Tipos de cultivos

y técnicas de siembra

1. Describir los diferentes tipos de cultivos de microorganismos.

2. Describir los diferentes tipos de siembra de los cultivos microbianos.
3. Asociar las diferentes técnicas de siembra con los diferentes tipos de cultivo.
4. Tomar y trasvasar inóculos entre diferentes tipos de cultivos.
5. Realizar siembras en diferentes tipos de cultivos bacterianos.
6. Comparar las técnicas de cultivo en placa y en tubo utilizando el método de
las diluciones seriadas.
7. Conocer las técnicas de cultivo en anaerobiosis y en atmósfera de dióxido de
carbono.
B. Diferenciar entre las características morfológicas y culturales de los microor-
ganismos.
9. Adquirir el vocabulario mínimo imprescindible para la perfecta descripción
de la morfología bacteriana.
10. Adquirir el vocabulario mínimo imprescindible para la perfecta descripción
de las colonias bacterianas.
 ENs¡yos r',tcRoalolóG rcos

Mapa conceptual del capítulo

Trpos DE culTrvosvrÉcrurcns DE STEMBRA

CULTIVO DE BACTERIAS

TIPOS DE CULTIVO Y SUS SIEMBRAS

MANEIO DE TAS MUESTRAS

Y ToMA orr lruócuro

CULTIVOS EN PTACA

CULTIVOS MEDIANTE
DITUCIONES STRIADAS

uÉrooos DI cutrrvo ANAERoBTo

vAstlAs ANAEROBTAS

cutnvo rN ¡ruósrrnA Dt co,

cEn¡crenfsncAs MoRrolóc tc¡s

Y DE CULTIVO D[ UNA BACTERIA

uonro¡-ocf A BAcTERtANA

c¡n¡crrnfsrrcAs DE cuLTrvo

C¡pfrup 8
 Trpos DE cul'vos v tÉcNtcRs DE S,EMBRA
E

Cromogénesis. Producción de color.

Cuttivo en slanú. Cultivo en tubo corto que se deja solidificar inclinado con el fin de
tener con el mismo volumen de agar una mayor superficie de siembra. También se
denomina cultivo en "pico de flauta".
Dentado. Con el borde con forma de dientes de sierra o serrado.
Emulsión. Mezcla de líquidos inmiscibles de manera más o menos homogénea.
Equinulado. Con pequeñas espinas o protuberancias en forma de picos.
Filiforme. Con apariencia de hilos, algo fino y alargado.
Floculante. Con masas aglutinadas que precipitan.
Hidrófobo. Aquello que repele el agua, en nuestro caso, no absorbente.
tndicador redox. Sustancia orgánica que presenta más de un color (o incolora y un
color), según esté oxidada o reducida, en función del potencial de oxidación del
medio.
Lobulado. Formado por arcos de circunferencia.
lupa binocular. Lupa generalmente estereoscópica y de gran número de aumentos
con iluminación mediante fibra de vidrio. La obtención de imagen es por reflexión.
Farafina. Hidrocarburo saturado o mezcla de hidrocarburos saturados de más de
veinte átomos de carbono, y que se caracterizanpor su poca reactividad química.
Rizoide. Con forma de raí2.

8.f . Cultivo de bacterias

Los medios de cultivo pueden distribuirse de diversas formas, en tubos de ensayo, matraces o
frascos de tapón de rosca, según el tipo de siembra que se vaya a realizar.
Los tubos de ensayo y los matraces deben taponarse con cierres bien ajustados de algodón
no absorbente (algodón hidrófobo), con tapones de metal roscado, con tapones de plástico (ros-
cados o no) o con tapones especiales de goma.
Los frascos, y cualquier sistema, de tapones roscados, presentan la ventaja de que con ellos
se evita la evaporación, y el medio no se seca durante el periodo de almacenamiento.

Las técnicas de siembra de cultivos están supeditadas al tipo de cultivo utilizado, y éste a su
vez está en función de 1o que queramos observar o cuantificar.

8.2. Tipos de cultivo y sus siembras

A cada tipo de cultivo, en general, se le puede asociar un tipo de siembra habitual.

C¡pfru¡-o I
 ENs¡vos r¿rcnoeroLóGrcos

1. Cultivo en caldo.

Es un cultivo en medio líquido al que nose le añade ningún componente nutritivo

durante el crecimiento. Se puede reabzar en matraces de Erlenmeyer, frascos de cultivo
y tubos de fermentación.
La siembra se realiza por homogeneizacíín del inóculo, depositado con asa de siembra o
con pipeta de Pasteur en el caldo, mediante ag¡taciín en posición vertical, con las manos
o con a¡rda de agitadores eléctricos excéntricos de tipoVortex en el caso de los tubos,
o con agitadores de balanceo en el caso de frasco de cultivo y maüaces de Erlenmeyer.

2. Cultivo en masa en medio líquido.

Son cultivos en medios líquidos y en grandes volúmenes que se utilizan generalmente

como forma de obtener un metabolito o componente bacteriano, para su análisis o su
utfización como producto de consumo.Así casi toda la insulina utilizada,procede del
cultivo controlado de cepas de E. coli modificadas genéticamente para su producción.
Los problemas se multiplican con el volumen parala esterilización, el control del medio
y el control de la temperatura. Su utilización es en Grmentadores industriales.
La siembra se realiza con adición de una suspensión controlada del microorganismo ade-
cuado que suponga aproximadamente un 10% del total del volumen que se ve-autiLizar.

