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Resonancia Magntica Nuclear

5.9 RMN Bidimensional Un experimento multipulso contiene etapas de preparacin, evolucin y deteccin. Los espectros que se obtiene en estos experimentos dependen de la naturaleza de la preparacin y de la longitud del periodo de evolucin. Lo que ocurre durante el perodo de evolucin no es detectado directamente, pero puede estimarse realizando mltiples experimentos con periodos de evolucin de diferente duracin. De esta forma puede obtenerse informacin sobre dos conjuntos separados de parmetros espectrales: aquel que influye sobre la magnetizacin durante el periodo de evolucin y el que acta durante la adquisicin propiamente dicha. En RMN-2D se utiliza una segunda transfomada de Fourier para convertir la dependencia temporal durante la evolucin en una segunda frecuencia, lo que permite disear experimentos de diversa ndole, muy ricos en informacin. La idea original sobre RMN-Bidimensional (RMN-2D) se debe a Jeener (1971), aunque fue llevada a la prctica por Ernst y colaboradores en 1976. La RMN-2D corresponde a la generacin de espectros de RMN con dos frecuencias como variables independientes. Estos espectros RMN-2D se generan registrando FID (t 2 )
B B

al final de una secuencia de pulsos con variacin sistemtica de otro parmetro, ms comnmente el tiempo de evolucin t 1 entre un par de pulsos. Los FIDs sucesivos se
B B

adquieren por incremento de los tiempos de evolucin y se almacenan como filas en una matriz de datos, tal como se muestra en la Figura 5.121, donde se comparan las tcnicas 1D y 2D. El espectro 2D se obtiene por una doble transformacin de Fourier (2D-TF). Esta doble transformacin consiste en TF unidimensionales a todas las filas y columnas de la matriz de datos. Una 2D-TF conduce al espectro 2D que muestran picos mezclas de componentes de absorcin y dispersin que pueden muchas veces corregirse por ciclado de fases y manipulacin de los datos, resultando en espectros con fases absortivas puras. Dependiendo de la secuencia de pulsos, se obtienen correlaciones muy tiles entre diferentes picos de los espectros 1D o se simplifican espectros 1D muy superpuestos por dispersin en las nuevas dimensiones. Los experimentos de ms de dos dimensiones (RMN-3D y -4D) se generan introduciendo tiempos de evolucin adicionales y necesarias. se aplican principalmente en el campo de las biomolculas, donde la complejidad estructural y la superposicin espectral las hacen

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Figura 5.121 RMN-1D y -2D

Existen diferentes

mtodos, basados en la tcnica del eco de espines

en la

transferencia de polarizacin, que permiten editar un espectro 1D del espn heteronuclear X, y que suministran informacin sobre el nmero de hidrgenos unidos al heterotomo (APT, INEPT, DEPT). Sin embargo, estos mtodos no aportan evidencias directas sobre qu protones estn unidos a cada heteroncleo (tomo de carbono) en una molcula. Los experimentos de correlacin heteronuclear nos permiten resolver este problema. Comenzaremos el anlisis de las tcnicas de RMN-2D con el experimento de correlacin de desplazamientos qumicos heteronuclear (HETCOR), en el que en una dimensin tenemos la informacin sobre un tipo de espn, usualmente
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P P

C, y en la otra sobre los

protones acoplados. Cada seal o pico en el diagrama de contornos nos informa sobre los desplazamientos qumicos de un ncleo de carbono y de los protones con los que est directamente enlazado. Tal espectro permite una asignacin de las seales de
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P P

C si se

conocen los desplazamientos qumicos de los protones o viceversa. Tambin podemos asignar las seales protnicas en caso que la superposicin sea muy fuerte en el espectro monodimensional, si en el espectro de
13
P P

C, como es habitual,

se tiene una buena

dispersin de seales. Este experimento puede considerarse como un anlogo

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bidimensional del INEPT, presentando el mismo incremento en sensibilidad derivado de la transferencia de polarizacin desde los protones a los ncleos de menor razn magnetogrica. Utilizaremos el modelo vectorial, aplicado anteriormente en los experimentos multipulsos, que nos permite tener una idea de las bases fsicas de algunas de las secuencias ms comunes. Es importante sealar que este modelo no es aplicable a la descripcin de la mayora de los experimentos de RMN bidimensional basados en el acoplamiento escalar, pero si es aplicable al experimento HETCOR. Un tratamiento ms riguroso y general, aplicable en sistemas con acoplamiento escalar dbil, es el formalismo del operador producto. Su complejidad no nos permite incluirlo en este texto. 5.9.1 Experimento de correlacin heteronuclear directa HC-COSY (Heteronuclear correlation, HETCOR) Este experimento bidimensional (Freeman, Morris, Bax, 1978, 1981) puede ser interpretado sobre la base de las secuencias antes vistas de eco de espines y tranferencia de polarizacin. La secuencia de pulsos se muestra en la Figura 5.122.
13
P P

C, los cuales poseen

Figura 5.122 Secuencia de pulsos del experimento HCCOSY

Como se observa en la Figura 5.122 el experimento consta de 4 etapas bien definidas: preparacin, evolucin, mezcla y deteccin. Solo la etapa de mezcla resulta nueva respecto a los experimentos multipulsos vistos con anterioridad. En la preparacin el sistema recupera el equilibrio y se crea coherencia protnica por el pulso inicial. El perodo de evolucin consta en este caso de un eco de espines donde se desarrolla la coherencia protnica de acuerdo con los desplazamientos qumicos respectivos. En la etapa de mezcla se crea coherencia de protones en antifase ( 1 = 1/2J),
B B

que el doble pulso simultneo de 90 0 transforma en coherencia en antifase de carbono por


P P

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transferencia de polarizacin desde los protones. Durante la segunda mitad del perodo de mezcla se crea coherencia de
13
P P

C en fase, que es la que detectamos en la etapa final con

desacoplamiento protnico simultneo. Analicemos, mediante el modelo vectorial de la magnetizacin, el desarrollo del experimento para un grupo CH ( 13 C- 1 H); que puede generalizarse a grupos CH 2 y CH 3 .
P P P P B B B B

Preparacin: durante el periodo de preparacin la magnetizacin longitudinal de los protones en equilibrio (1) se convierte en coherencia protnica cuyos dos componentes correspondientes a las proyecciones de espn y del carbono inmediato comienzan el periodo de evolucin (2).

Figura 5.123 Experimento HCCOSY: magnetizacin transversal o coherencia durante la evolucin (modelo vectorial)

Evolucin (Puntos 2-5, Figura 5.123): la evolucin es un periodo de eco de espines. La coherencia protnica evolucionar de acuerdo a sus desplazamientos qumicos. La aplicacin del pulso de 180 0 ( 13 C) reenfoca el acoplamiento heteronuclear: la posicin
P P P P

de la magnetizacin de cada protn al final del periodo de evolucin, dada por el ngulo (5), depender slo de su desplazamiento qumico (modulado dbilmente por el acoplamiento homonuclear interprotnico) y del tiempo t 1 .
B B

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Figura 5.124 Experimento HCCOSY: coherencia durante el perodo de mezcla (modelo vectorial). Hasta 7 se representa la magnetizacin protnica. A partir de 8 se muestra la magnetizacin de 13 C.
P P

Mezcla (Puntos 5-9, Figura 5.124): El periodo de mezcla comienza con intervalo fijo 1
B

= 1/2J (J constante de acoplamiento heteronuclear directa C-H) para lograr poner en antifase los componentes del doblete protnico debido al acoplamiento con el representacin en 2 y 3 dimensiones). El doble pulso de 90 de protones y de
P P

13
P P

C (6,

13
P P

C produce

la transferencia de polarizacin. Sus efectos se pueden analizar en forma secuencial. El pulso de 90 0 protnico convierte la coherencia en antifase en magnetizacin longitudinal
P P

con uno de los componentes invertido (7). El pulso de 90 0 de


P P

13
P P

C genera entonces

transferencia de polarizacin del protn al

13
P P

C y coherencia en antifase de este ltimo(8).

La eficiencia de esta transferencia depender de la posicin de la coherencia protnica en antifase al aplicar los pulsos de 90 0 y por lo tanto de lo ocurrido durante el perodo de
P P

evolucin. El intervalo final permite poner en fase los componentes de la coherencia de


13
P P

C (9).
13
P P

Deteccin: la magnetizacin transversal de qumico de 13 C.


