenario. (A): punto de
aplicación de la muestra.
col en una casi lineal. Este aumento de tamaño del DNA tratado con EtBr debe
tenerse en cuenta si la electroforesis se hace en presencia de este compuesto.
Finalmente, indicar que la U de los fragmentos de DNA en geles de agarosa no
depende de la composición de bases ni de su secuencia.
5.9.3. Detección del DNA. Tinción
Hay dos maneras fundamentales para visualizar el D N A una vez finalizada la

electroforesis: compuestos fluorescentes que se unen específicamente a los ácidos
nucleicos, y tinción con plata (particularmente para geles de PA). Si el DNA estaba
radiactivamente marcado ( 3 2 ~ , 3 5 ~ )se
, detecta por autorradiografía, y si lo estaba
con nucleótidos fluorescentes, las bandas pueden incluso observarse según van
migrando por el gel.
La detección con EtBr es el método habitual para detectar el D N A en los geles
de agarosa (Figura 5.39). El EtBr tiene un rendimiento cuántico bajo en medios
acuosos (polares), pero se incrementa notablemente en entornos hidrofóbicos
(Capítulo 3), lo que sucede cuando se intercala en el DNA. Así, las bandas de
D N A pueden detectarse sumergiendo el gel en una disolución acuosa de EtBr (0,5-
1 , O pglml) e iluminando con radiación UV que es absorbida por la sonda y que
emite a 590 nm (Figura 5.39). Puede utilizarse radiación de 254 nm, que es absorbi-
da por el DNA y transferida al EtBr, o de 302 nm ó 366 nm, que es absorbida direc-
tamente por la sonda fluorescente. Si se utiliza con radiación de 254 nm ó de 302

nm, la intensidad de fluorescencia es mayor que si es 366 nm. Pero, la de 254 nm
produce más roturas en el DNA que la de 302 nm, por lo que es ésta la A utilizada
preferentemente. Como las bandas sólo son visibles mientras se están iluminando,
es necesario fotografiarlas bajo iluminación, para tener los resultados de forma per-
manente (Figura 5.43). Recientemente el uso de videocámaras ha desplazado a la
fotografía. Con ellas se transmite la imagen del gel fluorescente a una pantalla y se
imprime en papel (Figura 5.43).
Para los geles habituales (10,O x 6,O x 0,5 cm), 20-30 minutos son suficientes
para que el EtBr los impregne. Si la concentración de agarosa es superior al 4%, el
tiempo debe aumentarse. Alternativamente puede incluirse el EtBr en el tampón
de la electroforesis (reservorios y gel), lo que permite visualizar el DNA durante su
migración. Normalmente no es necesario eliminar el exceso de EtBr (desteñido).
Con EtBr pueden detectarse bandas conteniendo 1-10 ng de DNA (otros compues-
tos fluorescentes, SYBR-Verde 1, SOTO-1 y YOYO-1, son capaces de detectar 50-
F IGURA 5.43. Iluminación y fotografía de geles de agarosa. (Parte A ) , iluminación incidente. (Parte B), iluminación
por transmisión (transiluminación). Las flechas onduladas representan la radiación emitida (fluorescencia) por los
complejos DNA-EtBr. (Parte C), videocámara. La imagen del gel sobre el transiluminador (1; en su interior se aloja la
fuente de radiación UV) es captada por la cámara (II), visualizada en la pantalla (111) y obtenida en la impresora (IV).
60 pglbanda de DNA ó RNA). Si las cantidades por banda son menores, sí convie-
ne eliminar el EtBr no unido. Puesto que el EtBr se une en múltiples puntos a lo
largo de una molécula, cuanto más corta sea ésta, menos intensa será la tinción. Por
ejemplo, tras una digestión enzimática, los fragmentos están presentes en cantida-
des equimolares. Sin embargo, una vez separados en el gel, los fragmentos mayores
se tiñen más intensamente.
Por último, señalar que el EtBr es un compuesto mutagénico y todas las mani-
pulaciones con los geles y tampones que lo contengan deben hacerse con guantes.
Asimismo. debe descontaminarse todo el material utilizado.
5.9.4. Transferencia a membranas (Southern Blotting)
Las moléculas de DNA separadas en geles de agarosa pueden ser transferidas a

membranas de nitrocelulosa o de nylon (transferencia de tipo Southern) (Figuras
5.20 y 5.21). La transferencia se realiza tras desnaturalización del DNA. La unión a
las membranas ocurre preferentemente a través del esqueleto de azucar-fosfato de
la molécula, quedando libres y expuestas las bases nitrogenadas. Esto permite loca-
lizar e identificar secuencias específicas en los fragmentos transferidos, incubando
la membrana con sondas radiactivas, o de otra naturaleza. En este caso, el término
sonda hace referencia a una molécula de DNA o RNA, con una secuencia comple-
mentaria de alguna presente en las moléculas separadas en la electroforesis. Esto le
permite hibridar (unirse) con la complementaria y así revelar su posición, lo que se
consigue por autorradiografía de la membrana. De esta forma puede identificarse
un fragmento específico de DNA (por ejemplo, un gen) entre toda la población de
estructuras separadas por electroforesis. La sensibilidad del método es muy eleva-
da, pues pueden detectarse < 0,l pg de DNA, usando una sonda marcada con 3 2 ~
de alta actividad específica (lo9 cpmlpg). Una secuencia única de 1.000 bp, presente
en el genoma humano (1 parte en 3 millones) puede ser detectada, por este méto-
do, a partir de 10 pg de DNA genómico.
Las membranas de nitrocelulosa dan mejor resolución que las de nylon, pero
éstas presentan varias ventajas por lo que su uso es más extendido. Tienen una
mejor consistencia (las de nitrocelulosa son frágiles y pueden desmenuzarse con el
manejo) y poseen mayor capacidad de unión de DNA, pudiendo ser utilizadas para
hibridaciones sucesivas. Además producen poca fluorescencia inespecífica (fluores-
cencia de fondo) al ser iluminadas con radiación UV, lo que se verá que es muy útil
para la detección de bandas de DNA.
La desnaturalización de los fragmentos de DNA, previa a la transferencia, se
realiza introduciendo el gel en una disolución de NaOH que se neutraliza poste-
riormente. Las cadenas simples de DNA desnaturalizado no deben ser muy largas
para que la transferencia sea efectiva. Tamaños mayores de 15-20 Kb deben ser
fragmentados previamente (con radiación UV o tratamiento con ácido).
La transferencia puede realizarse por capilaridad, por electroforesis (electro-
transferencia), por centrifugación o por succión, mediante una bomba de vacío. Los
dos últimos sistemas necesitan dispositivos específicos, por lo que su uso es más res-
tringido. La electrotransferencia se utiliza cuando la separación del DNA se ha rea-
lizado en geles de PA, dado que el reticulado es más denso que el de agarosa y otro
tipo de transferencia sería más difícil. El tiempo requerido para la transferencia
depende del grosor del gel, del % de ogarosa y del tamaño de los fragmentos de
DNA. Puede comprobarse la eficacia de la transferencia, si al volver a teñir el gel no
se observa ninguna banda. Una vez en la membrana, el DNA se fija a ella mediante
calentamiento (80 "C) o iluminación con radiación UV.
Las regiones de la membrana no ocupadas por el DNA transferido deben blo-
quearse o saturarse, para evitar que, al añadir la sonda, ésta se una inespecífica-
mente a la membrana y produzca un fondo en la autorradiografía posterior. Para
ello la membrana se sumerge en una disolución que contiene sustancias de elevada
masa molecular, como Ficoll (400.000 Da), polivinilpirrolidona (360.000 Da) o Sero-
albúmina bovina (66.000 Da), además de DNA heterólogo de diversos orígenes
(bacteriano, timo de ternera, esperma de salmón, etc.).
La formación de estructuras híbridas, "duplex", entre la sonda y la secuencia
complementaria buscada, es muy dependiente de las condiciones experimentales, y
particularmente de la temperatura. Para la hibridación se utilizan dos sistemas. En
uno, la membrana se introduce en una bolsa de plástico hermética, que contiene la
disolución de la sonda. La temperatura se controla por inmersión en un baño ter-
mostatizado. Alternativamente pueden utilizarse hornos de hibridación. Las mem-
branas se introducen en botellas que contienen la disolución de la sonda. La rota-
ción de las botellas, dispuestas horizontalmente en el horno, asegura el contacto
continuo y uniforme de la disolución y la membrana.
Una vez producida la hibridación, se ha de proceder a localizar los fragmentos
marcados. Si la sonda es radiactiva, se acude a una autorradiografía. La otra posibi-
lidad, una sonda luminiscente, cada vez es más utilizada (estas sondas están despla-
zando a las radiactivas, debido a que poseen una sensibilidad similar y evitan los
inconvenientes de la utilización de radiactividad). Su empleo ya ha sido descrito
para el caso de las proteínas, y para el caso de ácidos nucleícos presenta ligeras
modificaciones. La sonda tiene un nucleótido modificado por adición de una molé-
cula extra de biotina, fluoresceína o digoxigenina. La molécula extra es específica-
mente reconocida por proteínas (la biotina es reconocida por la estreptavidina, la
fluoresceína o la digoxigenina se reconocen con anticuerpos específicos), a las que
se les ha unido una enzima (peroxidasa, por ejemplo). Un esquema del método se
representa en la Figura 5.44, para el caso de un RNA. Recuérdese que, en el caso
de las proteínas, éstas son reconocidas por anticuerpos específicos. Aquí ese papel
lo realiza la sonda (compárense las Figuras 5.22 y 5.44). Los sistemas quimiolumi-
niscentes que utilizan peroxidasa (HRP) como enzima se denominan sistemas
quimioluminiscentes potenciados.
5.9.5. Electroforesis en geles de agarosa en condiciones desnaturalizantes
Se lleva a cabo en modo submarino como ya se ha descrito, siendo también