3. Cultivo continuo en medio líquido.

Así se denomina a aquel cultivo, generalmente en masa en medio líquido, al que cons-
tantemente, o a ciertos intervalos, se le suministran nutrientes y simultáneamente se
extrae un volumen proporcional de cultivo. Como en el caso anterior, se utiliza en
procesos industriales.
. La siembra se realiza de la misma forma que en el caso anterior.

4. Cultivo en medio semisólido.

Así sedenomina al cultivo que se deja crecer en un medio que contiene la sufi.ciente
cantidad de agar como para aumentar la viscosidad del medio (de un 0,02-0,3%o),pero
insufi.ciente para producir la total solidificación del mismo. Generalmente, se reahza
en tubos de Grmentación.
La siembra se realiza por homogeneización del inóculo mediante agitación vertical,
salvo si utilicemos el aumento de la viscosidadpara disminuir la difusión del oxígeno,
en cuyo caso no se homogeniza en absoluto, sino que se descarga mediante pipeta en
el centro del mismo y aplicándolo mientras se extrae uniformemente casi desde el
fondo a casi la superficie del medio.

5. Cultivo en agar inclinado.

. Se emplean tubos de ensayo pequeños o viales que contienen unos 5 mL de un medio

de agar o gelatina y se dejan enfriar en posición inclinada en un soporte.También se
denomina en slant o en "pico de flauta". El medio resultante es sólido.

Cnpfrulo 8
 Ttpos DE culTlvos v rÉcNtc¡s DE SIEMBRA

. La siembra se realíza bien en toda la superficie del medio o bien a lo largo de una
estría delgada con la ayudade un asa de siembra.A veces también se incluye la siembra
en el fondo para lo que se utliza un pincho de siembra.

6. Cultivo en picadura.

. Se emplean tubos de Grmentación o frascos pequeños que presenten poca superficie

libre respecto del volumen utilizado. Se llenan de agar,y se dejan solidificar en posición
vertical. Se utilizan para minimizar la difusión del oxígeno en el medio, por 1o que se
suelen sellar con parafrna o con cualquier otro elemento además de cerrarlos con su
tapón, preGriblemente de rosca.
. La siembra se deposita mediante una aguja de siembra verticalmente y en el centro
del tubo.

7. Cultivo en tubo en masa en medio sólido.

Se utilizan tubos de ensayo que contienen un medio sólido. El medio se funde, se en-
fría a unos 45 "C.
Se siembra el inóculo, se agita mediante giro del tubo y se deja enfriar en posición
vertical.
lJn sistema menos común y que tttliza mucho menos medio sólido hace solidificar
el agar en el tubo y con el inóculo en unos cilindros rotatorios y fríos, por lo que se
cubre totalmente la superficie interna del tubo.

8. Cultivo en placa de Petri.

. Se usan placas de Petri, utilizando un medio sólido fundido estéril de unos 10-15 mL
y atemperado para dejarlo solidificar a temperatura ambiente. Existen diferentes téc-
nicas y, por tanto, diGrentes formas de siembra.
. Siembra en masa: donde se vierte mediante pipeta el inóculo en la placa de Petri
estéril y vacia,para posteriormente adicionar el medio estéril y atemperado. Se ho-
mogeniza con ligeros movimientos, norte-sur, este-oeste y movimientos suaves cir-
culares horario y antihorario, para dejar solidificar.
. Siembra en superficie: se prepara y se seca la placa de Petri de forma habitual, para
verter el inóculo en su centro y extenderlo mediante un asa de Driglaski estéril en
toda la superficie de forma homogénea.
. Siembra por agotamiento en estrías: se utiliza una placa preparada con en el caso an-
terior y se siembra mediante un asa de siembra, intentando que la carga efectiva de
inóculo sea cada vez menor en función del trazado.

8.3. Maneio de las muestras y toma del inóculo

La torna del inóculo (de una muestra que hay que examinar, de un medio sólido o de un tubo
de ensayo con un medio líquido) es simple, pero requiere prestar toda la atención posible para
que la técnica resulte adecuada.

C¡plruro 8
 ENsnyos tvtrcRoatoLóGrcos

1. Colócate frente al mechero, disponiendo

delante la preparación o muestra que
$ v
)n contenga. los microorganismos, así como
H tl -11 l-r el resto del material necesario (poraob-
lfll
E
U ü rFr '-E- il jetos, tubos, placas, etc.), para ser alcan-
E
t{

E
ax
zado con facilidad y sin tropiezos.