P P

C es registrada durante este periodo con

desacoplamiento protnico simultneo. Por lo tanto slo evolucionar el desplazamiento

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La seal detectada (cada de induccin libre, FID) es funcin no slo del tiempo real de adquisicin t 2 , sino tambin de la duracin del periodo de evolucin t 1 . Si
B B B B

secuencialmente realizamos un tndem de experimentos con valores variables de t 1


B B B B B

tendremos una matriz bidimensional de datos S(t 1 ,t 2 ) correspondiente a la digitalizacin de los FIDs (t 2 ) para diferentes valores de t 1 . Una primera transformacin de Fourier
B B B B

sobre t 2 suministra un conjunto de espectros de


B B B B

13
P P

C con seales cuya intensidad depende

de la duracin del intervalo t 1 . sto se debe a que la eficiencia de la transferencia de polarizacin est modulada por la posicin que ocupe el doblete protnico en antifase (6) lo que es funcin del desplazamiento qumico protnico, y la duracin del periodo de evolucin t 1 . Una segunda transformacin de Fourier, ahora con respecto a t 1 , nos
B B B B

revelar las frecuencias de las coherencias activas durante el perodo de evolucin, es decir los desplazamientos qumicos de los protones acoplados directamente a cada ncleo de carbono: S(t 1 , t 2 )
B B B B

TF(t 2 )
B B

S(t 1 , C )
B B B B

TF(t 1 )
B B

S( H , C )
B B B B

Existe una diferencia significativa entre los perodos 1 y 2 . El primero se introduce


B B B B

para poner en antifase los componentes del doblete protnico y por lo tanto depender slo de la magnitud de la constante de acoplamiento directa
13
P P

C- 1 H, que en la mayora de
P P

los casos toma valores entre 125 y 160 Hz. Es usual adoptar un valor de compromiso de 135 Hz, que corresponde a un valor de 1/2J de 3.7ms. Durante el perodo 2 deseamos
B B

llevar los componentes del multiplete de

13
P P

C, inicialmente en antifase, a encontrarse en

fase. Este proceso depende ahora fuertemente del nmero de protones unidos a dicho carbono, como se ha visto anteriormente en la tcnica INEPT. En la Figura 5.125 se muestra la situacin para grupos CH, CH 2 y CH 3 en funcin de la duracin del perodo
B B B B

2 . Se adopta usualmente un valor de 1/4J (1.85ms), para el cual el nivel de reenfoque es


B B

aceptablemente alto para todos los carbonos hidrogenados.

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Figura 5.125 Intensidad de las seales en funcin de la duracin del intervalo 2 (en unidades de 1/J) para grupos CH, CH 2 y CH 3 .
B B B B B B

En la Figura 5.126 se muestra un espectro HC-COSY tpico

Figura 5.126 Espectro HC-COSY de un cetoendoperxido en CDCl 3 a 200 MHz ( 1 H). x-seales del solvente
B B P P

La representacin utilizada es la estndar en RMN-2D: el diagrama de contorno. Las dos variables independientes, las frecuencias 1 (F 1 , usualmente en la vertical) y 2 (F 2 ,
B B B B B B B B

horizontal) corresponden respectivamente a los periodos de evolucin y deteccin. La variable dependiente, que corresponde a las intensidades de las seales se representa en
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forma anloga a un mapa de relieve con curvas de nivel. Se muestran los espectros monodimensionales 1 H y de
P P

13
P P

C como referencia a lo largo de F 1 ( H ) y F 2 ( C )


B B B B B B B B

respectivamente. El espectro HC COSY mostrado nos permite correlacionar las seales de los carbonos con las de los protones directamente enlazados. La escala F 2 , que corresponde a las
B B

frecuencias del perodo de deteccin, muestra los desplazamientos qumicos de


B B

13
P

C. La

escala F 1 , que corresponde a las frecuencias del perodo de evolucin muestra los desplazamientos qumicos de los protones. As las seales A y B vinculan a los protones olefnicos con los carbonos correspondientes (5.6ppm/120.0ppm). Las seales C y D vinculan a los protones alifticos de los CH puentes unidos al grupo epoxi con los carbonos correspondientes en las cercanas de 80 ppm. Finalmente las seales E y F corresponden a los protones disterotpicos del grupo CH 2 que correlacionan con el mismo carbono cerca de 40 ppm.
B B

5.9.2 Experimentos de correlacin heteronuclear directa a larga distancia: LRHETCOR y COLOC. Aunque el experimento HETCOR resulta muy til en la elucidacin de estructuras, su limitacin fundamental es su carcter local. Slo logramos correlacionar protones y carbonos unidos directamente. Una variante de este experimento permite correlacionar protones y carbonos separados por 2 o 3 enlaces, los que presentan pequeos acoplamientos geminales y vecinales generalmente inferiores a 10Hz. Se impone modificar la duracin de los periodos de mezcla 1 y 2 , alargndolos para permitir la
B B B B

creacin de componentes protnicos en antifase respecto a los acoplamientos indirectos y posterior reenfoque de los componentes de
13
P P

C asociados dichos

acoplamientos

indirectos. Tomando un valor de compromiso para los acoplamientos a dos y tres enlaces C-H de 7 Hz, el valor del intervalo 1 debe extenderse hasta unos 71ms. El experimento
B B

muestra ahora picos cruzados entre protones y carbonos separados 2 o 3 enlaces adems de la presencia eventual de los picos cruzados originalmente presentes en el experimento HETCOR, que indican la conectividad a un enlace. Se ha utilizado esta tcnica en el pasado para correlacionar protones de grupos metilos con carbonos cuaternarios vecinos.

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El incremento de los periodos de mezcla en el experimento LR-HETCOR (Long RangeHETCOR) alarga considerablemente la secuencia de pulsos reduciendo drsticamente la sensibilidad por la accin de los procesos de relajacin. Se logra compensar parcialmente esta prdida de sensibilidad haciendo el tiempo de evolucin constante (constant time experiment) e incluyndolo dentro del perodo de polarizacin INEPT. El efecto neto es que el pulso de 180 0 es el que se desplaza en funcin del tiempo de evolucin, de forma
P P

tal que al final de la etapa la coherencia respecto al acoplamiento con el


13
P P

protnica

adquiere carcter de antifase

C. Puede entonces tener lugar de inmediato la


P P

transferencia de polarizacin INEPT (doble pulso de 90 0 aplicado a ambos ncleos). Esta modificacin denominada COLOC (Correlation Spectroscopy via Long Range Couplings, Kessler, Griesinger 1984, 1987), mostrada en la Figura 5.127, reduce la duracin de la secuencia de pulsos y el experimento es ms sensible por reduccin de los efectos de la relajacin.

Figura 5.127 Secuencia de pulsos del COLOC. El intervalo de tiempo entre los 2 pulsos protnicos de 90 0 es constante. Valores tpicos son 1 = 25ms y 2 =33ms (optimizadas para un acoplamiento indirecto de 10 Hz)
P P B B B B

En la Figura 5.128 se muestra el espectro COLOC de la vainillina. Las correlaciones directas, que aunque atenuadas aparecen en los espectros COLOC, aparecen indicadas con un crculo. Obsrvese las 2 correlaciones observadas para el protn aldehdico 7 que corresponden a los carbonos 2 y 3. Asimismo el carbono cuaternario 3 puede asignarse fcilmente pues es el nico que correlaciona con los protones del grupo metoxilo. Ya hemos visto que en sistemas aromticos los acoplamientos 2 J CH son dbiles y los picos
P P B B

cruzados correspondientes pueden estar ausentes de los espectros COLOC (H 5 muestra


B B

picos cruzados intensos con los carbonos vecinales C 1 y C 3 , otro ms dbil con el
B B B B

carbono geminal C 4 y no se observa con el otro carbono geminal C 6 )


B B B B

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Resonancia Magntica Nuclear

Figura 5.128 Espectro COLOC 400 MHz de la vainillina en CDCl 3


B

5.9.3 Experimentos de correlacin heteronuclear inversa Los experimentos originales de correlacin heteronuclear, anteriormente descritos, se basan en la deteccin de la coherencia del heteroncleo X de baja razn magnetogrica con deteccin indirecta del protn a lo largo de la dimensin F 1 en el experimento
B B

bidimensional. Estos experimentos se derivan de los anlogos monodimensionales de transferencia de polarizacin como el INEPT. Ms recientemente se han desarrollado mtodos donde se detecta el ncleo de mayor razn magnetogrica, usualmente el protn, mientras que el heteroncleo se detecta indirectamente. Por razones histricas estos mtodos se denominan de deteccin inversa y se han generalizado debido al incremento sustancial en sensibilidad que aportan. La intensidad de una seal en RMN depende, como hemos visto antes, de la razn magnetogrica de los ncleos. En general la relacin seal/ruido (S/R) en un experimento depende de una serie de factores:

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-nmero de molculas en el volumen activo de la sonda (concentracin) N -abundancia natural de los ncleos observados en el experimento A -temperatura de la muestra T -intensidad del campo magntico esttico B 0
B B