válido todo lo referente a la tinción de la muestra. Se utiliza para la separación de
fragmentos de DNA monocatenario grandes (1.000-20.000 nucleótidos) y especial-
mente para el análisis de mRNA, que se transfiere posteriormente a membranas
RNA
--
AUAGGCCUUUCGAAACGCGAAUUAACA
UAUCCGGAAAGCUUUGCGCUUAAUUGUUUUUUUUU UUUUU
-
i i ' 7 1 - 1 1 1 1 1 - 1 - 1 -
OLIGONUCLEOTIDO BlOTlNlLADO BBBBBBBBB 6 6 6 6 6
m
v '
./
- avidina 1 1 1 1
6 - biotina
QC
NHz
t
2H02+02
QCY
O
O
+N2
NH2
pe'rácido
O
NH
Ac 1
luminol oxidado + fotones luminol
* I
banda en la película
FIGURA 5.44. Detección de RNA mediante quimioluminiscencia. El RNA en la membrana es hibridado con un oli-
gonucleótido modificado, que lleva moléculas de biotina (dUTP biotinilado). Esta, interacciona con avidina, que es
reconocida por el anticuerpo primario (Acl), el cual es reconocido por el anticuerpo secundario (Ac2) conjugado
con peroxidasa (HRP). Esta, en presencia de un peróxido, oxida al luminol, que es excitado y vuelve al estado
fundamental emitiendo fotones que impresionan la película fotográfica.
para su detección (transferencia tipo Northern; Northen Blotting). La transferencia

y la hibridación son similares a lo descrito para el DNA, teniendo en cuenta que el
mRNA es de cadena simple. E l método permite identificar la presencia d e un
mRNA determinado en un tejido, conocer su tamaño, evaluar el nivel de expresión
de un gen, detectar la presencia de más de un mRNA para un mismo gen ("spli-
cing" alternativo), etc. Tanto para lograr una buena separación como para calcular
con fiabilidad los tamaños, es necesario que las moléculas estén completamente
desnaturalizadas. La estructura secundaria y terciaria de los ácidos nucleicos está
mantenida esencialmente por el apareamiento de bases complementarias, intra e
intercatenario. Diversos agentes desnaturalizantes lo impiden, convirtiendo las
moléculas en cadenas individuales, aproximadamente lineales. Tales son la tem-
peratura, el pH básico y diversos agentes químicos. El utilizar uno u otro depende
del soporte y del ácido nucleico. Los desnaturalizantes que rompen los puentes de
hidrógeno (urea, formamida) no pueden utilizarse porque afectan a la agarosa,
cuyas fibras se mantienen mediante esos enlaces. Para el D N A se utilizan condicio-
nes alcalinas, pero el RNA puede hidrolizarse a pH básico. E n tal caso se utiliza
hidróxido de metil mercurio, glioxal ó formaldehido (compuestos tóxicos y voláti-
les, especialmente el primero), que interaccionan con los átomos de nitrógeno de
las bases, impidiendo su apareamiento. Los agentes desnaturalizantes han de estar
presentes tanto en el tampón de muestra como en el de electroforesis. E n esta
modalidad, la U está inversamente relacionada con el log M, lo que permite una

estimación fiable de M (Figura 5.40).
5.9.6. Electroforesis de campo pulsante (PFGE)
Las electroforesis descritas hasta ahora permiten separarhfragmentos de D N A

de hasta 20 Kb, incluso se pueden separar fragmentos de hasta 50 Kb en geles de
agarosa de muy pequeña concentración. Esta nueva electroforesis logra la separa-
ción de fragmentos de varios cientos de Kb.
Como ya se ha indicado, las fragmentos de DNA adquieren una forma elonga:
da al ser sometidos a un campo eléctrico, y el efecto desaparece si cesa el campo.
Cuanto más largo sea el fragmento más tiempo tarda en volver al estado inicial
(relajado). Teniendo en cuenta ésto, Schwartz y Cantor, desarrollaron en 1984 un
sistema denominado electroforesis en gel de campo pulsante o de pulsos (PFGE, del
inglés Pulsed Field Gel Electrophoresis) con el que consiguieron separar cromoso-
mas de levadura, de varios cientos de Kb. La PFGE consigue la separación de gran-
des fragmentos de DNA induciendo su reorientación mediante cambios periódicos
en el campo eléctrico, cuya duración determina el intervalo de tamaños que pueden
ser separados. Cuanto mayores sean los fragmentos de DNA que se desea separar,
mayor ha de ser la duración de los campos aplicado:, en una relación directamente
proporcional.
Supóngase un conjunto heterogéneo de fragmentos de DNA de elevado tama-
ño (> 50 Kb), que se pretenden separar en un gel de agarosa. En una PFGE, estos
fragmentos se someten a dos campos eléctricos de distinta orientación (Figura
5.45). Al aplicar el primero, E l , durante un cierto tiempo, los fragmentos se estiran
y se orientan según esa dirección, y se mueven "reptando" por el gel. Si ahora se
aplica un campo eléctrico, E,, perpendicular al anterior, se obliga a los fragmentos
de D N A a relajarse, al desaparecer E,, y a elongarse y alinearse con el nuevo
campo eléctrico, E,. Cuanto menos tiempo tarda una molécula en reorientarse,
antes migra en la dirección de E,. El tiempo que se consume en ésta reorientación
depende del tamaño de los fragmentos, tardando más los mayores. Aplicando suce-
sivos cambios, E,/E,/E,/E,, etc., se consigue la separación de los fragmentos en fun-
ción de su tamaño.
El mecanismo de la reorientación no es bien conocido, aunque sí ha podido
observarse por microscopía el movimiento de fragmentos de DNA (con un tamaño
de 146 Kb) marcados con un compuesto fluorescente. Cuando se cambia la orienta-
ción del campo, el fragmento empieza a formar "bucles" o "rizos", buscando reo-
rientarse según el nuevo campo. Los bucles aumentan de tamaño y compiten unos
con otros, hasta que finalmente uno arrastra a todo el fragmento en la nueva direc-
ción. Cuanto mayor es el fragmento, mayor número de bucles forma y más tiempo
tarda en encontrar uno que actúe de lider.
El ángulo a que forman las direcciones de los campos E, y E, se denomina
ángulo de reorientación. Determina lo que deben "girar" fragmentos de DNA cada
vez que se cambia la orientación del campo. Se utilizan ángulos > 100". Cuando se
opera a un ángulo fijo éste es de 120". Si el dispositivo empleado permite seleccio-
ELECTROFORESISDE CAMPO PULSANTE