=
ll¡l a#r ,-\ 2. Toma el asa de siembra o aguja y flamea

L
4 I el filamento en toda su extensión hasta
el rojo incandescente, dejándolo enfriar
il
rfFr tt
tt
ll ll ¡l
R
(durante unos 10 segundos) en la pro-
E E ^
ximidad de la llama.
J. Toma con la otra mano el recipiente
¡4
@
$ (tubo, placa, etc.), que contiene la

a¿áE
I l^

E
l-j

üu :r
E
A
tl
lol
muestra o los microorganismos. Si la
muestra está en un fubo, quita el tapón
con los dedos anular y meñique y fla-
mea la boca del tubo. Si la muestra está
en una placa, se coloca invertida sobre
la mesa y se levanta la parte de la placa
que contiene el medio de cultivo, lle-
vándola a la proximidad de la llama del
mechero.
4. tabajando en la proximidad de la
llama, se introduce el asa de siembra y
se toma una pequeña cantidad de cul-
tivo. Si el medio es líquido, agita ligera-
mente el tubo y toma la muestra que
quedará adherida, por tensión superfi-
cial, en el extremo del asa de siembra.
Si el medio es sólido, toma una pe-
queña porción de colonia mediante un
Figura 8.1 ligero roce con el asa de siembra. Si la
Esquema y fotografia de la toma de inóculo muestra se encuentra a profundidad,
de slanty su paso a placa de Petri hunde una aguja (mejor que el asa)
dentro del medio hasta tomar una pe-
queña porción de la misma.
5. inóculo con el asa de siembra (o pincho) a otro medio estéril tomando las
Transfi.ere el
mismas precauciones de antes en cuanto a las condiciones asépticas.

Si la transGrencia se va a reaftzar a un caldo, se descarga. el inóculo mediante agitación

del asa de siembra en aquél.
Si la transferencia se va a realtzar en slant, se introduce el asa con el inóculo y se siembra
en su superfi.cie en zígzag (a veces longitudinalmente).
Si la transferencia se va a realizar en placa, se deposita el inóculo en un área pequeña
de la superficie y cerca del borde para seguir con la técnica adecuada (estría única,
agotamiento en estúas paralelas u oblicuas, etc.).

C¡pfrulo 8
 Tlpos DE culTtvos v rÉcNtcns DE SIEMBRA

\J na v ez reahzada la transferencia:

- En el caso de los tubos, flamea la boca de los mismos antes de colocar el tapón. Marca los
tubos con la identificación del cultivo, la Gcha y el nombre, para pasarlo a incubación.
- En el caso de placas de Petri, tapala placa para incubarla, marcando en la base de la placa
la identificación del cultivo,la fecha y el nombre.
- Antes de dejar el asa de siembra sobre la mesa, flamea nuevamente con el objeto de es-
terlizarla.

8.4. Cultivos en p¡aca

Son los más usuales junto con los rubos de fermentación de medio líquido. Se utiliza cuando se
necesita una gran superficie de medio (elevada relación superfrcie/volumen), generalmente para
separar ,¿na mezcla de bacterias, es decir, para el aislamiento y resiembra hasta llegar a cultivos
puros, que son aquellos que contienen un único tipo de microorganismos.
Podemos distinguir dos tipos de técnicas:

1. Placas preparadas.

a) Preparación de las placas.

En condiciones asépticas, se depositan 10-15 mL de medio fundido estéril en una
placa de Petri también estéril, de manera que forme una delgada capa que se deja so-
lidificar. La parte exterior del tubo de ensayo o del frasco que contiene el medio lí-
quido debe secarse antes de proceder al llenado de las placas, con el fin de evitar que
caigan en su interior gotas de agua.
ú) Secado de las placas.
lJna vez llenas las placas y solidificado el medio, éstas deben secarse ya que la hu-
medad que se forma sobre la superficie del medio podría impedir la formación de
colonias aisladas.
. Secado rápido:las placas se secan a 37 "C en estufa durante 20-60 minutos. En
prirner lugar se coloca la tapa de la placa invertida y después se invierte la parte
de la misma que contiene el medio, colocándose de tal forma que una parte
de la misma se apoye sobre la tapa. Con este método de secado se evita la con-
taminación producida por el polvo.
. Secado conyencional: también pueden secarse las placas cerradas en estufa durante
uno o más días hasta la total evaporación del agua condensada en las tapas, sin
quitar éstas y colocando como siempre las placas en posición invertida. Por este
procedimiento, también se detecta al mismo tiempo si una placa ha resultado
contaminada.
c) Siembra de las placas.
Generalmente se utiliza la inoculación en superfi.cie, trazando una o varias estrías
con ayuda de un asa de siembra. Se puede rcalízar con más de una técnica:
. Extensión en superficie: se distribuye, empleando una espátula o un asa de Dri-
glaski, el inóculo por toda la superficie del medio de cultivo contenido en la

C¡plrulo 8
 ENsnvos rrltcnogtoLóG rc os

placa. Luego, sin volver a cargar la espátula o asa, se repite el proceso tantas
veces como sea necesario diluir la concentración del inóculo hasta asegurar el
aislamiento de las colonias, preGriblemente una.