-razones magnetogricas de los ncleos inicialmente excitados y observados exc obs


B B B

-tiempo de relajacin transversal efectivo (define ancho de banda) T 2 *


B PB

-nmero de FIDs acumulados n


3 1 1 S 2 NAT 1B0 2 exc obsT2*n 2 [5.103] R

Al disear un experimento bidimensional buscando la mayor sensibilidad para una muestra concreta en un equipo determinado en un mnimo de tiempo, los factores que podemos modificar son exc y obs : debemos tratar de que los ncleos excitados y
B B B B

observados sean los de mayor razn magnetogrica. Puede pensarse en cuatro combinaciones para que se muestran en la Figura 5.129. experimentos de correlacin heteronuclear XH de acuerdo a la naturaleza de los ncleos excitados y detectados, las

Figura 5.129 Esquemas para generar espectros 2D de correlacin heteronuclear P, E, M, D-perodos de preparacin, evolucin, mezcla y deteccin

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Resonancia Magntica Nuclear El esquema 1 con excitacin y deteccin de los ncleos de menor X , y por lo tanto de menor
B B

sensibilidad, se toma como referencia de intensidades. En el esquema 2, que corresponde al HETCOR, se excita inicialmente el protn cuya coherencia se deja evolucionar y durante el periodo de mezcla se transfiere la coherencia al heteroncleo que es el detectado directamente. En dependencia del valor de 5.126 ( 1H ~ 2.5 31P ~4 13C ~ 10 15N ).
B B B B B B B B

X se obtienen incrementos en
B B

sensibilidad respecto a los valores de referencia, que son mostrados a la derecha de la Figura Al esquema 4 le corresponden la mayores sensibilidades relativas. Aqu se excita inicialmente al protn, se crea coherencia de X que evoluciona durante t 1 y finalmente durante la mezcla se
B B

vuelve a coherencia protnica que es la detectada directamente. Estos experimentos de deteccin inversa, que estudiaremos a continuacin, representan ganancias sustanciales de sensibilidad respecto al HETCOR que para las correlaciones 1 H- 13 C y 1 H- 15 N son de 8 y 30 veces. Aunque
P P P P P P P P

estos valores tericos de incremento de sensibilidad no sean alcanzados completamente en la prctica, aun un incremento moderado, digamos slo un factor de 4 para las correlaciones
13
P P

C- 1 H
P P

representan una reduccin del tiempo de adquisicin en 16 veces. As si un experimento HETCOR requiere por las condiciones de la muestra de un tiempo de adquisicin del orden de las horas, puede obtenerse la informacin equivalente por los mtodos inversos en cuestin de minutos. Como ventaja adicional de los experimentos de correlacin inversa se tiene que en ellos en F 1 , donde se tiene menor resolucin, se despliegan los desplazamientos del heteroncleo, que
B B

normalmente estn mucho menos superpuestos que los protnicos. Los experimentos de correlacin inversa se han impuesto y son los que se utilizan en la actualidad para las correlaciones X- 1 H.
P P

Existen 2 tcnicas ampliamente utilizadas para la correlacin heteronuclear inversa a un enlace, que se conocen por sus siglas en ingls: la correlacin heteronuclear mltiple cuntica HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Correlation) y la correlacin heteronuclear a simple cuanto HSQC (Heteronuclear Single Quantum Correlation). La informacin que suministran ambas tcnicas es esencialmente la misma, difiriendo slo en detalles. El experimento HMQC es menos sensible a desajuste en los parmetros de registro, mientras que el HSQC presenta una mayor resolucin, ventaja que es explotada particularmente en espectros muy cargados de seales como son los de los biopolmeros. El experimento HSQC es ms verstil, existiendo numerosas variantes del mismo, lo que lo ha popularizado en la comunidad qumica. Ambas tcnicas, como mtodos inversos, requieren una supresin efectiva de las seales que no provienen de los
14
P P P P

protones unidos al heteroncleo activo ( 12 C-H y

N-H). Esta supresin puede lograrse por

202

Resonancia Magntica Nuclear diferentes mtodos. El mas utilizado y efectivo es el los gradientes de campo pulsados (PFGsPulsed Field Gradients). 5.9.4 HMQC Este experimento de correlacin heteronuclear inverso fue desarrollado por Bax en 1986. El HMQC permite correlacionar protones y carbonos unidos directamente a travs de un enlace con elevada sensibilidad. La secuencia del HMQC se muestra en la Figura 5.130. La programacin de fases de pulsos y receptor mostrada es para eliminar las seales provenientes de los protones unidos a 12 C.
P P

Figura 5.130 Secuencia de pulsos y CTC del HMQC La secuencia bsica del HMQC es relativamente simple conteniendo slo 4 pulsos de RF. Ilustraremos su funcionamiento para un grupo CH, tal como hicimos en el HETCOR. Preparacin.- la secuencia comienza con un pulso de 90 0 ( 1 H) que genera coherencia protnica
P P P P

seguida de la evolucin de la magnetizacin protnica en un intervalo = 1/2 1 J CH (~3.3ms) para


P P B B

poner dicha coherencia en antifase con respecto al acoplamiento con el carbono vecino. Como en el INEPT est magnetizacin en antifase puede transferirse a la pareja en acoplamiento mediante un pulso. El pulso de 90 0 ( 13 C) transfiere coherencia al carbono-13 creando lo que se conoce
P P P P

como coherencia a mltiple cuanto (MQC), donde hay magnetizacin transversal de ambos ncleos.

203

Resonancia Magntica Nuclear Evolucin.- las coherencias a mltiple cuanto no son detectables directamente en RMN (una adquisicin inmediata no registrara seal alguna) y evolucionan con los desplazamientos qumicos de ambos ncleos. Para estas coherencias el acoplamiento mutuo no se desarrolla. La aplicacin de un pulso de 180 0 ( 1 H) en el centro de esta etapa elimina la evolucin del
P P P P

desplazamiento qumico protnico. Luego durante t 1 evoluciona slo el desplazamiento qumico


B B

de 13 C y los acoplamientos interprotnicos (J HH )


P P B B

Mezcla.- El pulso final de 90 ( C) da inicio al periodo de mezcla. Este pulso reconvierte la


P P P P

0 13

MQC en coherencia protnica en antifase. Un nuevo intervalo = 1/2 1 J CH lleva a la coherencia


P P B B

protnica en fase. Deteccin.- La coherencia protnica es detectada durante t 2 evolucionando de acuerdo con los
B B

desplazamientos qumicos protnicos y las constantes de acoplamiento homonucleares J HH . El


B B

acoplamiento con el 13 C es eliminado por desacoplamiento.


P P

Tenemos entonces: Evolucin durante t 1 : ( 13 C*) + n J HH


B B P P P P B B

Deteccin durante t 2 : ( H-unidos a C*) + n J HH


B B P P P P P P B

13

El espectro 2D HMQC mostrar picos o seales de cruce entre ncleos de carbonos y protones separados por un enlace. En la dimensin F 1 podremos evaluar el desplazamiento qumico del
B B

13
P P

C con la estructura fina de los acoplamientos H-H, usualmente no resueltos, mientras que en F 2
B

tendremos los desplazamientos qumicos de los protones unidos a cada carbono con estructura fina correspondiente a los acoplamientos interprotnicos. En la parte inferior de la Figura 5.130 se muestran los llamados caminos de transferencia de coherencia (CTC). Estos CTC permiten visualizar de forma simplificada la evolucin de las coherencias durante una secuencia. Los rdenes de coherencia p para cada ncleo definen la magnetizacin presente en las diferentes etapas del experimento. Slo los pulsos de RF pueden modificar los rdenes de coherencia. A las magnetizaciones longitudinales (equilibrio) corresponde p = 0, a las magnetizaciones transversales o coherencias a simple cuanto generadas por la accin de pulsos de 90 0 corresponde p = 1. Los pulsos de 180 0 slo pueden invertir
P P P P

coherencias. Las coherencias a mltiple cuanto se generan por aplicacin de pulsos de 90 0 a


P P

sistemas fuera del equilibrio. Slo es posible la deteccin de coherencia a simple cuanto. En la deteccin por cuadratura slo se puede detectar una de las coherencias a simple cuanto (por convenio se utiliza p = -1) Veamos el experimento HMQC de acuerdo a los CTC. Inicialmente en el equilibrio tenemos p = 0 para ambos ncleos. El pulso inicial de 90 0 protnico genera coherencia a simple cuanto con p
P P

= 1, en el diagrama slo se indica el camino con p = +1 que es el que finalmente conduce a la

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Resonancia Magntica Nuclear deteccin. La aplicacin del pulso de 90 0


P

13
P P P

C crea coherencias con p = 1 para este ncleo y

globalmente coherencias a mltiple cuanto para el sistema CH. Estas coherencias son mezclas de coherencias a cero y doble cuanto (p = 0, 2) de acuerdo con los signos relativos de las coherencias protnicas y de
13
P P

C.Estas coherencias mltiples estn presentes durante toda la


13
P P

evolucin, pero la evolucin con el desplazamiento qumico protnico es eliminada por el pulso de 180 0 que invierte la coherencia protnica en el medio del intervalo. El pulso final de
P P

elimina la coherencia de este ncleo quedando solo la coherencia protnica que es detectada. En la Figura 5.131 se muestra el espectro HMQC del mentol.