DNA
%
A B C
FIGURA 5.45. Migración de fragmentos grandes (> 50 Kb) de DNA (A, B y C) en electroforesis de campo pulsante.
En disolución, los fragmentos están en una conformación al azar (parte inferior). Bajo la acción de los campos eléc-
tricos (El, E2) se estiran en la dirección del campo correspondiente. Al aplicar El (recuadro izquierdo), A, B y C
migran por reptación a través del entramado de agarosa (óvalos sombreados). Al aplicar E2 (recuadro derecho),
perpendicular a El, los fragmentos se reorientan en la nueva dirección. Mientras que A lo hace rápidamente, por su
menor tamaño, B está parcialmente reorientado según E2, retrasándose respecto a A. C, debido a su gran tamaño,
tarda más tiempo en encontrar el camino y se retrasa respecto a B y A. Por sucesivas alternancias de El y E2 se con-
siguen separar los diferentes fragmentos según su tamaño.
nar diferentes ángulos, se trabaja entre 100" y 120". Esto es particularmente útil
para la separación de fragmentos muy grandes (> 2 Mb) en los que se utiliza un a
de 106".
La duración de los campos eléctricos que se alternan determina el intervalo de
los tamaños de DNA que se pueden separar. Se denomina duración del pulso (o
simplemente pulso) o intervalo de cambio, Zc, al tiempo durante el que se mantiene
un campo en una dirección dada. Para los sistemas de rotación (ver más adelante)
se corresponde con el tiempo que se mantiene el gel en una determinada orienta-
ción. Los Ic varían mucho, desde fracciones de segundo para fragmentos pequeños,
hasta 1-2 horas para los mayores (> 5 Mb) (Cuadro 5.3). Para un Zc dado, aquellos
fragmentos que no hayan tenido tiempo de reorientarse en esa dirección (los de
gran tamaño), no se separan. Pero no permanecen inmóviles en el gel. Se mueven
muy lentamente, pero juntos, sin resolverse en bandas distintas. Aparecen, normal-
mente, como una zona más o menos ancha (según el tamaño del DNA y la concen-
tración de agarosa utilizada) en la parte superior de gel. Dicha zona se denomina
zona de compresión.
La utilidad de la PFGE es análoga a la de la electroforesis convencional, salvo
que los fragmentos de DNA separados son de mayor tamaño. Esto hace que la
transferencia a membranas no pueda hacerse directamente, ya que para tamaños >
20 Kb, los fragmentos se han de dividir en otros menores, mediante radiación UV o
tratamiento con ácido (HCI). La PFGE puede ser utilizada para electroforesis bidi-
mensionales, cambiando las condiciones en cada dimensión. Esto permite el mapeo

génico de grandes regiones de DNA o de cromosomas pequeños enteros. En la pri-
mera dimensión se separan, por ejemplo, los distintos cromosomas de un organis-
mo que se desea estudiar. Posteriormente se digieren con una o más endonucleasas
de restricción, y los fragmentos resultantes se separan en una segunda dimensión,
en la cual se ajustan nuevamente las condiciones a los tamaños esperados. Así pue-
den llegar a construirse bibliotecas genómicas específicas de cada cromosoma. No
pueden separarse, sin embargo, cromosomas humanos, de tamaños comprendidos
entre 50 y 400 Mb. Pero permite el mapeo de distintos loci, o el estudio de genes
muy grandes que no pueden separase por otros métodos.
La PFGE también puede utilizarse de forma preparativa para el aislamiento 'de
fragmentos grandes de DNA, y es un método alternativo a la centrifugación isopíc-
nica (Capítulo 4).
El equipo necesario para realizar una PFGE se diferencia notablemente del de
otras electroforesis, tanto en la cubeta como en la fuente de alimentación. La cube-
ta tiene un conjunto de electrodos, en lugar de un par, cuya disposición y diseño
posibilitan las distintas orientaciones del campo eléctrico. Los cambios periódicos
de polaridad producen una marcada corrosión en los electrodos de platino, por lo
que éstos son de mayor grosor que en otros tipos de electroforesis. La cubeta tiene,
además, un sistema de recirculación del tampón a temperatura estrictamente con-
trolada, de modo que no haya variaciones en la temperatura en el gel y se minimi-
cen los fenómenos de electrolisis. Finalmente la fuente de tensión debe poseer
algún sistema para producir la alternancia del campo eléctrico.
5.9.7. Modalidades de PFGE
Los distintos tipos de PFGE son todos una modificación de la electroforesis

submarina en geles de agarosa.
PFGE Ortogonal. La Figura 5.46 muestra el diseño original de Schwartz y Can-
tor. En él, uno de los campos que se aplica es homogéneo y el otro heterogéneo.
Este último se consigue mediante un conjunto de electrodos (cátodo) y un único
electrodo puntual (ánodo). Hay una modificación de este diseño en la que los dos
campos que se aplican son heterogéneos. Esto se consigue con un cátodo largo y un
ánodo corto (pero no puntual). Con esta disposición, los fragmentos de D N A
migran con trayectorias curvas, excepto en el carril central (Figura 5.46).
Campos Inversos. Es el sistema más sencillo y puede llevarse a cabo en una
cubeta convencional. La polaridad se invierte en cada ciclo, y así el cambio supone
una inversión del sentido del campo eléctrico (el ángulo de reorientación es de
180") (Figura 5.46). Es el sistema con mayor resolución para fragmentos de tama-
ños inferiores a 750 Kb. Puede variarse el voltaje, el tiempo, o ambos parámetros,
en cada orientación. Habitualmente, con una relación 3:l para los dos Ic, se consi-
guen buenas resoluciones. El método más resolutivo se logra aplicando voltajes y
tiempos distintos en una y otra orientación, de modo que el producto (voltaje x
tiempo) para el campo primero sea sólo ligeramente superior al del segundo.
Obsérvese que dicho producto en un sentido dado (por ejemplo, según E,) debe ser
F IGURA 5.46. Modalidades de PFGE.

En la zona central, en cada caso, se
representa el gel de agarosa. Rodeán-
dole se muestran los distintos tipos de
electrodos, puntuales ( 0 ) o lineales (-).
Las flechas indican la trayectoria en el
gel de los fragmentos de DNA, excep-
to en la parte (c) que muestra las posi-
bles orientaciones del gel respecto a
los electrodos. (Parte a), ortogonal:
(diseño original de Schwartz y Can-
tor), obsérvese el electrodo puntual
único (+); parte derecha: modificación
del anterior, con dos campos eléctricos
heterogéneos. (Parte b), campos inver-
sos (FIGE). (Parte c), rotatorio. (Parte
d), transversal. (Parte e), hexagonal
(veáse la Figura 5.47).
mayor que en el otro sentido para así obtener un avance positivo de los fragmentos
de DNA según E,.
Sistemas rotatorios (campo cruzado). En ellos se hace girar el gel manteniendo
constante el campo eléctrico, o se gira el campo (los electrodos) manteniendo fija la
posición del gel. La primera opción simplifica mucho el diseño. El gel se gira en
cada ciclo el ángulo deseado, lo que permite utilizar distintos ángulos de reorienta-
ción según el tamaño de los fragmentos a separar.
Campos Tranversales. El gel se coloca en posición vertical, y cada uno de los
campos eléctricos actúa del modo que se muestra en la Figura 5.46. Obsérvese que
la orientación de cada campo eléctrico con respecto al gel varía en cada zona de
éste (en la parte superior del gel es cercano a los 120°, y en la parte inferior próxi-
mo a 170"). E n consecuencia, los ángulos de reorientación varian a lo largo del gel,
y la velocidad de migración de los fragmentos también. Donde el ángulo de reo-
rientación es mayor, se separan mejor los fragmentos mayores, pero en la parte
inferior del gel los fragmentos menores se apilan por una peor resolución.
Sistema Hexagonal Homogéneo. Se genera un campo eléctrico homogéneo
mediante un conjunto de 24 electrodos dispuestos con simetria hexagonal (Figura
5.46), con cuatro electrodos en cada lado. Con esta disposición fija, el ángulo de
reorientación es de 120" (ó 60") pero puede cambiarse a otros valores alterando
electrónicamente el circuito. Una descripción más detallada d e este sistema se pre-
senta e n la Figura 5.47.
Campos Programables. Es el sistema más complejo (y más caro) y permite lle-
var a cabo todas las modalidades de PFGE. El diseño es similar al anterior, con 24
electrodos, pero, mediante un computador, se regula, de manera independiente, el
voltaje en cada electrodo. Permite todo tipo de variaciones, pudiéndose seleccionar
ángulos de reorientación, campos eléctricos múltiples, etc. (Figura 5.48).
F IGURA 5.47. Cubeta utilizada para P F G E con simetría

hcxagonal. (Parte A), tapa con cable de conexión incorpo-
rado (retirando la tapa se desconecta la corriente). (Parte
B), dispositivo hexagonal con los electrodos embutidos.
(Parte C), plataforma con cl gel incorporado (ver Figura
5.49). (Parte B ) ,cubeta con el sistema refrigerante (serpen-
tín) en su base. El conjunto se emsambla, según está dis-
puesto en la Figura ( C sobre D, B sobre C, y A sobre los
anteriores) (Cortesía de Pharmacia).
F IGURA 5.48. Distintos tipos de campos

eléctricos generados en PFGE, utilizan-
d o la cubeta d e la Figura anterior, en
función de los electrodos seleccionados.
Obsérvese la posición del gel (cuadrado)
respecto a las líneas dc fuerza del campo
eléctrico (Cortesía d c Pharmacia).
5.9.8. Preparación de los geles. Aplicación de la muestra
La preparación de los geles de agarosa no difiere de lo ya descrito para otras

electroforesis de DNA. Se utilizan geles (20 x 20 ó 15 x 15 cm) de agarosa al 0,5-
1.0%, de bajo flujo electroendosmótico y elevada resistencia (Figura 5.49).
F IGURA 5.49. Preparación de un gel de agarosa para PFGE.