Figura 8.2
S. cerevisiae en agar Saboreaud CENAM
tetraciclina. Siembra en superficie

. Aíslamiento por agotamiento en estrías: con un asa de platino cargada de material se

deposita en una zona sobre la superficie del medio y cerca del borde de la placa.
Se esteriüza el asa, y sin cargar nuevamente se trazan estrías en un sentido, para re-
petir el proceso tantas veces como sea necesario hasta poder lograr aislar colonias,
preGriblemente una sólo. Las estrías pueden hacerse bien en perpendicular o bien
de forma oblicua. Esa técnica de agotamiento descrita ofrece muchas garantías,
pero puede efectuarse según múltiples versiones.

oooo
@@@@
Figura 8.3
Esquema y fotografi,a de la técnica
de agotamiento en estrías.
En cada paso se debe esterilizar
elasa de siembra

C¡pfiulo 8
 Tlpos DE culTrvos v TEcNlcAs DE SIEMBRA

Prnnsrarn"0, ¡l@I El método de ogotomiento en estríos mediqnte porolelos oblicuos no es

único. Como olternotivo se puede usor el método de ogolomiento en estríos
medionte porolelos y perpendiculores, el método de tres giros, o olgunos que
implicon uno único estrío que se reporte por todo lo ploco. En cuolquier coso,
si el método implico mós de un trozo, o sentido de trozos, sobre lo superficie
del ogor, debe esterilizorse ol roio vivo el oso de siembro, y deior enfrior en
los olrededores del mechero {zono estérilf ontes de comenzor el trozo o grupo
de trozos siguientes. Hoy que recordor que el úníco fin de este método es el
oislomiento de colonios poro su descripción y purificoción, en el sentido de
que o codo colonio por seporodo le corresponde un único tipo de microor-
gonismo y son todos clones.

O @
O @
@ e
2. Siembra en masa o método de dilución.
I.Jttltza todo el medio de cultivo,y no como en los dos apartados anteriores que uti-
lvaban exclusivamente la superficie. Podemos bien depositar en una placavacia una gota
de material objeto de nuestro estudio y verter sobre ella el medio de cultivo, teniendo la
precaución de que esté fundido pero a temperatura adecuada (45 "C) para homogeneizar
(con movimientos de vaivén en dos direcciones perpendiculares, y posteriormente en
dos sentidos circulares), o bien preparar el medio de cultivo fundido y atemperado en un
tubo de ensayo, sembrar el material objeto de estudio, homogeneizar por rotación vertical
y verter el contenido en una placa de Petri.A esta técnica también se la denomina siembra
en rnasa, y le es aplicable una doble capa con otros 5 mL de medio rtrra vez solidificado
el primero, si queremos trabajar en condiciones de microaerofilia.

C¡pírulo 8
 ENsnvos rrltcnosror-óG rcos

8.5. Cultivos medíante diluciones seriadas

El método de dilución, utilizando la siembra en masa o en superficie, o utilizando el método de
tubos de fermentación múltiples, también puede hacerse cuantitativo.
Consiste en realizar diluciones sucesivas de la muestra en condiciones de esterilidad con ob-
jeto de sembrar cantidades conocidas de las mismas en placas de Petri (o en tubos de cultivo
según algunas técnicas de recuento). Es obvio que utilizando varias diluciones alguna de las mis-
mas será tal que originará en una placa colonias separadas y por tanto puras y, además, susceptibles
de ser contadas parala utilización de las técnicas de recuento.
Por tanto, conocidos el número de colonias, la cantidad sembrada y la dilución correspon-
diente, esta técnica permite evaluar el número de gérmenes viables de la muestra original. Existen
varios métodos y se realizan con pipeta, pues se necesita relaciones de volúmenes exactas.

1. Obtención de las diluciones seriadas:

Flamea ligeramente la punta de una pipeta de 10 mL estéril, abre ligeramente el

")
recipiente que contiene la solución estéril, flamea la boca del recipiente, toma
9,9 rlaL de contenido, flamea nuevamente la boca del recipiente y tápalo. La tapa
o tapón debe quedar en la mano del analista y nunca sobre ninguna superficie.
b) tansfiere el volumen a un tubo estéril, flameando su boca después de retirar su
tapón y antes de volverlo a poner (los tapones nunca se dejan en la mesa, ni la pi-
peta debe tocar con su extremo ningún objeto, ni abandonarla zona de proximi-
dad de la llama).
t) Con la misma pipeta, llena con 9,9 mL de la solución estéril un nuevo tubo.
d) Con la misma pipeta, llena con 9 mL de la solución estéril tantos tubos como
sean necesarios.
e) Con una pipeta estéril de 1 mL y flameada se toma 0,1 mL de la muestra original,
primer tubo con 9,9 mL,se agita y se marca como 1/100 o 10 2.
se transfi.ere al

1mL
liillilltlltillilil-ll
:
oa-l
j-

m
o
l@l
L---J
9mL
Diluyente estéril

E¡EIEl
Figura 8.4
Preparación de diluciones
decimales

C¡pfium I
 Trpos DE cuLTtvos v rÉcNlcns DE SIEMBRA

J) Del tubo de 10-2, se toman 0,1 mL y se repite el proceso con el segundo tubo de
a.
9,9 mL de contenido, para agitar y marcar como 10
s) Con una pipeta estéril de 1 mL, y a partir de las diluciones ya preparadas o de la
muestra original, se toma 1 mL y utilizando los tubos que contienen 9 mL de so-
1,10-3
lución estéril, se prepanrn las diluciones necesarias (usualmente las diluciones, 10
v 10-).