Figura 5.131 Espectro HMQC del mentol En la Figura 5.131 se incluyen como referencias los espectros 1D RMN- 13 C (F 1 ) y RMN- 1 H
P P B B P P

(F 2 ). Si conocemos las asignaciones de los carbonos, este experimento nos permite asignar el
B B

espectro protnico. La seal del carbono ms desblindado (C 1 ) correlaciona con el protn ms


B B

desblindado en = 3.3 ppm. Asimismo, los carbonos unidos a protones diaterotpicos (C 3 , C 4 y


B B B PB P

C 6 ) correlacionan con 2 seales protnicas cada uno. La resolucin espectral en F 2 es baja, pero
B B B B

permite observar estructura fina en los picos de cruce correspondientes a acoplamientos del orden

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Resonancia Magntica Nuclear de 10 Hz (geminales y vecinales diaxiales) y a partir de aqu identificar en cada grupo CH 2 a los
B B

protones ecuatoriales como los ms desblindados (dobletes frente a cuartetes). Se han implementado muchas variantes del HMQC bsico. La aplicacin de pulsos de gradientes (gs-HMQC) elimina totalmente las seales provenientes de los protones unidos a problema en las tcnicas inversas. 5.9.5 HSQC
12
P P

C, un serio

Este experimento (Bodenhausen y Ruben , 1980) tiene una secuencia con elementos comunes con el HMQC y suministra espectros similares. La diferencia esencial es que en el HSQC durante la evolucin hay coherencia a simple cuanto del heterotomo. La secuencia de pulsos y los CTC del HSQC se muestran en la Figura 5.132.

Figura 5.132 Secuencia de pulsos y CTC del HSQC Preparacin.- Este perodo es una secuencia INEPT con el objetivo de crear coherencias de X en antifase con el protn ( = 1/2 1 J XH ) a partir de la excitacin inicial protnica. El primer pulso de
P P B B

90 0 de X ( 13 C) que cierra el periodo de preparacin crea coherencia a simple cuanto en antifase


P P P P

para este ncleo. Evolucin.- Este perodo variable t 1 consta de un eco de espines donde las coherencias en
B B

antifase de X evolucionan de acuerdo a sus desplazamientos qumicos. La evolucin del acoplamiento heteronuclear es suprimida por el pulso protnico de 180 0 .
P P

206

Resonancia Magntica Nuclear Mezcla.- Consta de una secuencia retro-INEPT. Aqu las coherencias X en antifase con el protn se reconvierten por transferencia de polarizacin en coherencias protnicas en antifase con X y al final de la etapa quedan como coherencias protnicas en fase. Deteccin.- Las coherencias protnicas evolucionan de acuerdo a sus desplazamientos qumicos y acoplamientos homonucleares n J HH eliminndose el acoplamiento heteronuclear con X mediante
P P B B

el desacoplador. Tenemos entonces: Evolucin durante t 1 : ( 13 C*)


B B P P

Deteccin durante t 2 : ( 1 H-unidos a 13 C*) + n J HH


B B P P P P P P B

La diferencia fundamental con el HMQC radica en que en la dimensin F 1 estn ausentes los
B B

acoplamientos homonucleares, por lo que los anchos de lnea en esta dimensin estn apreciablemente reducidos en el HSQC. Cuando se desea una buena resolucin en F 1 por la
B B

presencia de un gran nmero de seales, el experimento a escoger es el HSQC. As, el espectro patrn para caracterizar una protena marcada con
15
P P

N es el 1 H- 15 N-HSQC, que debe mostrar un


P P P P

nmero de picos equivalentes al de residuos aminoacdicos en la estructura. En la Figura 5.133 se muestra el espectro 1 H- 15 N-HSQC de una protena.
P P P P

Figura 5.133 Espectro (seccin) 1 H- 15 N-HSQC 600 MHz de la fraccin soluble de un citocromo c (100 residuos AA)
P P P P

Cada uno de los picos de cruce en el espectro anterior corresponde al grupo N-H de un residuo aminoacdico. Obsrvese el gran nmero de seales que pueden distinguirse en esta parte del

207

Resonancia Magntica Nuclear espectro aprovechando la dispersin de desplazamientos qumicos de del HSQC. La secuencia de pulsos del experimento HSQC es mucho ms compleja que la del HMQC y por lo tanto ms susceptible a desajustes instrumentales. Por otra parte es un experimento ms verstil, existiendo numerosas modificaciones como la variante editada, que permite diferenciar por los signos de los picos de cruce las correlaciones que corresponde a grupos XH, XH 2 y XH 3 .
B B B B

15
P P

N y la elevada resolucin

Tambin se utilizan secuencias modificadas para la medicin de parmetros especficos (J XH ,


B B

NOE) o como componentes de experimentos hbridos (HSQC-TOCSY /HSQC-Total Correlation Spectroscopy). La eliminacin de las seales protnicas unidas a
12
P P

C (o

14
P P

N) que son numricamente dominantes

es tambin un problema en el HSQC, como en toda tcnica de deteccin inversa. Su eliminacin parcial se logra por la alternancia de las fases del primer pulso de 90 0 (x) y del receptor (Figura
P P

5.129). Tambin en el HSQC se ha impuesto el uso de pulsos de gradientes (gs-HSQC gradient selected-HSQC), que eliminan efectivamente las seales indeseadas, reducen fuertemente el ruido de fondo y mejoran el rango dinmico al eliminar las seales indeseadas antes de la etapa de deteccin. 5.9.6 HMBC El experimento de correlacin heteronuclear a varios enlaces (HMBC, Heteronuclear Multiple Bond Correlation), desarrollado por Bax (1986) establece la correlacin entre protones y un heterotomo X separados por 2 o 3 enlaces y es el equivalente inverso del COLOC. A semejanza del HMQC y el HSQC es un experimento muy sensible por resultar de excitacin y deteccin protnica. El HMBC es esencialmente un experimento HMQC adecuado a la deteccin de correlaciones a travs de acoplamientos dbiles. La secuencia del HMBC se muestra en la Figura 5.134.

Figura 5.134 Secuencia del HMBC con filtro de paso de banda inicial

208

Resonancia Magntica Nuclear Preparacin.- La secuencia es esencialmente la misma del HMQC, slo se introduce un pulso de 90 0 (X)
P P

inicial adicional que acta como filtro para eliminar la seal proveniente de
B B P P B B

acoplamiento directo ( 1 = 1/2 1 J XH ~ 3.3 ms). Se debe esperar el tiempo suficiente para poner en antifase la coherencia protnica ( = 1 + 2 = 1/ n J XH ~ 100 ms) optimizndose la creacin de
B B B B P P B B

coherencia a mltiple cuanto para n J XH mediante el segundo pulso de 90 0 (X).


P P B B P P

Evolucin.- La MQC evoluciona durante t 1 .


B B

Mezcla.- La MQC es reconvertida en coherencia protnica por el pulso final X. El intervalo de reenfoque al final del perodo de mezcla en HMQC es eliminado aqu por razones de sensibilidad: es demasiado largo y la relajacin amortiguara fuertemente las seales. Deteccin.- Comnmente la deteccin puede o no acompaarse de desacoplamiento de X. Se prefiere no desacoplar a X para que las seales residuales indeseadas que corresponden a los acoplamientos 1 J XH aparezcan como dobletes en F 2 lo que facilita su identificacin.
P P B B B B

En una medida aun mayor que sus homlogos la tcnica HMBC se beneficia grandemente con la introduccin de los pulsos de gradiente, que reducen considerablemente el ruido de fondo de los espectros. Las tcnicas de correlacin heteronuclear a 2 o 3 enlaces permiten obtener informacin valiossima en la determinacin estructural. La intensidad de los picos de cruce en el espectro depende tanto de la magnitud de los acoplamientos como del intervalo seleccionado. Estos acoplamientos son comnmente de 2-7 Hz, a lo que corresponde un ptimo de unos 100ms. El debilitamiento de las seales por relajacin durante el tiempo entre la excitacin y la deteccin hace recomendable reducir significativamente este intervalo y valores de de compromiso del orden de 60-80 ms (ptimas para acoplamientos de 4-10 Hz) son recomendables para los trabajos de rutina. Slo en molculas pequeas con relajacin poco eficiente pueden elevarse los valores de en busca de conectividades a travs de acoplamientos ms pequeos. En la Figura 5.135 se muestra el espectro HMBC de un compuesto bicclico.