(Parte A ) , la agarosa fundida se vierte sobre la bandeja que
lleva adosado el molde. (Parte B), colocación del peine,
soportado en los extremos, sobre el molde. (Parte C), una
vez gelificada la agarosa, se retira el molde, quedando el gel
sobre la bandeja, que se coloca en la cubeta (ver Figura 5.47)
(Cortesía de Pharmacia).
La preparación y aplicación de la muestra es la fase más delicada de la PFGE.

por el gran tamaño de las estructuras que se manejan, lo que las hace fácilmente
fragmentables. El DNA puede cargarse en el gel como una disolución concentrada
(de mucha viscosidad), junto con agarosa fundida, o embebido en pequeños blo-
ques o tacos de agarosa sólida. El utilizar una u otra forma depende del tamaño de!
DNA a analizar y de la naturaleza de la muestra. Los fragmentos de 200-300 Kb
pueden cargarse como disoluciones directamente en el gel. Es difícil, sin embargo.
conseguir fragmentos > 500 Kb en disolución. En tales casos, no se emplea DNA
aislado como tal y sí las propias células que lo contienen. La preparación celular
(suspensión de células), en número adecuado para proporcionar suficiente DNA.
se mezcla con agarosa de bajo punto de fusión y se deja gelificar en pequeños blo-
ques o tacos. Estos se insertan posteriormente en pocillos de tamaño adecuadc
para que encajen de forma ajustada. Pueden prepararse bloques grandes (sobre
una placa Petri, por ejemplo) y luego cortarse del tamaño de los pocillos (Figura
5.50); o utilizar moldes de las mismas dimensiones que las de los pocillos. Con esta
manipulación, el DNA queda protegido de las roturas por el manejo físico y de la
F I G U R A 5.50. Preparación de
la muestra para PFGE en blo-
DNA
ques de agarosa. A partir de
células un bloque grande, que contie-
1Visis celulares (detergenes)
2Wigestión de proteínas de la cromatina con ne las células cuyo DNA se
proteinasa k desea analizar, se cortan pe-
3Wigestión de DNAcon enzimas de restricción queños tacos (parte superior)
del tamaño de los pocillos
practicados en el gel (parte
gel agarosa
inferior). Todos los procesos
de lisis celular y digestiones
enzimáticas se realizan sobre
el taco de agarosa.
degradación enzimática (no se debe olvidar que la manipulación habitual en el

laboratorio -pipeteo, precipitación, etc.- fragmenta esas grandes estructuras d e
DNA). Concentraciones celulares de 107-109células/mlpueden proporcionar 50-80
pglml de DNA. Una vez embebidas las células en la agarosa, todas las manipulacio-
nes posteriores se llevan a cabo sobre el bloque de agarosa. Hay diversos métodos
para la digestión enzimática y la solubilización de las células que contienen al
'DNA, así como para la digestión con nucleasas de restricción del DNA liberado.
Deben utilizarse agarosas de la máxima pureza, compatibles con la actividad enzi-
mática de las endonucleasas de restricción. La digestión del DNA en los bloques de
agarosa puede realizarse en fase líquida (fundiendo la agarosa), o por difusión de
las enzimas en el bloque. Se prefiere la digestión en fase líquida cuando se quieren
generar fragmentos < 500 Kb. Las enzimas son más accesibles al D N A en fase líqui-
da y se consigue así una mayor digestión. Para enzimas de restricción que produz-
can fragmentos > 500 Kb se utiliza la digestión en el bloque.
Para la estimación del tamaño molecular de los fragmentos de D N A separados
por PFGE se utilizan como referencia fragmentos de tamaño conocido, o cromoso-
mas de levadura (cuyo tamaño es conocido de forma aproximada). Utilizando el
D N A de fagos, formado mediante unidades de extremos cohesivos, pueden gene-
rarse fragmentos de D N A con más o menos unidades repetidas, de tal modo que se
consiguen tamaños que se diferencian progresivamente en una unidad. Al analizar-
los por PFGE se distribuyen escalonadamente, migrando según su tamaño. Como
el de la unidad repetida es conocido, se puede estimar el tamaño de los fragmentos
analizados en los pocillos adyacentes. El tamaño de los fragmentos grandes (> 2
Mb) se estima por comparación con cromosomas de Saccharomyces Cerevisae
(Figura 5.51), Schizosaccharomyces Pombe (3 cromosomas de 3.5, 4.7 y 5.7 Mb),
F I G U R A 5.51. Marcadores d e tamaño en PFGE, co-

rrespondientes a los 16 cromosomas de Saccharomy-
ces Cerevisae, que abarcan desde 225 a 1.900 Kb.
Neurospora (cromosoma > 10 Mb), Cándida, etc. Tanto unos como otros marcado-
res pueden prepararse o ser adquiridos comercialmente.
5.9.9. Facfores que afectan a la resolución en PFGE
Un hecho característico de las separaciones de DNA por PFGE es que la reso-

lución es diferente en las distintas zonas del gel. Se diferencian varias (3-4) regiones
según su grado de resolución (Figura 5.52). El voltaje, el tipo de agarosa y el tam-
pón, la temperatura y particularmente el intervalo de cambio (Ic), son las variables
fundamentales que afectan a la PFGE. De todas ellas lo determinante es el Ic, aun-
que todas las variables se afectan mutuamente.
Intervalo de cambio. La gama de tamaños de DNA que pueden separarse pcr
PFGE es directamente proporcional al Ic seleccionado. Debe escogerse el Ic más
corto que separe los fragmentos de interés. Mediante representaciones gráficas de
la distancia recorrida frente al tamaño de los fragmentos de D N A (gráficos de
movilidad; Figura 5.53), utilizando distintos Ic, pueden conocerse los límites d e
tamaño que pueden separarse y el grado en que se resolverían. Actualmente ésto e s
I ZONA 4
ZONA 3
ZONA 2
ZONA 1
FIGURA 5.52. Zonas con distinto grado de resolución en PFGE. En la zona
1 los fragmentos migran estrictamente según su tamaño. Tras una corta
región de baja resolución (zona 2), la zona 3, de extensión similar a la 1,
muestra el máximo d e resolución, aunque con bandas más difusas que en
la l . E n la zona 4, los fragmentos no s e separan, apareciendo como un
continuo. En esta zona, de muy baja resolución, tiene lugar la inversión de
bandas, fenómeno característico d e la PFGE, especialmente en la modali-
l dad FIGE. La flecha indica el punto d e aplicación d e la muestra.
bien conocido, por lo que es sencillo seleccionar este parámetro (Cuadro 5.3). Para
el caso de fragmentos grandes (> 10 Mb, o cromosomas), especialmente sensibles a
pequeños cambios en el Ic, los valores óptimos deben escogerse experimentalmen-
te. La resolución que puede esperarse con uno u otro valor de Ic se puede deducir
de la pendiente de las gráficas que aparecen en la Figura 5.53. A mayor pendiente
mayor resolución. Obsérvese que cuanto mayor es el Ic menor pendiente tienen las
rectas, por lo que conviene escoger el menor Ic que separe un intervalo dado tama-
ños, para así obtener el máximo de resolución (Cuadro 5.3).
Si se utiliza un Ic variable durante la electroforesis, puede evitarse, parcialmen-
te, el que aparezcan zonas de distinta resolución a lo largo del gel, así como la
inversión de bandas antes descrita (Figura 5.52). De este modo puede conseguirse
que todo el gel se comporte como la zona 1, en la que los fragmentos se ordenan
según su tamaño. Habitualmente se utilizan Ic cortos (por ejemplo 20 segundos) al
comienzo de la electroforesis, y se incrementan paulatinamente, finalizando con,
por ejemplo, 120 segundos (para fragmentos de DNA entre 200 y 1000 Kb). Con el
incremento progresivo de Ic se elimina la zona 2, y se pueden estimar con mayor
precisión los tamaños correspondientes a cada fragmento, a todo lo largo del gel.
Sin embargo, la modificación progresiva del Ic no produce una relación lineal entre
tamaño y distancia migrada. Lo que se consigue es que no haya zonas de muy dis-
tinta resolución.
Voltaje. Como los tamaños de los geles son muy similares en las distintas moda-
lidades de PFGE, es sencilla la comparación entre los distintos campos aplicados. A
CUADRO 5.3
Relación entre Ic y resolución
Intervalo de Resolución Duración Voltaje