También puede preparar la serie de diluciones decimales a partir de la disolucron

se
madre general de la muestra (10-1, obtenida a partir de 10 g o mL de la muestra en 90 mL
de diluyente, o mejor aún, con 50 g o mL de muestra en 450 mL de diluyente), to-
mando 1 mL de la misma para llevarlo sobre un tubo con 9 mL de diluyente, agitando
y etiquetando, para repetir el proceso (siempre con una pipeta estéril nueva) tantas
veces como diluciones sean necesarias. Este método resulta incluso más cómodo que
el anterior pues se puede partir de tubos con el diluyente, todos con 9 mL exactos y
esterilizados.
A cada denominador de la fracción considerada (o inversa de la dilución) se le deno-
mina factor de dilución y es imprescindible para rcalizat los recuentos.
2. Transferencia a las placas.

Generalmente se transfiere 0,1 o 1 mL de cada tubo seriado a la placa (en función

de si realizamos una siembra en superficie o en masa) o a los tubos de cultivo si así 1o
requiere latéctica de recuento. Si se desea utilizar una sola pipeta, parala siembra de
varias diluciones, se debe comenzar por la de factor de dilución más alto (la más diluida),
y seguir por este orden. En caso contrario, habrá de emplearse una pipeta para cada di-
lución. Todas las pipetas deberán depositarse en recipientes con solución esterilizante
después de su uso.

*t

Figura 8.5
Placa para recuento en masa
y NMP a partir de diluciones
decimales

Cnpfrurc 8
 ENsnyos t trcRoatolóGrcos

8.6. Métodos de cultivo anaerob¡o

Para el cultivo de microorganismos anaerobios se debe mantener un ambiente que carezca de
oxígeno, lo que se consigue mediante la uttlizaciín de un medio que contenga sustancias re-
ductoras, o modificando algunos otros por adición de sustancias reductoras como la glucosa, el
tioglicolato sódico, el ácido ascórbico o la cisteína.
Los medios ya preparados no pueden conservarse durante mucho tiempo. El oígeno disuelto
en un medio se elimina por calefacción de éste, y se evita la entrada del oigeno atmosférico
cubriéndolo con una capa gruesa de agar,de parafina o de vaspar (mezcla a partes iguales de va-
selina y parafina), o incluso cubriéndolos de aceite mineral (todos ellos estériles).
También pueden ser usadas las vasijas anaerobias de cultivo y el método de la vela, para ase-
gurar la ausencia de oxígeno en el medio de crecimiento.
Como ejemplos de medios de cultivo de microorganismos anaerobios:

1.. Medio carne cocida de Robertson.

Está compuesto de carne picada, cuyas sustancias reductoras mantienen la anaerobiosis
del medio. Si bien este medio es comercial, resulta menos efectivo que preparándolo en
el laboratorio.
2. Cultivo en masa en tubo.
Se hace en tubos o frascos que contienen un medio sólido al que se la ha añadido
una sustancia reductora. Se puede emplear un agar nutritivo al que se le añade un lYo de
glucosa como reductor.
J. Cultivo en medio semisólido.
Estos medios, evitan la difusión del oigeno. Se le afrade azul de metileno como in-
dicador del potencial redox del medio, permaneciendo azul en presencia de oigeno y
decolorándose en ausencia del mismo. (Jn medio de color azul verdoso debe calentarse
antes de ser usado, siendo suficiente colocando al baño li4:aúa durante unos 10 minutos.
El medio más utilizado de este tipo es el denominado medio de clostridios reforzado
que contiene glucosa y cisteína como agentes reductores.
4. Cultivos en medios líquidos.
Los meüos líquidos pueden Írantenerse en condiciones anaeróbicas si se u''JTtzanrnate-
riales estériles que ga.ranticen un cierre hermético. Los tubos que contienen los medios de
cultivo deben ser sometidos a calefacción (baño María durante 10 minutos) y posteriormente
deben ser sellados (con vaseüna,parafrna sólida o agar) después de sembrados, o antes, para
lo cual se deben sembrar posteriormente (utilizando pipeas capilares) vrra vez fundido el
cierre. Se ha generalizado el uso del vaspar que se prepara fundiendo (o esteriüzando) con-
juntamente, cantidades de vaseüna y parafrna a partes iguales. El uso de parafina líquida está
siendo relegado, pues resulta imposible la detección de la formación de gas.

8.7. Vasijas anaerobias

Con el fin de cultivar y aislar bacterias anaerobias, se pueden encerrar en vasijas anaerobias las placas
y los tubos que contienen cualquier medio que se vaya a cultivar en una atmósfera sin oxígeno.

Cnpfrulo 8
 Tlpos DE culTtvos v rÉcNlcns DE SIEMBRA

El aire en una vasija anaerobia puede sustituirse por nitrógeno sin oigeno.
La vasija anaerobia también aprovecha la reacción cataliica,y no explosiva, que se produce
entre en el hidrógeno y el oxígeno, eliminando este último. Estas vasijas pueden realizar su ca-
tálisis bien en frío o bien en caliente con suministro eléctrico.
Existen diGrentes métodos:

1,. Utilización de suministro exterior de hidrógeno.

Donde además de los cultivos se coloca un indicador redox. Si utilizamos placas,
conviene separar ligeramente las dos mitades con una tira estrecha de papel de filtro
para evitar que el agua de condensación las una. Es preciso antes de llenar de hidrógeno
(para evitar el peligro de explosión) hacer el vacío a la vasija para eliminar el oúgeno.
2. Método Gaspak@.