209

Resonancia Magntica Nuclear

Figura 5.135 Espectro HMBC sin desacoplar durante la deteccin En la Figura 5.135 se muestran las conectividades del protn H 2 que muestra picos de cruce con
B B

C 9 (geminal) y C 4 , C 5 y C 8 (vecinales). Se observa adems el acoplamiento directo con C 2 que


B B B B B B B B B B

puede distinguirse de los anteriores por el doblete resultante del acoplamiento 1 J CH en F 2 (doble
P P B B B B

flecha). Tambin se indican otros picos de cruce producto de acoplamientos directos. La riqueza de la informacin que suministra el HMBC lo convierte en un experimento muy utilizado en ensamblar una estructura desconocida a partir de fragmentos conocidos. Mientras que con los espectros HMQC o HSQC slo logramos conectividades locales a travs de un enlace, el HMBC permite conectar tomos ms distantes, inclusive aquellos que carecen de protones y para los cuales las tcnicas de correlacin homonuclear no funcionan. En la Figura 5.136 se muestra el espectro HMBC del -pineno.

210

Resonancia Magntica Nuclear

Figura 5.136.HMBC del -pineno en CDCl 3 a 500 MHz. Desacoplando durante de la deteccin
B B

En el espectro HMBC del -pineno si buscamos las correlaciones de los protones de los grupos metilos del puente (A y B) encontramos correlacin con todos los carbonos a 2 y 3 enlaces. Obsrvese adems la presencia de la correlacin a un enlace 0.84/20.9 ppm y 1.27/26.4 ppm. El grupo metilo en 1.67 ppm es el nico con picos de cruce con los tomos de carbonos olefnicos (116.1/144.5 ppm) y adems con el CH en 47.2ppm. En la Figura 5.137 se muestran las secuencias de pulsos de los experimentos de deteccin inversa con fines de comparacin. La segunda dimensin temporal se genera por incrementos sucesivos de tiempo de evolucin t 1 .
B B

211

Resonancia Magntica Nuclear

Figura 5.137 Experimentos de correlacin heteronuclear con deteccin inversa.

5.9.7 Experimento de correlacin homonuclear (Correlation Spectroscopy, COSY) Este experimento mediante el cual se correlacionan ncleos a travs del acoplamiento escalar fue histricamente el primero de los experimentos bidimensionales (Jeener 1971, Ernst 1976). La tcnica COSY permite el mapeo de los ncleos (protones) que tienen acoplamientos escalares en una molcula. La secuencia de pulsos del COSY, mostrada en la Figura 5.138 es muy simple: se aplican 2 pulsos de 90 0 separados por un intervalo variable de tiempo que es el periodo de
P P

evolucin y al final del segundo pulso se adquiere el FID.

Figura 5.138 Secuencia de pulsos del COSY El perodo de mezcla del COSY se reduce al segundo pulso de 90 0 . Este pulso transfiere
P P

magnetizacin de un ncleo a otro ncleo que est acoplado con l. Este proceso se conoce como transferencia de coherencia y ha sido tratado anteriormente en el caso heteronuclear como transferencia de polarizacin. Para heteroncleos esta transferencia puede describirse mediante

212

Resonancia Magntica Nuclear el modelo vectorial porque los pulsos protnicos y del heteroncleo actan independientemente. En el caso homonuclear el problema es mucho ms complejo porque todos los espines experimentan la accin de los pulsos simultneamente. No obstante los procesos de transferencia son anlogos al caso heteronuclear y la transferencia de coherencias tiene lugar entre los espines protnicos acoplados. Consideremos el experimento COSY en un sistema de 2 protones dbilmente acoplados (sistema AX) con una constante de acoplamiento J AX y desplazamientos qumicos A y
B B B B B B B B

B . La
B B

magnetizacin asociada con A comenzar a precesar de acuerdo a A durante t 1 . El segundo pulso transfiere una parte de la magnetizacin (coherencia) de A hacia X y la otra parte permanece como magnetizacin (coherencia) de A. Aquella coherencia de A que permanece despus del segundo pulso evolucionar de acuerdo con A durante t 2 . El pico correspondiente en el espectro
B B B B

bidimensional aparecer a ( A , A ). Este pico que aparece a las mismas frecuencias en ambas
B B B B

dimensiones se denomina pico diagonal. La coherencia original de A que resulta transferida a X por el pulso de mezcla, evolucionar durante t 2 como X y el pico correspondiente aparecer en el
B B B B

espectro 2D a ( A , X ). Este pico es denominado pico de cruce, se encuentra fuera de la diagonal


B B B B

y nos indica que los ncleos A y X estn acoplados. En efecto, para que ocurra transferencia de coherencia, la coherencia de A tiene que haber desarrollado carcter de antifase respecto a X y esto slo puede ocurrir si ambos ncleos estn acoplados. Este anlisis puede repetirse para una excitacin inicial de X que conduce al pico diagonal ( X , X ) y al pico cruzado ( X , A ) al otro
B B B B B B B B

lado de la diagonal respecto a ( A , X ). Una representacin esquemtica del espectro COSY del
B B B B

sistema AX se muestra en la Figura 5.139.

Figura 5.139 Esquema del espectro COSY para sistema AX La informacin en un espectro COSY est en los picos de cruce fuera de la diagonal. Estos picos indican el acoplamiento escalar entre dos espines y por lo tanto que un reducido nmero de enlaces separan a los ncleos correspondientes. La eficiencia del pulso de mezcla en transferir coherencia depende, como hemos visto, de la presencia de componentes en antifase en el

213

Resonancia Magntica Nuclear momento de su aplicacin. El periodo de evolucin debe ser suficientemente largo para permitir la formacin de estos componentes en antifase ( = 2Jt 1 ). Si la constante de acoplamiento es
B B

muy pequea, el tiempo requerido para su desarrollo puede ser muy largo respecto a la accin de los procesos de relajacin y los picos de cruce correspondientes no son detectables. No obstante, en muchas ocasiones, pueden detectarse picos de cruce en el COSY correspondientes a acoplamientos no resueltos en el espectro monodimensional. En la Figura 5.140 se muestra el espectro COSY de la quinolina.

Figura 5.140 Espectro COSY 400MHz de la quinolina en acetona-d 6


B

En este espectro COSY detectamos 2 sistemas de espines casi independientes. Los protones 2, 3 y 4 muestran picos de cruce intensos entre ellos correspondientes a los acoplamientos orto y meta presentes en aromticos (sealados en la parte inferior del COSY). Los protones 5-8 forma por su parte un sistema ms complejo debido a la pequea diferencia de desplazamientos qumicos entre H 5 y H 6 . El pico de cruce entre estos protones est tan cercano a la diagonal que es difcil de
B B B B

detectar. Este es un problema comn en la interpretacin de los espectros COSY. La conexin


214

Resonancia Magntica Nuclear entre ambos sistemas de espines se evidencia por el dbil pico de cruce entre H 4 y H 8 (7.90-8.03
B B B B

ppm) correspondiente al acoplamiento en zigzag a larga distancia 5 J no resuelto en el espectro


P P

1D. En el COSY original no pueden separarse las componentes absortivas de las dispersivas de las seales por correcciones de fase como es comn en RMN-1D. El espectro COSY se presenta en modo magnitud, por lo que las seales aparecen muy ensanchadas (mezclas de absorcin con dispersin). Se han desarrollado variantes del COSY, como el COSY con doble filtro cuntico (DQF-COSY Double Quantum Filter-COSY) que permiten presentaciones en modo absortivo con mucha mejor resolucin y picos diagonales considerablemente reducidos (que no aportan informacin y pueden impedir la observacin de picos cruzados cercanos a la diagonal). La aplicacin de pulsos de gradientes permite eliminar o reducir las programaciones de fase de los experimentos y acortar considerablemente los tiempos de registro (gs-COSY, gs-COSY sensible a la fase). La obtencin de un gs-COSY es cuestin de unos pocos minutos. En todas estas variantes la interpretacin del espectro es idntica a la del COSY original. 5.9.8 Experimento de correlacin homonuclear total (Total Correlation Spectroscopy, TOCSY). La caracterstica ms notable del COSY es la obtencin de correlacin directa entre 2 protones acoplados, que inmediatamente sugiere que los mismos estn en una relacin geminal o vecinal en la molcula. Podemos ver al experimento COSY como equivalente al conjunto de todos los experimentos de desacoplamiento de espines imaginables para una molcula. El experimento de correlacin total TOCSY tambin suministra correlaciones entre espines directamente acoplados, pero incluye adems correlaciones entre todos los espines de un sistema, aun los que no estn directamente acoplados. Por ejemplo, en una cadena de protones acoplados A-B-C-D, en el experimento COSY observaramos pico cruzado de A con su nica pareja de acoplamiento B. En el experimento TOCSY observaramos picos cruzados de A con B, C y D si los acoplamientos BC y C-D son apreciables. Podemos correlacionar en principio mediante el TOCSY todos los ncleos de un sistema de espines y de aqu su nombre de espectroscopia de correlacin total. La habilidad del TOCSY para detectar transferencia de coherencia a travs de una cadena es muy til sobre todo en biomolculas complejas donde estn presentes sistemas de espines aislados, en unidades discretas. En las protenas los protones de los residuos aminoacdicos constituyen sistemas de espines independientes, no hay acoplamientos interprotnicos a travs del enlace peptdico. En los polisacridos, los protones de las unidades de azcares forman sistemas de espines independientes, no hay acoplamientos interprotnicos a travs del enlace glicosdico.