Ic
separación máxima proceso (h] N
0,3 S 1-10 Kb 1-10 Kb 1 450
0,5 S 5-30 Kb 10-25 Kb 2 450
0,8 S 30-50 Kb 35-50 Kb 3 450
5S 20-100 Kb 60-90 Kb 4 300
25 S 40-400 Kb 200-300 Kb 6 300
45 S 40-600 Kb 400-550 Kb 10-2A 300
100 S 40-1.000 Kb 700-900 Kb 17-40 1 65-200
125 S 1 00-1.600 Kb 800-1.200 Kb 17-40 165-200
20 rnin 1 -2,5 Mb 1,6-2,5 Mb 100-140 165-200
30 rnin 1,6-3 Mb 2,5-3 Mb 100-140 165-200
40 rnin 1,6-6 Mb 2,5-6 Mb 140 3O
75 min 2-9 Mb 3-6Mb 140-170 3O
90 rnin 1-10Mb 6-9 Mb 185 30
100 rnin 3-13 Mb 7-10 Mb 190-200 30 (*l
180 rnin 3-13 Mb 10-13 Mb 190-200 27 (*)
Noto: En todos los casos se trato de geles de agarosa al 1,2%, excepto (*) en los que la concentración es del 0,6%.
F IGURA 5.53. Gráficos de movilidad. Mediante la repre-

sentación de la distancia migrada por el conjunto de los
fragmentos de DNA que pueden resolverse en un gel
dado, en función de su tamaño, pueden conocerse tres
parámetros importantes en PFGE: el intervalo de tama-
ños separables, la resolución esperada y el tiempo reque-
rido. La figura representa la movilidad de fragmentos de
DNA comprendidos entre 50 y 1.000 Kb, empleando dis-
tintos Ic (S: segundos). En la gráfica puede leerse direc-
tamente el límite de resolución para cada Ic. Con 45
segundos no pueden separarse fragmentos mayores de
600 Kb y con 60 segundos el límite es 800 Kb.
mayor voltaje mayor movilidad de los fragmentos de DNA, lo cual reduce la dura-
ción del proceso; pero también decrece la resolución. Con voltajes bajos, todo el
movimiento del DNA es menor, y también el de reorientación. Experimentalmente
se comprueba que la separación de fragmentos de D N A mayores de un cierto
tamaño (2 Mb), sólo se consigue con voltajes muy bajos, como los utilizados para
fragmentos pequeños. La razón de este hecho, que también ocurre en la electrofo-
resis convencional de DNA, no es bien conocida. Puede pensarse que un campo
eléctrico muy intenso agolpa los fragmentos de DNA contra el reticulado del gel, lo
que dificultaría su paso por los poros. Con un campo menos intenso, los fragmentos
serían impulsados más suavemente hacia los poros, penetrando más ordenadamen-
te. A los fragmentos pequeños, los altos voltajes no les afectan negativamente, por-
que rápidamente encuentran camino dada su reducida longitud. La conversión de
estructuras flexibles en varillas rígidas, previamente comentada, es otra posible
causa. Es importante resaltar que las variaciones en voltaje producen el mismo
efecto que las variaciones en Ic (se necesitan voltajes mayores cuanto mayores sean
los tamaños de los fragmentos a separar). Como ambas variables tienen efectos
similares, sus cambios deben compensarse, si quieren compararse electroforesis
diferentes. Así, si se aplica un voltaje elevado debe reducirse el Ic y viceversa, para
obtener la misma resolución.
Agarosa y tampón de electroforesis. Se utilizan agarosas con buena consistencia
mecánica (al 0,7-1,0%), bajo E E O y elevada pureza (debe estar garantizada la
ausencia de contaminantes que puedan degradar el DNA o interferir con las endo-
nucleasas de restricción que se emplearán con los fragmentos de DNA ya separa-
dos). Habitualmente se utiliza agarosa al 1% para tamaños de hasta 3 Mb y al 0,8%
(o menor) para fragmentos mayores. E n geles con baja concentración de agarosa
deben utilizarse valores altos de Ic, pero nunca incrementar el voltaje porque de-
crecería la resolución. La influencia del tampón en PFGE es similar que en la elec-
troforesis convencional. Sin embargo, como la PFGE puede durar varios días, para
separaciones de fragmentos muy grandes, no deben utilizarse tampones de poca
concentración que pierdan la capacidad tamponadora. Pero el aumento de fuerza
iónica decrece la velocidad de migración, por lo que deben escogerse concentracio-
nes de compromiso.
Temperatura. Influye directamente en la migración electroforética (cuanto
mayor sea, mayor es U). Sin embargo, al aumentar U, decrece la resolución. La U
de un fragmento de DNA a temperatura ambiente (20-22 "C) es casi el doble que a
10 "C. Para asegurar una temperatura uniforme a lo largo del gel y, simultáneamen-
te, evitar la descomposición del tampón, es necesario un control muy preciso de la
temperatura en PFGE. Lo más habitual es utilizar una temperatura de 15 "C. Tem-
peraturas < 10 "C producen una U muy baja.
5.9.10. PAGE de ácidos nucleicos en condiciones no desnaturalizantes
Permite la separación de fragmentos pequeños (< 500 bp) con una gran resolu-
ción. El D N A separado se extrae fácilmente y se obtiene muy puro. Además de con
fines preparativos se utiliza para el análisis de productos de PCR (Reacción en
Cadena de la Polimerasa) de poco tamaño, para la detección de mutaciones y para
la identificación de sitios de unión de proteínas. Con frecuencia se utilizan geles al
8%, con una relación de acrilamida/bisacrilamida de 19:1, que produce el poro
mínimo utilizable y la máxima resolución. Si el D N A no es radiactivo se suele
emplear la tinción con plata (se pueden detectar 0,03 nglmm2) pues el EtBr sólo
detecta cantidades mayores.
En este tipo de análisis la U está inversamente relacionada con el tamaño, como
en los geles de agarosa, pero viene influida tanto por la composición de bases como
2 82 Técnicas instrumentales d e análisis en Bioquímica
por la secuencia. Fragmentos de igual tamaño pueden tener movilidades diferentes.

No es por tanto adecuada para la estimación d e tamaños moleculares. Así, algunas
regiones del D N A poseen cierta curvatura, y las moléculas combadas tienen una L'
menor que las moléculas lineales del mismo tamaño, porque atraviesan peor los
poros de la PA. Regiones curvadas se observan en el D N A cuando, por ejemplo.
varias A (adenina) se repiten periódicamente cada 10-11 bp. Los segmentos de
D N A que presentan estas zonas, o zonas con un cierto grado de flexibilidad, tienen
un especial significado por corresponder a regiones de unión de proteínas y otras
moléculas. Los agrupamientos de A presentan una conformación distinta a la habi-
tual del D N A (forma B), y cuando están en fase imponen una conformación curva-
da a la región en la que se encuentran. Cuanto más hacia el centro de la molécula
esté la región rica en A , más se altera la conformación d e la molécula y menor
movilidad se observa (Figura 5.54).
F I G U R A 5.54. Efecto de la conforma-

ción del DNA sobre la U. (Parte
superior): las regiones ricas en A
inducen más (fragmento 1) o menos
(fragmentos 2 y 3) curvatura, según la
posición que ocupan en el fragmento.
Cuanto más curvado es éste, menor
movilidad presenta en el gel de PA
(parte inferior).
La detección de zonas de interacción de proteínas con el DNA o RNA se funda-

menta en que la U de los complejos DNA-proteína o RNA-proteína es menor que la
del D N A o R N A libre. Esto da lugar a un tipo de geles, los llamados geles de
retardo, con los que puede separarse y cuantificarse el DNA o RNA libre y el que
está unido formando los complejos DNA-proteína (Figura 5.55). La capacidad de
una proteína para reconocer una secuencia específica en el D N A requiere que
ambas moléculas estén en condiciones no desnaturalizantes. Se incuba un fragmento
de D N A (30-300 bp) d e doble cadena (habitualmente marcado radiactivamente)
con un extracto nuclear donde, presumiblemente, existen proteínas capaces de unir-
se específicamente a algunas regiones del DNA. El conjunto se carga e n un gel de
PA. Las moléculas de D N A libre penetran rápidamente en el gel. Los complejos
DNA-proteína se mueven más lentamente debido a su mayor tamaño. Puede poten-
ciarse este retardo añadiendo anticuerpos específicos de las proteínas, lo que incre-
r PROTEINAS
-
-
F I G U R A 5.55. Geles de retardo.