El suministro de hidrógeno es interno al poner en un recipiente metálico borohidruro

sódico (que al reaccionar con el vapor de agua forma hidrógeno) y vrr;- mezcla de ácido
cítrico e hidrogenocarbonato sódico (que forma dióxido de carbono en contacto con
agua). La reacciln entre el hidrógeno y el oxígeno se verifica mediante un catalizador en
frío. Como medio indicador se suele utilizar azul de metileno.
J. Sustitución de oúgeno por nitrógeno.
Para hacer mínimo el oigeno residual, se llena y vacía varias veces la vasija.
4. Método de la vela.
Es un método sencillo y económico que utiliza tntrozo de vela y un frasco, prefe-
rentemente de rosca que pueda ser cerrado herméticamente. lJna vez dispuesto el cultivo
y encendida la vela, al cerrar el frasco, la vela consume todo el oúgeno hasta apagarse,
consiguiendo tener así una atmósfera anaerobia. Se puede usar perfectamente una cubeta
de cromatografia que cierre herméticamente gracias a la grasa de esmerilados; al agotar
el oigeno, y, gracias a los vapores deprendidos, cuando se enfrían éstos ocupan menos
volumen y realizan una succión que hace el cierre totalmente hermético.

8.8. Cultivo en atmósfera de €Oo

Algunos microorganismos crecen mejor en condiciones de microaerofi.lia y una forma de con-
seguirlo es eliminar parte del oxígeno transformándolo en dióxido de carbono, por ejemplo,
Helicobacter pylori.
Algunas bacterias, como ciertos tipos de Brucella, o Campylobacter spp., crecen solamente en
atmósferas que contengan una elevada concentración de dióxido de carbono. Se dice de estos
microorganismos que son capnófilos, ya que requieren de una elevada cantidad de dióxido de
carbono.
Otras, aunque no es absolutamente necesario, crecen mejor en atmósGras enriquecidas en
este gas como es el caso de Borrelia burgdorferi.
El suministro del dióxido de carbono a través de botellas r^ravez es utilizado.
Como generador interno se suele lui.lizar un trozo de mármol en reacción con ácido clor-
hídrico que produce una concentración aproximada del 5o/0, o mediante el empleo de genera-

C¡plrulo 8
 ENsRyos ¡¡rcRosroLóGrcos

dores comerciales como el utilizado en el método GasPak, utilizando el hidrógenocarbonato

de sodio y el ácido cítrico como reactivos generadores.
También el propio sistema del método de la vela genera dióxido de carbono al eliminar
todo el oigeno.

Figura 8.ó
Cultivo con €l método de la vela,
Gas Pak@ y cambio de atmósfera. CDC PHIL

8.9. Características morfológicas y de cultivo de una bacteria

Sin querer ser exhaustivos, en una primera aproximación deben describirse tanto las características
morfológicas de las bacterias (obtenidas mediante su visualización microscópica), como las ca-
racteústicas de los cultivos, es decir, las características de las colonias que se pueden formar en
función del medio de cultivo, pero nunca debemos confundir las caracteústicas morfológicas con
las características culturales o de culdvo, para las primeras necesitamos microscopios y fuertes au-
mentos, y las segundas son perfectarnente visibles, aunque a veces es preferible la utilización de
una lupa binocular.Además las caracteústicas culturales dependen del medio de culrivo.

8.9.1 . Morfología bacteriana

1. Coloración de Gram.
2. Forrna.

Cnpfrulo 8
 3. Tamaño.
4. Ordenación.
5. Movilidad.
6. Presencia de otros elementos:

' Cápsulas.
. Flagelos.

7. Coloración con tinciones especiales:

. Zietrl-Neelsen.
. Tinción negativa.

8,9,2, Características de cultivo

1. Colonias en superficies de meüos Puntiforme
sólidos:
a ao a

a) Forrna; aa I
.lt
. Circular.
Circular lrregular
. Irregular. Ooo
. Rizoide, etc.

b) Tamaño: se designa en milíme-

tros. Se üce que es puntiforme
si es menor de 1 mm. Filamentosa
Cromogénesis: color del pig-
mento y si es soluble o no en el
Figura 8.7
medio. Formas típicas de colonias

d) Opacidad:

. tansparente.
. Tianslúcido.
. Opaco.

e) Elevación:

. Plano.
. Elevado.
. Convexo. Figura 8.8
. Prominente, etc. Elevaciones típicas de colonias
 E Ns¡yos lr^rc nosrolóG rcos

J) Super6cie: Ondulada
. Lisa.
. Rugosa.
. Mate.
,4S#r.
. Brillante. tobulada ,W.. .'-
ffi {5: W
g,) Forma del borde:

. Entero.
. Ondulado.
. Lobulado. Filamentosa

. Dentado. Figura 8.9

. Rizoide, etc. Bordes típicos de colonias

h) Consistencia:

. Mantecosa.
. Viscosa.
. Granular.

Capacidad de emulsión: fácil o dificil en agua;forma una suspensión turbia uniforme;

forma una suspensión grumosa; no emulsiona.
i) Olor: no existe;existe y descripción del mismo.