215

Resonancia Magntica Nuclear En el TOCSY los componentes de los multipletes en los picos de cruce estn en fase mientras que en el COSY estos componentes estn en antifase. En condiciones de baja resolucin, los componentes en antifase del COSY se superponen y tienden a anularse mutuamente, mientras que en el TOCSY se refuerzan, por lo que esta resulta una tcnica ms sensible. La secuencia del experimento TOCSY se muestra en la Figura 5.141. La secuencia de pulsos del TOCSY es similar a la del COSY excepto que el pulso de mezcla del COSY es sustituido por una etapa de mezclado con bloqueo de espines, cuyo objetivo es permitir la transferencia de coherencias a lo largo del sistema de espines.

Figura 5.141 Secuencia de pulsos del TOCSY y tren de pulsos para bloqueo de espines Para entender el funcionamiento del perodo de bloqueo de espines en el TOCSY veamos lo que ocurrira para un perodo de evolucin t 1 = 0. El pulso inicial crea magnetizacin en el eje x.
B B

Inmediatamente se aplica el bloqueo de espines que est compuesto por un tren de pulsos de 180 0 x separados por cortos intervalos de tiempo 2. Podemos considerar a todo el perodo de
P P

mezcla como una sucesin de ecos de espines (-180-). Como conocemos, en estos ecos se reenfocan los desplazamientos qumicos pero no los acoplamientos homonucleares. Es decir, en todo el perodo de mezcla m queda congelada la evolucin por desplazamiento qumico, los
B B

espines experimentan el mismo campo magntico efectivo

y los vectores correspondientes

permanecen fijos en el eje y del sistema de coordenadas rotatorio, de ah el nombre de bloqueo de espines. Por contraste los acoplamientos homonucleares evolucionan a travs de la toda la secuencia de ecos de espines. Durante el perodo de mezcla los espines de un sistema se comportan como equivalentes (no hay diferencias de desplazamientos qumicos efectivos) y acoplados por lo que constituyen un sistema de no primer orden donde los espines individuales pierden su identidad (mezcla isotrpica). Esta situacin permite el intercambio de coherencias entre todos los espines del sistema. La secuencia del TOCSY puede interpretarse entonces como:

216

Resonancia Magntica Nuclear Preparacin.- creacin de coherencias. Evolucin.- evolucin de las seales, quedando marcadas por sus desplazamientos qumicos. ( H
B B

+ J HH )
B B

Mezcla.- durante el bloqueo de espines se produce transferencia de coherencia a otros ncleos de su sistema de espines, cuya efectividad depende de los valores de las constantes de acoplamiento y el tiempo de mezcla. Deteccin.- se detectarn las seales provenientes de un ncleo que no transfiri coherencia a otro (pico diagonal) o que recibi coherencia de otros miembros del sistema de espines (picos de cruce). Evolucionan ( H + J HH ).
B B B B

La apariencia del espectro TOCSY es similar al COSY, con picos simtricos alrededor de la diagonal, pero con mucha mayor abundancia de picos de cruce. El intercambio de coherencia tiene carcter oscilante y su efectividad depende del tiempo de mezcla y de los valores de las constantes de acoplamiento a lo largo del sistema de espines. Para tiempos de mezcla cortos (< 20 ms) la transferencia de coherencia slo alcanza a los ncleos directamente acoplados y el TOCSY registrado en estas condiciones se asemeja al COSY. A tiempos de mezcla mayores es posible la transferencia de coherencia entre ncleos no acoplados directamente a travs de intermediarios. En casos favorables pueden encontrarse picos de cruce entre un espn y todos los dems del sistema de espines. En la Figura 5.142 se muestran las intensidades de los picos de cruce en espectros TOCSY del protn NH de la cadena lateral de un residuo de arginina en una protena en funcin del tiempo de mezcla.

Figura 5.142 Intensidad de los picos de cruce y tiempos de mezcla en TOCSY

217

Resonancia Magntica Nuclear Para tiempos de mezcla cortos ( m < 0.1/J AX ) slo hay transferencia efectiva al protn vecinal ( B B B B

). Slo a partir de 80 ms resulta apreciable el pico de cruce con el protn ms remoto del sistema de espines ( ). En la Figura 5.143 se muestran los espectros COSY y TOCSY de la lactosa (mezcla de anmeros y ). Los tres protones anomricos aparecen apreciablemente desblindados por encima de 4.4 ppm. El resto de los protones de la unidades de glucosa (Glu) y galactosa (Gal) forman un bloque compacto en la zona de 3.5-4.0 ppm. Los picos de cruce del espectro COSY nos permiten identificar claramente donde estn los protones en las posiciones 2, pero ms all resultan difciles las asignaciones por la gran superposicin de seales. En el espectro TOCSY sin embargo, a partir de los protones anomricos, podemos identificar las posiciones de los protones de los diferentes azcares mediante los picos de cruce de los tres protones anomricos. Para asignar los protones dentro de cada sistema de espines pueden realizarse experimentos TOCSY con diferentes tiempos de mezcla. A tiempos de mezcla crecientes van apareciendo las seales de los protones cada vez ms alejados del protn anomrico. Una alternativa es obtener espectros TOCSY en su variante monodimensional. Estos espectros se obtienen eliminando el perodo de evolucin y sustituyendo al pulso inicial de excitacin por un pulso selectivo aplicado a la frecuencia del protn cuyo sistema de espines quiere identificarse. En la Figura 5.144 se muestra los espectros 1D-TOCSY con diferentes tiempos de mezcla. En este caso se aplica el pulso selectivo a la frecuencia del protn anomrico de la unidad de glucosa. Con tiempos de mezcla crecientes se puede observar la aparicin sucesiva de los protones a lo largo de la cadena de acoplamiento. Para observar los protones en posicin 6 hay que esperar un tiempo muy largo, donde ya la relajacin ha comenzado a debilitar el grueso de las seales.

218

Resonancia Magntica Nuclear

Figura 5.143 DQF-COSY y TOCSY de la lactosa en D 2 O


B B

219

Resonancia Magntica Nuclear

Figura 5.144 Espectros 1D-TOCSY a diferentes m correspondientes al H-1 Glu (4.43 ppm) en la -lactosa
B B

5.9.9 Experimento de correlacin homonuclear de espines diluidos ( 13 C- 13 C P P P P

INADEQUATE) En la determinacin de estructuras orgnicas uno de los objetivos centrales es la identificacin del esqueleto carbonado. Por lo comn, las conectividades C-C no se determinan directamente sino se hace uso de las conectividades homonucleares (COSY) o heteronucleares a mas de un enlace (COLOC, HMBC). En ocasiones este procedimiento indirecto no es funcional, sobe todo cuando en la cadena carbonada abundan los carbonos cuaternarios. Esta estrategia indirecta se justifica por las dificultades asociadas con la deteccin de conectividad directa C-C: la baja abundancia natural del
13
P P

C (1.1%) hace que la presencia de dos

13
P P

C vecinos se de en 1 de cada 10000


13
P P

molculas. Se trata en este caso de buscar dbiles satlites de


P P

C en el ya poco sensible espectro

de RMN- 13 C. La estrategia directa, por su bajsima sensibilidad, requiere muestras muy concentradas y perodos de adquisicin muy prolongados. A pesar de los problemas de sensibilidad, la informacin tan valiosa que puede obtenerse de las conectividades C-C (conocimiento inmediato del esqueleto carbonado) ha estimulado el desarrollo de las tcnicas de correlacin C-C. La secuencia INADEQUATE (Incredible Natural Abundance Double Quantum Transfer Experiment) es la bsica en las correlaciones directas C-C y se ha aplicado tambin para la correlacin de otros ncleos de baja abundancia natural ( 29 Si y
P P

otros espines diluidos).