(Parte superior): (A), la mezcla de
DNA y proteínas se carga en el gel;
(B), al aplicar el campo eléctrico, el
A C
DNA libre migra rápidamente como
una banda; (C), los complejos DNA-
proteína quedan rezagados debido a
su mayor tamaño. (Parte inferior):
m' autorradiografía de un gel de retar-
- -4 do. La banda detectada en ausencia

de proteínas (D) cambia de movili-
dad en su presencia (b),indicando
m la formación de complejos DNA-
proteína. Este método se conoce
también como ensayo de cambio de
movilidad electroforética.
menta el tamaño de los complejos y disminuye su U. Con el DNA libre, formando

una banda de mayor U que los complejos, puede estimarse la estequiometría de los
complejos DNA-proteína. La detección de D N A libre y formando complejos se
lleva a cabo por los métodos habituales, mediante tinción, autorradiografía o trans-
ferencia a membranas.
La detección de delecciones o inserciones que afecten a un número considera-
ble de nucleótidos es también fácil, ya que modifican el tamaño del DNA y puede
detectarse por Southern blotting o PFGE. Cuando la mutacion afecta a una o unas
pocas bases puede detectarse utilizando PA como soporte. El método se basa en las
diferentes conformaciones que adquiere una cadena simple de DNA, en función de
su secuencia, y las distintas U que poseen las estructuras con diferente conforma-
ción. Se separan las dos hebras de un fragmento corto de DNA, con formamida a
95 "C y, a continuación, se enfría rápidamente. Cada cadena individual se pliega
con una conformación dada (por apareamiento de bases intracatenario) en función
de su secuencia. Segmentos monocatenarios de DNA de unos 300 nucleótidos, que
difieran en uno, son claramente distinguibles por su U diferente. Deben controlarse
muy estrictamente las condiciones experimentales (temperatura, concentración del
tampón) puesto que afectan a la conformación. Los fragmentos separados se detec-
tan por tinción con plata o con sondas radiactivas, una vez transferidos a membra-
nas. Pueden así distinguirse estructuras que presenten mutaciones, ya que se plega-
rán de forma distinta y tendrán diferente U que las que no presentan mutaciones.
La determinación de la secuencia de nucleotidos de este segmento permite identifi-
car la base mutada. Este método se conoce como polimorfismo conformacional
electroforético y es aplicable también a fragmentos bicatenarios.
5.9.1 1 . PAGE de ácidos nucleicos en condiciones desnaturalizantes.

La electroforesis en geles de PA en condiciones desnaturalizantes se utiliza para
la separación de fragmentos monocatenarios de DNA o RNA. Entre sus aplicacio-
nes se encuentran la secuenciación (determinación de la estructura primaria) de
DNA, la separación de oligonucleótidos, la identificación de zonas de unión de pro-
teínas al DNA o la detección de mutaciones. También se realizan así los ensayos de
protección de RNasa (identificación de un mRNA en una mezcla) o Nucleasa S1.
Los geles se polimerizan en presencia de agentes desnaturalizantes, habitualmente
urea o formamida, que interfieren con el apareamiento específico de las bases
nitrogenadas. No pueden usarse los tampones básicos, que desamidan la PA (pro-
duciendo un marcado EEO), o el hidróxido de metil mercurio, que inhibe su poli-
merización. El DNA desnaturalizado, con ambas hebras separadas, se mueve en
estos geles de acuerdo a su tamaño e independientemente de su composición de
bases o su secuencia. Es posible detectar bandas que contengan un mínimo de 1 ng
de DNA. Se logra mayor sensibilidad mediante tinción con plata, con la que pue-
den detectarse < 50 pg por banda, o utilizando DNA radiactivamente marcado.
Su utilidad es amplia. Así, en los métodos de secuenciación de DNA, el último
paso es una electroforesis vertical en PA en condiciones desnaturalizantes, que se
lleva a cabo en presencia de urea y a elevada temperatura (> 50 "C). Si la secuen-
ciación se realiza manualmente, se emplea D N A radiactivo que se detecta por
autorradiografia. Por ello se utilizan geles extremadamente finos (< 0,4 mm) que
pueden secarse rápidamente. Con secuenciación automática se utilizan las muestras
marcadas con compuestos fluorescentes.
Por otro lado, los oligonucleótidos son ampliamente usados en la Biología
Molecular actual, especialmente como cebadores para amplificar secuencias de
D N A (PCR), en métodos de secuencia, como sondas radiactivas, etc. Su síntesis se
realiza de modo automático, y el grado de pureza necesario depende de su poste-
rior uso. La electroforesis en geles de PA es actualmente el método óptimo para el
análisis, caracterización y aislamiento de oligonucleótidos sintéticos (hasta 200
nucleótidos). Variando la concentración de acrilamida, puede seleccionarse el gel
apropiado a los distintos tamaños de los oligonucleótidos a separar. Utilizando
geles en placa de PA pueden analizarse varias muestras simultáneamente. Todo ello
hace que esta electroforesis sea el método preferible para purificar oligonucleóti-
dos (Figura 5.56).
La preparación y características de estos geles son similares a lo ya descrito.
Como la resolución no se afecta por un alto voltaje, como ocurría con los fragmen-
tos grandes de DNA, la electroforesis se realiza al mayor voltaje posible, lo que
acorta el proceso. El aumento de temperatura que ésto produce no es perjudicial:
pero debe ser controlado dentro de unos límites. Así, la temperatura óptima para la
separación de oligonucleótidos sintéticos está entre 50-70 "C. Se escoge la máxima
concentración de acrilamida que permita la separación ya que así la difusión afecta
poco.
La muestra se aplica en presencia de desnaturalizantes (formamida para oligo-
nucleótidos pequeños, < 30 nucleótidos; o urea 7 M para tamaños mayores). Las
concentraciones dependen de las características del gel y de su finalidad, analítica o
FIGURA 5.56. Electroforesis d e diferentes muestras d e

oligonucleótidos en un gel d e PA (carriles 1 a 5). Carril
6: marcadores de tamaño (13 oligonucleótidos, desde S a
32 unidades, con un incremento progresivo dc dos uni-
dades; están todos en cantidades equimolares, excepto
el de 20, 20-mer, que está en un exceso x3, y sirve d e
referencia).
preparativa. En cuanto a cantidad de muestra, habitualmente se aplican concentra-

ciones de 1-2 unidades de absorbancia (A2(;()) por pl. La detección se realiza por
autorradiografía con oligonucleótidos marcados radiactivamente, o por fluorescen-
cia. E n este último caso, el sistema varía ligeramente de lo descrito para fragmentos
de DNA. Los oligonucleótidos se visualizan en el gel de PA, colocando éste sobre
una superficie que contiene un compuesto fluorescente. Iluminando con radiación
UV (254 nm), los oligonucleótidos absorben a esa A y se ven como bandas oscuras
que resaltan sobre un fondo fluorescente. Pueden ser así localizados y fotografiados
por los métodos descritos previamente. Esto es válido para geles preparativos, pero
puede ser que no se detecten las pequeñas cantidades utilizadas en los geles analíti-
cos. La tinción con plata es una alternativa en estos casos. Las bandas se pueden
recuperar por electroelución, o cortando la zona correspondiente y eluyendo con
posterioridad.
Como se ha indicado la separación ocurre en dependencia estricta del tamaño
(Figura 5.56). Sin embargo hay excepciones, en las que la movilidad se ve afectada
por la composición de bases y por la secuencia. Ello se debe a que en fragmentos
cortos se aprecian las pequeñas diferencias de carga de las bases, siendo particular-
mente lenta la G (Guanina) respecto a las otras tres (C, A, T), con un orden C > A >
T > G. Así, en una mezcla de oligonucleótidos del mismo tamaño, los que posean un
exceso de G, se retardan respecto de los demás. Si la composición es conocida, puede
predecirse su U. Igualmente tienen una U anómala aquellos que poseen secuencias
particulares, que les proporcionan una estructura secundaria muy estable, que no es
eliminada totalmente por la urea y la elevada temperatura. Es el caso de las secuen-
cias palindromes (simétricas respecto a un eje y ambas partes se asocian en doble
cadena) que forman un bucle muy estable. Estas secuencias son muy habituales en
las construcciones genéticas (sitios de restricción, regiones de unión, etc.).
Otra aplicación de esta electroforesis es la identificación de zonas de unión
específica de proteínas al DNA ("huellas"). Permite identificar la secuencia especí-
fica de D N A que es protegida por una proteína, frente a la acción de una enzima, la
DNAsa 1, o agentes químicos. Las proteínas se incuban con un fragmento de DNA
marcado radiactivamente en un extremo, en una cadena. La mezcla se trata con
DNAsa 1en condiciones suaves, de forma que, en promedio, cada cadena del DNA
sea cortada por la enzima una vez (en un único sitio). Se purifica el D N A y se
somete a electroforesis en PA en condiciones desnaturalizantes, para detectar el
tamaño de los fragmentos producidos por la enzima (Figura 5.57). Las proteínas
que se hubieran unido a alguna región del DNA en la incubación inicial, la prote-
gen del ataque por la DNAsa. La posición en la que la proteína estaba unida puede
identificarse en la región del fragmento de DNA que está libre de cortes ("huella").
Los geles de PA en condiciones desnaturalizantes permiten también detectar
mutaciones en el DNA, y estudiar como afecta la secuencia a la estabilidad de la
doble hélice. Las estructuras bicatenarias se desnaturalizan de forma diferente en
función de su secuencia. En un gel de PA puede establecerse un gradiente de un
agente desnaturalizante, o de temperatura si se dispone de la cubeta adecuada. La
U de una molécula bicatenaria se reduce mucho si la doble hélice está parcialmente
desnaturalizada, con regiones en las que las dos hebras están juntas y otras en lar
que están separadas. La desnaturalización es un proceso cooperativo, por lo que en
condiciones desnaturalizantes, se observan cambios notables en la U. El grado de
desnaturalización está relacionado con la secuencia y ocurre inicialmente en lar
regiones ricas en pares A-T. Al analizar fragmentos bicatenarios de D N A en geles
proteína -4
32P DNA
FIGURA 5.57. Técnica de la huella. Un
fragmento de DNA bicatenario, marcado
con 3 2 en~ una sola hebra (rectángulo hori-
zontal), se incuba con un extracto nuclear
que posee proteínas (se representa una;
círculo sombreado) capaces de reconocer
alguna región del DNA (zona sombreada).
La DNAsa 1 produce, en condiciones ade-
cuadas, un único corte en cada fragmento
de DNA. En ausencia de proteínas (dere-
cha), los fragmentos producidos, una vez
separados en el gel y detectados por auto-
rradiografía, aparecen de forma escalona-
da continua (parte inferior). En presencia
de proteínas (izquierda), la DNAsa 1 no
puede acceder a la zona protegida por la
proteína y no corta a ninguna molécula en
esa región. En la autorradiografía del gel ELECTROFORESIS
(parte inferior), aparece una zona sin ban-
das (huella) que, tras su secuenciación,
huella $ AUTORRADIOGRAFIA
permite identificar la zona de unión de la