Figura 8.10
Placas con colonias de
aspecto variado

2. Colonias en cultivo en caldo:

a) Canridad de crecimiento:

. Ninguna.
. Escasa.

€¡pfiulo 8
 Ttpos DE cuLTtvos v tÉcNtcRs DE SIEMBRA

a Moderada.
a Abundante, etc.

Figura 8.1I
Crecimientos típicos
Sin crecimiento Nebuloso Floculante Película Anillo bacterianos en caldo

b) Crecimiento en la super6.cie: positivo o negativo;formación de un anillo;película que

o no al agitar.
se desintegra
t) Türbidez:

. ljniforme.
. Floculante.
' Negativa.

d) Depósito: cantidad; granular, floculento, viscoso; se desintegra o no aJ' agitar.

3. Colonias en cultivo en masa: se debe anotar el crecimiento y su situación; en la superficie;

en el fondo, teniendo en cuenta su profundidad comparándola con la posición del cre-
cimiento óptimo.

BU@H
Aerébico Anaeróbico
facultativa
Microaerófilo Anaerobio
Figura 8.12
Crecimientos típicos
bacterianos en masa

C¡pÍrulo 8
 ENsnyos r¡rcnos¡olóGrcos

4. Colonias en cultivo en slant: se debe anotar el crecimiento y su situación en la superficie,

su abundancia y su forma.

. Arborescente. . Filiforme,
. Perlado. . Esparcido.
. Equinulado. . Rizoide, etc.

Figura 8.13
Crecimientos típicos
bacterianos en slant
BBBUUB
Arborescente Equinulado Esparcido

Dacrrrnan
l------------l
Aunque todos los microorganismos necesitan para proliferar o crecer un medio nutritivo
adecuado, y unas condiciones físicas y medioambientales óptimas, no todos se cultivan
de Ia misma forma. En general los métodos de cultivo son diferentes, cuando los objetivos
que se han de cumplir con ellos también Io sean, y éstos pueden ser tan variados como:
Ia observación de microorganismos, la identificación de microorganismos, el recuento
de microorganismos o la producción industrial de un bien de consumo utilizando mi-
croorganismos.
Además, parece lógico que en los diferentes tipos de cultivo se deba sembrar de forma
diferente, por lo que conviene asociar cada tipo de cultivo con el tipo de siembra ade-
cuado.
Por otro lado, a veces, no se le da la importancia adecuada al medio ambiente donde
se va a cultivar el microorganismo, cuando puede ser crítico, no sólo en cuanto a la tem-
peratura y tiempo necesario, sino también en cuanto a Ia composición de Ia atmósfera
donde debe proliferar. A nadie se le escapa la dificultad que debe tener un microorga-
nismo intestinal intentando sobrevivir en el aire.
Por último, a partir de los resultados de los diferentes tipos de cultivo podemos obtener
una valiosa información para la descripción y categorización de los microorganismos,
por Io que debemos conocer un vocabulario Io suficientemente amplio como para des-
cribir tanto la morfología bacteriana como las colonias o características que pueden dar
en los diferentes tipos de cultivo.

C¡pírulo 8
 Trpos DE cuLTtvos y rÉcNtcns DE SIEMBRR

Objetivo Sembrar los diferentes medios de cultivo como caldo y otro como agar prepara-
dos en la práctica n." 6.

Material . Asa de siembra (Henle).

. Pincho de siembra.
. Asa de Driglaski.
. Pipetas Pasteur.
. Viales.
. Mechero.

Medios a Preparados en la práctica n.o 6.

a Caldo lactosado.
a Agar para recuento en placa (PCA)

Muestra . Agua estancada

Procedimientos SIEMBRA EN CALDO LACTOSADO.

1. Trabaja siempre, al menos, por duplicado para que los resultados obtenidos
sean concluyentes.
2. Toma un asa de siembra y esteriliza en el mechero. Deja enfriar en su proxi-
midad en la zona estéril de su influencia.
3. Sin soltar el asa de siembra en la mano derecha, toma con la izquierda el
vial que contiene la muestra de agua estancada y con el dedo meñique y el
anular de la derecha sujeta el tapón.
4. Flamea suavemente la boca del vial.
5. lntroduce el aro del asa de siembra en el líquido del vial.
6. Vuelve a flamear la boca del vial y ciérralo.
7. Con la misma técnica abre y flamea el tubo de fermentación con el caldo
lactosado y la campana Durham.
8. lntroduce el asa con el inóculo y agita para descargar su contenido.
9. Flamea y cierra el tubo de fermentación con el tapón, que siempre ha estado
en la mano derecha.
10. lncinera el asa de siembra.
1 1. Homogeniza con el Vortex, presionando con fuerza con los dedos pulgar e

índice hasta donde quieras que suba el torbellino.

SIEMBRA EN PICADURA EN TUBO.

1. Trabaja siempre, al menos, por duplicado para que los resultados obtenidos
sean concluyentes.
2. Toma un asa de siembra y esteriliza en el mechero. Deja enfriar en su proxi-
midad en la zona estéril de su influencia.
3. Sin soltar el asa de siembra en la mano derecha, toma con la izquierda el
vial que contiene la muestra de agua estancada y con el dedo meñique y el
anular de la derecha sujeta el tapón.