220

Resonancia Magntica Nuclear El problema ms grave de esta tcnica viene dado por la interferencia causada por las seales dominantes que carecen de conectividades homonucleares y por lo tanto no pueden suministrar la informacin buscada. En el INADEQUATE la accin de un doble filtro cuntico elimina las seales que corresponden a especies con un solo 13 C. La secuencia del experimento y los CTC del
P P

INDEQUATE se muestran en la Figura 5.145. El espectro de correlacin bidimensional se genera permitiendo a las coherencias a doble cuanto (slo presentes en especies con 2
B B

13
P P

C acoplados)
13
P P

evolucionar durante t 1 seguida de una reconversin a coherencia a simple cuanto de detecta durante t 2 .
B B

C que se

Figura 5.145 Secuencia de pulsos y CTC del experimento INADEQUATE Preparacin.- Se crea coherencia a simple cuanto por el pulso inicial. La generacin de coherencia a doble cuanto requiere de una disposicin antifase de los vectores de acoplamiento que se desarrollan durante el perodo = 1/2 1 J CC . sto se logra mediante un eco de espines que
P P B B

hace este proceso independiente de los desplazamientos qumicos. Finalmente el segundo pulso de 90 0 crea las coherencias a doble cuanto.
P P

Evolucin.- El perodo variable t 1 corresponde a las coherencias a doble cuanto evolucionando a


B B

la suma de los desplazamientos qumicos de los ncleos de carbonos acoplados. As, para dos carbonos A y X acoplados, la frecuencia del pico de cruce en F 1 viene dada por ( A + B ).
B B B B B B

Mezcla.- La reconversin a coherencias a simple cuanto de A o X ( A , X ) se logra mediante el


B B B B

pulso final de mezcla que da inicio al perodo de deteccin. Deteccin.- Durante este perodo evolucionan las coherencias de ncleos de carbono a simple cuanto y los acoplamientos 1 J CC .
P P B B

221

Resonancia Magntica Nuclear Durante toda la secuencia se irradian los protones en forma no selectiva para eliminar la evolucin de los acoplamientos heteronucleares y generar efectos NOE para aumentar la sensibilidad. La interpretacin de los espectros 2D-INADEQUATE es algo ms complicada que la de otros espectros 2D. En la dimensin F 1 , que corresponde a la evolucin de las coherencias a doble
B B

cuanto, los picos cruzados aparecen a la suma de las frecuencias relativas de ambos espines en el sistema de coordenadas rotatorio, sin que exista un espectro 1D de referencia. Como a cada coherencia DQ corresponden 2 coherencias a simple cuanto, movindonos en la horizontal podemos leer en F 2 las frecuencias de los espines acoplados y que dan lugar a dicha coherencia
B B

a DQ. En la Figura 5.146 se muestra el espectro 2D-INADEQUATE del n-butanol.

Figura 5.146 Espectro 2D-Inadequate del n-butanol En el espectro tenemos la dimensin F 1 que corresponde al DQ ( A + X ), en esta escala no
B B B B B B

tenemos representacin espectral. Los picos de cruce aparecen en F 2 a las frecuencias de


B B

resonancia de los carbonos asociados al DQ. Para interpretar el espectro buscamos en F 2 un pico
B B

de cruce de un ncleo de carbono que se pueda asignar inequvocamente. En este caso la seal del C 1 debe corresponder a la ms desblindada (62 ppm). El DQ vincula a este pico de cruce con
B B

otro del ncleo de carbono en = 35 ppm, que puede asignarse entonces al C 2 . Como C 2 est
B B B B

unido directamente a dos ncleos de carbono, debe tener otro pico de cruce que se identifica

222

Resonancia Magntica Nuclear fcilmente y lo vincula con el C 3 (18 ppm). Finalmente a partir de C 3 se identifica el C 4 (13
B B B B B B

ppm). En F 2 los picos de cruce muestran una estructura fina de dobletes (acoplamiento 1 J CC ). La
B B P P B B

interpretacin se facilita por la existencia de una seudodiagonal que une los centros de las lneas horizontales que ligan cada par de picos de cruce.

5.9.10 Experimentos de correlacin dipolar Todos los experimentos bidimensionales anteriormente descritos detectan conectividades entre espines que estn acoplados escalarmente o que forman parte de un mismo sistema de espines. Comenzaremos a tratar ahora los experimentos bidimensionales que nos permiten encontrar las conectividades entre ncleos que tienen acoplamiento dipolar, es decir aquellos que estn vecinos espacialmente y tienen contactos NOE. El experimento bsico de este tipo es el 2D-NOESY (Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy). Para molculas en rgimen de movilidad intermedio ( c 1 ), donde la magnitud del NOE es muy pequea, se puede utilizar con xito el experimento ROESY (Rotating frame Overhauser Enhancement Spectroscopy) para la deteccin de vecindad espacial entre espines. 5.9.10.1 Experimento NOESY El experimento NOESY permite la deteccin de NOEs transitorios. La secuencia de pulsos y los caminos de transferencia de coherencia del NOESY se muestran en la Figura 5.147.

Figura 5.147 Secuencia de pulsos y CTC del NOESY

La secuencia del NOESY est relacionada estrechamente con la del COSY. La diferencia mas significativa est en el tiempo de mezcla durante el cual se desarrolla el efecto NOE. Afortunadamente el experimento NOESY puede interpretarse haciendo uso del modelo

223

Resonancia Magntica Nuclear

vectorial (Figura 5.148), toda vez que aqu los acoplamientos escalares no juegan ningn papel. Despus de la excitacin inicial (Figura 5.148-2) y durante la evolucin (t 1 ) los
B B

vectores de magnetizacin estn en el plano xy (coherencias) y evolucionarn en dicho plano de acuerdo con sus desplazamientos qumicos (Figura 5.148-3, - offset respecto a la RF). El segundo pulso de 90 0 lleva componentes de la magnetizacin al eje z (Figura
P P

5.148-4), creando la inversin de poblaciones requerida para observar NOE transitorios que se desarrollan durante el tiempo de mezcla. La fraccin de magnetizacin remanente en el plano xy dara lugar al COSY si se adquiriera inmediatamente. Al final del tiempo de mezcla las magnetizaciones resultantes en el eje z son convertidas en coherencias por el pulso final de 90 0 y detectadas durante t 2 . El perodo de evolucin sirve para marcar
P P B B

los desplazamientos qumicos. Si partimos de la excitacin de un ncleo S, este evolucionar a su frecuencia durante t 1 y su magnetizacin, invertida por el segundo
B B

pulso de 90 0 , se puede transferir a un ncleo vecino I si hay relajacin cruzada ( IS ) entre


P P B B

los mismos. Esta magnetizacin transferida se detecta a la frecuencia de I durante t 2 por


B B

lo que observamos un pico de cruce (F 1 - S , F 2 - I ) que indica el contacto NOE entre


B B B B B B B B

los mismos. La magnetizacin no transferida durante el perodo de mezcla da lugar a los picos diagonales. La secuencia es repetida para los diferentes valores de los tiempos de evolucin. Generalmente el perodo de preparacin incluye un intervalo de recuperacin de las magnetizaciones previo al pulso inicial de 1-3 s.

Figura 5.148 Modelo vectorial del experimento NOESY

La secuencia NOESY requiere una programacin de fases de pulsos y receptor (no mostrada en la Figura 5.147) para eliminar coherencias indeseadas. Como en el NOESY durante el perodo de mezcla slo interesa la magnetizacin longitudinal (p = 0), cualquier coherencia a simple o doble cuanto indeseada puede eliminarse de forma relativamente sencilla. Una alternativa a la programacin de fases es el uso de un pulso
224

Resonancia Magntica Nuclear

de gradientes durante el perodo de mezcla. La inhomogeneidad asociada al pulso de gradientes en z (inhomogeneidad a lo largo de z, campos B 0 efectivos que varan
B B

linealmente) desfasa y anula toda coherencia SQ o DQ durante este tiempo pero no afecta la magnetizacin longitudinal, que es la de inters en el NOESY. Las interferencias ms difciles de eliminar son las coherencias a cero cuanto existentes durante el perodo de mezcla que sean convertidas por el pulso final en coherencias a simple cuanto detectables. El procedimiento ms comn para eliminar estas interferencias es variar ligeramente en forma aleatoria el tiempo de mezcla de un incremento de t 1 a
B B

otro. La magnetizacin de inters para el NOESY (magnetizacin longitudinal) es poco sensible a pequeos cambios en m , mientras que las coherencias a cero cuanto (oscilarn
B B

de acuerdo al offset y sern muy sensible an a cambios moderados de m , anulndose


B B

efectivamente por este procedimiento. Los espectros NOESY presentan una apariencia similar al COSY, con simetra respecto a la diagonal. Se prefiere su presentacin en formato sensible a la fase, donde pueden ajustarse todas las seales como absortivas positivas o negativas. Lo importante es el signo relativo de las seales. Si ajustamos las seales en la diagonal como positivas, el signo de los picos de cruce depende del origen del pico y de la movilidad de la red, como se muestra en la Tabla 5.29.
Tabla 5.29 Signo de los picos de cruce en NOESY Signo diagonal Origen pico cruce Positivo NOE positivo (alta movilidad) (convenio) NOE negativo (baja movilidad) Intercambio qumico Signo pico de cruce Negativo Positivo Positivo