proteína. La hebra no marcada es invisible
cn la autorradiografía, mientras que la
marcada señala la posición del corte.
de PA, con un gradiente de un agente desnaturalizante (habitualmente urea/forma-
mida), su U viene determinada por su estabilidad frente al desnaturalizante, y en
último grado por su secuencia. Fragmentos de DNA de unos 500 bp, que difieren
en un sólo par de bases, son claramente distinguibles. El desarrollo experimental es
idéntico a lo descrito para proteínas (apartado 5.8.12; Figura 5.27), obteniéndose
una banda sigmoidea de D N A a lo ancho del gel. Las condiciones desnaturalizantes
en geles d e PA se utilizan también como segunda dimensión para fragmentos de
DNA previamente separados por tamaño en un gel de agarosa.
5.9.12. Electroforesis bidimensional para ácidos nucleicos
Se utiliza para separar mezclas complejas de RNA que no pueden resolverse en

geles simples. Las condiciones cambian de la primera a la segunda dimensión: dife-
rente concentración de acrilamida (% T), condiciones desnaturalizantes, o cambios
de pH. Un cambio en (% T ) permite separar moléculas con conformación diferente,
y se utiliza para moléculas con tamaños comprendidos entre 80 y 400 nucleótidos.
Si la primera dimensión se realiza en condiciones nativas y la segunda en desnatu-
ralizantes, pueden separarse moléculas con alguna mella en su estructura. En la pri-
mera dimensión, las moléculas se mueven como una unidad, mantenidas por la
estructura secundaria y terciaria. E n la segunda (urea 6-8 M), tales estructuras
desaparecen y se observa la separación de los componentes creados por la mella. Se
emplea para la separación de mezclas de tRNAs y algunos mRNAs. Otras veces, en
la primera dimensión se utiliza un gel en condiciones desnaturalizantes (urea 7 M)
y p H ácido. Las moléculas se separan en función de la composición de bases, pues a
pH ácido (3,3) cada base tiene distinta carga, y la carga neta del RNA depende de
su longitud y composición de bases. En la segunda dimensión se emplean condicio-
nes no desnaturalizantes, p H 8,O-8,5, y alta concentración de acrilamida, separándo-
se las molécula según su tamaño. Se utiliza para analizar digeridos de RNA y espe-
cialmente para el caso de RNA viral digerido con RNAsa T I .
5.10. Electroforesis capilar
La electroforesis capilar (EC) comprende un conjunto de técnicas, iniciadas en

la década de los 80, que emplean capilares (7-100 cm de longitud; 20-200 p m de diá-
metro interno) para la separación de moléculas. Su objetivo es eminentemente ana-
lítico, aunque puede utilizarse de forma preparativa. Su uso se debe a las ventajas
que ofrece frente a otros métodos: a) utiliza altos voltajes (> 500 Vlcm; 10-20 mA),
lo cual da lugar a procesos muy rápidos (5-30 minutos; incluso se pueden conseguir
separaciones en 1 segundo); b) la migración de las moléculas se sigue mediante
detectores (absorbancia, fluorescencia, índice de refracción, conductividad, etc.); c)
se aplica a todo tipo de sustancias, desde pequeños iones a proteínas y ácidos
nucleicos; d) admite todas las modalidades de electroforesis conocidas, libre o de
zona, con multitud d e soportes; e) consigue una gran resolución, denominándose
habitualmente HPCE, acrónimo en inglés d e Electroforesis Capilar de Alta Resolu-
ción; f) se lleva a cabo en equipos totalmente automatizados (un ordenador contro-

la la inyección de la muestra, la temperatura, el voltaje, el tiempo, etc.), lo que
garantiza la reproducibilidad; g) emplea cantidades ínfimas de muestra (pmoles).
con volúmenes de nl (10-50 nl); h) consume volúmenes muy reducidos de tampón:
considérese que el equilibrado del capilar, antes de la electroforesis, con 5-10 veces
su volumen interno, requiere un total de 25-50 pl(100 ensayos consumen menos de
1 m1 de tampón; i) en condiciones estándar pueden conseguirse resoluciones simila-
res a las de los sistemas cromatográficos más eficaces, con 100.000-500.000 platos
teóricos/m (ver Capítulo 6); en condiciones óptimas estos valores pueden doblarse:
j) puede conectarse a otros aparatos, constituyendo técnicas combinadas de análisis
(Ec/espectrometría de masas, EC/cromatografía, etc.).
El equipo necesario (Figura 5.58) se compone de un capilar de cuarzo o silice
fundida, transparente a la radiación UV, con un detector acoplado. Los extremos
del capilar van colocados en sendos reservorios de tampón, donde se ubican los
electrodos, conectados a la fuente de alimentación (capaz de generar 30 KV). E1
capilar de cuarzo va recubierto de un polímero que le confiere flexibilidad. La
duración del capilar está limitada sólo por el tratamiento que reciba. Salvo que se
rompa, o quede inutilizado por la muestra (unión irreversible de proteínas, por
ejemplo), puede usarse casi indefinidamente (es habitual usarlos varios años).
Las sustancias analizadas se caracterizan por el tiempo de migración (t,,,),que
corresponde al tiempo empleado en recorrer el capilar desde su origen hasta e1
EEO -b EEO -b electroferograrna
t(min)
,
....
capilar
\ reservorio
tampón
Q -
fuente de
alimentación
F IGURA 5.58. Electroforesis capilar de zona. Diagrama del equipo utilizado. (Parte superior): a la izquierda se mues-
tra la disposición inicial de las moléculas según su carga, +, -, o neutra (N), y las fuerzas que las impulsan (represen-
tadas por las flechas); a la derecha, el EEO obliga a todas las moléculas, incluidas las de carga negativa, a ir hacia el
cátodo. El detector genera una señal (absorbancia, fluorescencia, etc.) que refleja el avance de las moléculas.
detector (situado en un extremo; Figura 5.58). Dado que la separación ocurre en el

interior del capilar, la superficie de las paredes está en elevada proporción respecto
al volumen del líquido. Por ello, el E E O cobra una importancia esencial en la EC,
ya que la superficie del capilar posee grupos silanol ionizables (-OH + O-), respon-
sables del EEO. El comportamiento de las moléculas en E C depende de su U y del
EEO. Este, en unos casos se aprovecha, y en otros se suprime totalmente, en fun-
ción de la naturaleza de las sustancias a separar. El t,, depende en gran medida del
EEO, que a su vez depende de diversas variables, incluyendo la integridad de la
pared. A pH básico, el E E O es elevado (grupos -O-) y se reduce a pH ácido (gru-
pos silanol - 0 H ) . El E E O puede suprimirse recubriendo las paredes con diversos
compuestos (tapizado del capilar). Esto, además, impide la unión inespecífica (elec-
trostática) de la muestra a las paredes. Dicha unión puede también inhibirse con
tampones de alta fuerza iónica, pero se incrementa el efecto Joule.
La difusión es el factor que más contribuye al ensanchamiento de las bandas en
EC. Sin embargo, debido al alto voltaje empleado se pueden alcanzar tiempos tan
cortos de separación que el efecto de la difusión es mínimo, lo que redunda en la
gran resolución de esta técnica. Un menor calibre del capilar produce mayor resolu-
ción; sin embargo hay un límite en cuanto al diámetro interno, para evitar oclusio-
nes y atascos causados por la muestra o el tampón. Al utilizarse un capilar, la alta
relación superficie/volumen antes citada, permite una eficaz disipación del calor
producido por el efecto Joule. Pueden así utilizarse voltajes de 30 KV, con el capilar
a temperatura ambiente, o estrictamente controlada (habitualmente a 25 "C).
Hay varias modalidades de EC, entre las que se incluyen: EC de Zona que es la
más sencilla, con un tampón homogéneo y un campo eléctrico constante. Utiliza
capilares con un diámetro interno de 25-75 pm, tratados químicamente para asegu-
rar una carga uniforme. Se usa con tampones de baja fuerza iónica. La muestra se
introduce aplicando voltaje o hidrodinámicamente (por succión o presión). La sepa-
ración de los componentes de la muestra ocurre por diferencias en su densidad de
carga. Es la modalidad que mejor refleja una verdadera electroforesis libre, ocu-
rriendo en un medio líquido, con un mínimo de interacciones.
Electroenfoque. Utiliza capilares tapizados. A diferencia del E E F convencional,
una vez terminado el proceso, con las proteínas focalizadas en su pI, éstas deben
ser movilizadas para que pasen por el detector y sean identificadas. El gradiente de
p H se establece entre los extremos del capilar, utilizando anfolitos, y controlándose
con marcadores de pI. Se utiliza especialmente para el estudio de variantes genéti-
cas de proteínas (hemoglobinas, por ejemplo), de modificaciones postraduccionales
de proteínas recombinantes, etc.
EC en Geles. Los capilares se rellenan de materiales como los soportes ya des-
critos. El soporte queda unido al capilar (poliacrilamida; para separar proteínas) o
libre en disolución (metil-celulosa, poliacrilamida lineal; para separar fragmentos
de DNA). La agarosa no se utiliza pues no resiste la temperatura que se genera.
Los geles suprimen el E E O del capilar. Lo descrito para PAGE-SDS de proteínas
se cumple cuando los capilares se rellenan de PA, con las ventajas añadidas de la
EC. La detección de mutaciones en fragmentos cortos de DNA, puede realizarse
en geles de PA, en condiciones desnaturalizantes, en menos de 30 minutos. Igual-
l mente, la separación de fragmentos pequeños de DNA, y especialmente de oligo-

nucleótidos, es uno de los usos preferentes de la EC. Fragmentos bicatenarios linea-

les de D N A pueden separarse utilizando geles a base de cadenas poliméricas nc
unidas entre sí, que producen geles laxos, muy porosos (como la hidroxipropilmeti!
celulosa), en capilares tapizados. En estas condiciones, el t, está directamente rela-
cionado con el número de pares de bases del DNA.
Cromatografía micelar electrocinética capilar. Se desarrolló por la necesidad de
separar sustancias neutras o no cargadas. Se añade al tampón de la electroforesis
un detergente (formador de micelas; el SDS es el más utilizado), de forma que en la
separación influye la U de las moléculas y su afinidad por las micelas. Se utiliza pre-
ferentemente para compuestos de baja masa molecular (vitaminas, aminoácidos.
catecolaminas, antibióticos, etc.). A pH neutro o básico, el E E O dirige a los catio-
nes hacia el cátodo. Empleando SDS, sus micelas cargadas negativamente se diri-
gen al ánodo, a contracorriente del E E O , que las retarda. Las moléculas de la
muestra se reparten, en mayor o menor medida, según su grado de hidrofobicidad.
dentro o fuera de las micelas. cuando están dentro, su migración se retarda. Cuan-
do están fuera, se aceleran hacia el cátodo (las moléculas no cargadas se mueven
según el EEO). Por tanto, las sustancias con mayor afinidad por las micelas se mue-
ven más lentamente que las que pasan la mayor parte de su tiempo en el tampón.
En consecuencia, el orden de migración es aniones > sustancias neutras > cationes.
Los aniones son repelidos electrostáticamente por las micelas, por lo que están per-
manentemente en la fase acuosa. Las moléculas neutras son separadas exclusiva-
mente en función de su hidrofobicidad y los cationes eluyen los últimos por su
atracción electrostática con las micelas. Estas características generales varían en
función de la naturaleza de los compuestos a separar.
El Cuadro 5.4 resume las distintas modalidades de EC, el criterio de separación
determinante, y las sustancias a las que se aplica.
CUADRO 5.4
Modalidades de electroforesis capilar (EC), en relación a l criterio que rige l a separación
y las sustancias para los que se emplean
Modalidad Criterio de separación Sustancias
EC de zona Densidad de carga Moléculas pequeñas, péptidos,

proteínas, DNA pequeño
Electroenfoque PI Péptidos, proteínas
CMEC Moléculas cargadas Moléculas pequeñas, péptidos,

Densidad de carga y coeficiente de reparto DNA
en las rnicelas, según la hidrofobicidad
Moléculas neutros
Coeficiente de reparto en las rnicelas,
según su hidrofobicidad
EC en gel
Desnaturalizante Masa rnolecular Péptidos, proteínas, DNA
N o desnaturalizante Tamaño y densidad de carga
CMEC, crornatografía micelar electrocinética capilar.

Capitulo 5

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5.1.

La electroforesis es un transporte bajo la acción de un campo eléctrico. Admiti-

Se trata de un parámetro con menor trascendencia que la que tenía S en la centrifu-

La electroforesis se puede desarrollar de dos maneras (Figura 5.1). E n la llama-

5.2. Electroforesis de zona. Equipo electroforético

difusión y las posibles corrientes de convección. En la centrifugación zonal, que

F I G U R A 5.3. Preparación de un gel

F I G U R A 5.4. (Parte A ) : estructura quí-

ta en forma de tiras estrechas y alargadas, de apariencia similar al papel satinado.

5.3. Factores que afectan a la electroforesis

El resultado de una electroforesis depende de diferentes factores y es necesario

5.3.1. Campo eléctrico

Es lo que posibilita que haya electroforesis. A su vez, como gradiente de potencial

La U de una molécula es tanto mayor cuanto mayor sea su carga, y disminuye

Durante la electroforesis se produce electrolisis del agua, generándose protones

ción se encuentran con un flujo de cationes, desplazándose sobre la superficie del

5.4. Electroforesis en soportes no restrictivos

Inicialmente se va a describir el caso de las proteínas, tratándose posteriormen-

@mG aplicación longitudinal

F I G U R A 5.8. Electroforesis en agar de 5 muestras de suero

FIGURA 5.9. Electroforesis automatiza-

proteínas tinción tampón

Es una combinación de una electroforesis en gel de agar (o agarosa) seguida de

pocillo trinchera proteínas

electroforesis (agar) inmunodifusión bandas de precipitación

F IGURA 5.12. Fotografía de las bandas de precipitación en una

pos (antisuero). La gran especificidad y sensibilidad de las reacciones de precipi-

5.6. Electroforesis en geles de poliacrilamida

La electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE, del inglés PolyAcrylamide

aunque también es útil para ácidos nucleicos (apartados 5.9.10 y 5.9.11). Es el

5.6.1. Preparación del soporte

El soporte se prepara a partir de un compuesto de bajo peso molecular (acri-

dad, grado de reticulación (tamaño del poro), etc. La polimerización de la acrilami-

Proteína M [kDa) Longitud [A) Diámetro

Concentración de acrilamida (%TI kDa

3-5 > 100

5.6.2. PAGE en placa

Es la forma habitual en que se desarrolla la PAGE. Puede llevarse a cabo en

'\ ; ' espaciadores

electroforesis, en función de la muestra. El campo eléctrico está orientado en la

La segunda modalidad es la de geles en gradiente, en los que la concentración

5.6.3. Cubeta para PAGE en placa

5.6.4. Aplicación de la muestra

sibles. E n el tampón de la muestra, también se añade el marcador electroforético

5.6.5. PAGE en condiciones no desnaturalizantes en sistemas de tampón continuo

La modalidad de PAGE más sencilla es la descrita en los apartados previos:

5.6.6. PAGE en condiciones no desnaturalizantes en sistemas

En esta modalidad, el tampón presente en los reservorios es diferente al que

5.6.7. focalización de los componentes separados: tinción

F I G U R A 5.19. Análisis por PAGE (gel de acrilamida al 7%) de

Marcar proteínas con algún radioisótopo, es el método de detección más sensi-

5.6.8. Transferencia a membranas

Finalizada la PAGE, se puede también obtener información acerca de la identi-

5.20 a 5.22). El proceso de transferencia se suele denominar blotting (pues un blot-

FIGURA 5.20. (Parte A), transferen- A - rnernbrana

membrana C C CCCC C C 4 CC transferencia

gel (electrotransferencia). Hay dos sistemas para llevarla a cabo. En el primero, se

base de la cubeta. El sistema semi-seco es más utilizado porque presenta varias

5.6.9. Caracterización de bandas. l a PAGE como criterio de pureza

identificar el número mínimo de componentes (bandas) de cada muestra. Cada

5.6.10. Estimación de masas moleculares de proteínas por PAGE

En PAGE, la U de una proteína depende de su carga neta y de su tamaño. Si se

en la que U, es movilidad electroforética relativa, y log Yoes la intersección con el

5.6.111. PAGE preparativa