Dos espines en intercambio qumico lento (seales independientes) pueden intercambiar magnetizacin y dar lugar a picos de cruce en el NOESY. En molculas pequeas con NOEs positivos los picos de cruce por contacto NOE y por intercambio qumico pueden ser distinguidos por su signo. Sin embargo en macromolculas ambos picos de cruce tienen el mismo signo y no pueden ser diferenciados. Un parmetro importante a definir al disear un experimento NOESY es el tiempo de mezcla (ver Tabla 5.30). Este debe por una parte ser lo suficientemente largo para permitir la creacin del NOE, pero por otra su duracin esta limitada por la relajacin longitudinal que tiende a debilitar todas las seales. Si se quieren determinar distancias intenucleares se debe trabajar en la zona lineal inicial de desarrollo del NOE, evitndose adems la aparicin de picos de cruce falsos por

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Resonancia Magntica Nuclear difusin de espines. En la Tabla 5.30 se indican los valores de tiempo de mezcla recomendables para los experimentos NOESY. Tabla 5.30 Tiempos de mezcla para NOESY Rgimen de movilidad NOE Caractersticas Molculas pequeas + T 1 IS
B B B B B B

Macromolculas Molculas intermedias

Tiempos de mezcla ~ T1 500-2000 ms T 1 IS ~0.5 T 1 100-300 ms NOESY no viable, usar ROESY


B B B B B B B B

En la Figura 5.149 se muestra el espectro NOESY de un compuesto heterocclico. Los picos cruzados tienen signo opuesto a la diagonal pues el sistema se encuentra en la zona de alta movilidad. Los protones del grupo metilo 11 tienen contactos NOE con el protn olefnico 8, con el protn 7 y con el grupo metilo 14 del acetal. Los protones del grupo metoxilo 14 muestran contacto NOE con el otro grupo metilo del acetal 13. El experimento NOESY brinda tanto informacin estructural como conformacional.

Figura 5.149 Espectro NOESY El experimento NOESY a travs de los contactos NOE suministra informacin esencial para la determinacin de estructuras tridimensionales de protenas. En la Figura 5.150 se muestra una seccin del espectro NOESY de una protena de 78 residuos.

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Figura 5.150 Seccin de espectro NOESY de una protena Puede observarse la gran cantidad de picos de cruce, que en este caso tienen el mismo signo que la diagonal (no mostrada). La seccin corresponde en f 2 a las resonancias de los protones NH.
B B

(10 6.5 ppm). En la lnea vertical mostrada a f 2 = 9.70 ppm se observan 8 picos de cruce del
B B

protn NH de un residuo aminoacdico a ese desplazamiento qumico con protones en la zona de 0 6 ppm (protones H y en cadenas laterales). Los
B B

numerosos contactos NOE implican la

cercana (< 5 ) entre los protones y por lo tanto constituyen conjuntos muy extensos de restricciones experimentales que se utilizan ampliamente en la determinacin de las estructuras tridimensionales de las protenas. 5.9.10.2 Experimento ROESY (Rotating Frame Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy) El mayor problema asociado con el experimento NOESY est en la imposibilidad de aplicarlo a sistemas con movilidad en la zona de cruce del cero, donde el NOE cambia de signo ( 0 c 0 ), En este rgimen los NOEs se hacen muy pequeos o se anulan totalmente. Esto ocurre en molculas con masas moleculares de 1000 a 2000 Da, dependiendo de las condiciones de la disolucin (viscosidad, temperatura) y la frecuencia de trabajo del espectrmetro. La determinacin de los contactos NOE en estas condiciones puede realizarse midindolos en el sistema de coordenadas rotatorio (rotating frame NOE, ROE). La relajacin cruzada medida en el sistema de coordenadas rotatorio es anloga a la de los NOE transientes, pero aqu viene dada por:

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Resonancia Magntica Nuclear

IS 4

3 c + 2 6 [5.104] 1 + 0 c rIS

A diferencia de la expresin correspondiente para el NOE [5.96], los NOEs en el sistema rotatorio o ROEs no se hacen nunca negativos, independientemente del valor de c y de aqu su gran utilidad: permiten determinar vecindad espacial en molculas de movilidad intermedia. En la Figura 5.151 se muestra la dependencia de NOE y ROE con la movilidad molecular para el caso homonuclear.

Figura 5.151 Evolucin de NOE y ROE con c


B

En condiciones de alta movilidad los incrementos NOE y ROE mximos son iguales, mientras que al reducirse la movilidad el NOE cambia de signo mientras que el ROE permanece positivo y se incrementa ligeramente (50% a 68%). En condiciones de alta movilidad:
NOE ROE IS = IS

5 4 c [5.105] 6 rIS 2 4 c [5.106] 6 rIS

En condiciones de baja movilidad:


NOE IS

4 c 6 rIS

ROE IS

As para grandes molculas el ROE crece dos veces mas rpido que el NOE. Mientras el desarrollo del NOE implica la transferencia de magnetizacin longitudinal, a lo largo de z, el ROE se desarrolla cuando la magnetizacin se mantiene esttica en el plano xy (transversal) por bloqueo de espines.

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Resonancia Magntica Nuclear La secuencia de pulsos del experimento ROESY (Figura 5.152) es muy similar a la del experimento TOCSY. En el ROESY la potencia del campo esttico B 1 para el bloqueo de
B B

espines es considerablemente ms dbil que el tren de pulsos del TOCSY.

Figura 5.152 Secuencia de pulsos del ROESY La seleccin de los tiempos de mezcla es anloga a la del NOESY. Valores del orden de 600 ms o menores son adecuados para molculas de masas moleculares moderadas. En macromolculas deben utilizarse los valores recomendados para el NOESY (100-300 ms) o menores teniendo en cuenta que el ROE crece dos veces mas rpido que el NOE. La accin del bloqueo de espines es mantener congelada la disposicin que los vectores de magnetizacin adoptan durante el perodo de evolucin. Esta disposicin se perdera por la accin de la dispersin de desplazamientos qumicos en ausencia del bloqueo de espines. El bloqueo permite el desarrollo de los ROEs por relajacin cruzada en el plano transversal. Aqu la relajacin est caracterizada por una constante de tiempo T 1 (T 1 ~ T 2 ). Al utilizar el bloqueo de
B B B B B B

espines estamos sustituyendo el campo esttico B 0 del NOE por el campo B 1 de la RF, mucho
B B B B

ms dbil. Mientras que B 0 corresponde a frecuencias del orden de los cientos de MHz, el valor
B B

de B 1 corresponde a los kHz (frecuencias en el sistema rotatorio). De aqu que la relacin


B B

1 c << 1 se cumple para todos los valores accesibles de c y las molculas, independientemente
B B

de su tamao, se comportan como si estuvieran en el rgimen de agudeza extrema. Los ROE son pues siempre positivos. Por lo tanto en el espectro ROESY los picos de cruce originados por contactos ROE siempre tienen signo opuesto a la diagonal. Aparte de los signos de las seales, la apariencia e interpretacin de los espectros ROESY es semejante a los obtenidos por el experimento NOESY. Los espectros ROESY tienden a presentar ms artefactos que los espectros NOESY, lo que puede conducir a interpretaciones errneas. Como se seal antes, la secuencia de pulsos del ROESY es muy similar a la del TOCSY aunque en el ROESY el bloqueo de espines se emplea para optimizar la transferencia de magnetizacin por interacciones dipolares en lugar de la transferencia coherente de magnetizacin a travs de los acoplamientos escalares que caracteriza al TOCSY. As como en el NOESY se pueden presentar artefactos tipo COSY, en el ROESY los

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Resonancia Magntica Nuclear ms frecuentes son de tipo TOCSY, es decir pueden observarse picos de cruce espreos entre espines del mismo sistema, pero que carecen de un real contacto ROE. Como se mencion anteriormente, el campo de bloqueo de espines en ROESY es apreciablemente ms dbil que el TOCSY. Esto reduce la intensidad de los picos espreos tipo TOCSY, que por otra parte tienen el mismo signo que los picos diagonales y pueden identificarse como tales
B B

en condiciones

favorables. La precaucin de desplazar la frecuencia de B 1 del centro del rango espectral contribuye a minimizar los artefactos TOCSY en el espectro ROESY. Los riesgos mayores de artefactos se presentan entre espines de desplazamiento qumico muy semejante y picos de cruce cercanos a la diagonal.

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