C¡pírurc 8
 ENs¡yos r,ucnoerolóG rcos

Procedimientos 4. Flamea suavemente la boca del vial.

5, lntroduce el aro del asa de siembra en el líquido del vial.
6. Vuelve a flamear la boca del vial y ciérralo.
7. Con la misma técnica abre y flamea el tubo de fermentación con el slant de
agar PCA.
8. lntroduce el pincho con el inóculo en el centro del tubo, de forma vertical y
sin desviarse.
9. Funde en una cuchara con la ayuda del mechero unas lentejas de parafina
estéril.
10. Vierte la parafina estéril líquida, cubriendo totalmente la superficie interna
del tubo y deja solidificar.
'l .l
. Pon el tapón, que siempre ha estado en la mano derecha, en el tubo de fer-
mentación.
'l
2. lncinera el pincho de siembra.

SIEMBRA EN 5¿l4Nf.
1. Trabaja siempre, al menos, por duplicado para que los resultados obtenidos
sean concluyentes.
2. Toma un pincho de siembra y esteriliza en el mechero. Deja enfriar en su
proximidad en la zona estéril de su influencia.
J. Sin soltar el pincho de siembra en la mano derecha, toma con la izquierda
el vial que contiene la muestra de agua estancada y con el dedo meñique y
el anular de la derecha sujeta el tapón.
4. Flamea suavemente la boca del vial.
5. lntroduce el aro del asa de siembra en el líquido del vial.
6. Vuelve a flamear la boca del vial y ciérralo.
7. Con la misma técnica abre y flamea el tubo de fermentación con el s/ant de
agar PCA.
8. Con el asa de siembra con el aro plano, y comenzando desde el fondo de la
superficie, traza una línea única en zigzag, cada vez más abierta, hasta el
comienzo de la superficie.
9. Pon el tapón en el tubo, que siempre ha estado en la mano derecha, en el
tubo de fermentación.
10. lncinera el asa de siembra.

SIEMBRA EN PLACA POR ACOTAMIENTO EN ESTRIAS.

1 . Trabaja siempre, al menos, por duplicado para que los resultados obtenidos
sean concluyentes.
2. Toma un pincho de siembra y esteriliza en el mechero. Deja enfriar en su
proximidad en la zona estéril de su influencia.

C¡ptrur-o 8
 Trpos DE culTtvos v tÉcNlcns DE SIEMBRA

Procedimientos 3. Sin soltar el pincho de siembra en la mano derecha, toma con la izquierda
el vial que contiene la muestra de agua estancada y con el dedo meñique y
el anular de la derecha sujeta el tapón.
4. Flamea suavemente la boca del vial.
5. lntroduce el aro del asa de siembra en el líquido del vial.
6. Vuelve a flamear la boca del vial y ciérralo.
7. Con la mano izquierda da la vuelta a la placa de Petri que vendrá invertida
del proceso de secado o de su conservación.
8. Sin abrirla totalmente y en el entorno del mechero, deposita el asa de siembra
con el aro plano en la placa (a las doce) haciendo una estría hasta la mitad
de la distancia al centro.
9. Vuelve a incinerar al rojo el asa de siembra y a enfriar en el entorno del me-
chero.
10. Tocando el anterior trazo, traza de tres a cuatro líneas oblicuas y paralelas
entre sí.
11. Vuelve a incinerar al rojo el asa de siembra y a enfriar en el entorno del me-
chero.
12. Tocando las anteriores líneas oblicu as, traza de tres a cuatro líneas oblicuas
y paralelas entre sí.
13. Vuelve a incinerar al rojo el asa de siembra y a enfriar en el entorno del me-
chero.
14. Tocando las anteriores líneas oblicu as, traza de tres a cuatro líneas oblicuas
y paralelas entre sí.
15. Vuelve a incinerar al rojo el asa de siembra y a enfriar en el entorno del me-
chero.
.l
6. Tocando el último grupo de líneas oblicuas paralelas, haz una estría en zig-
zaghacia el centro de la placa.
17. Tapa totalmente e invierte la placa de Petri.
18. lncinera el asa de siembra.

SIEMBRA SUPERFICIAL EN PLACA.

1. Trabaja siempre, al menos, por duplicado para que los resultados obtenidos
sean concluyentes.
2. Toma una pipeta de Pasteur estéril.
3. Sin soltar la pipeta en la mano derecha, toma con la izquierda el vial que
contiene la muestra de agua estancada y con el dedo meñique y el anular
de la derecha sujeta el tapón.
4. Flamea suavemente la boca del vial.
5. lntroduce la pipeta y toma una pequeña porción del líquido del vial'
6. Vuelve a flamear la boca del vial y ciérralo.

C¡pÍrulo 8
 ENsRyos lt rcnoerotóGrcos

Procedimientos 7. Con la mano izquierda da la vuelta a la placa de Petri que vendrá invertida
del proceso de secado o de su conservación.
8. Sin abrírla totalmente y en el entorno del mechero, deposita dos gotas (apro-
ximadamente 0,1 mL) en el centro.
9. Desecha la pipeta al contenedor con solución desinfectante.
10. Con la ayuda de un asa de Driglaski, con movimientos suaves y circulares
extiende el inóculo en toda la superficie de la placa.
11. Tapa totalmente e invierte la placa de Petri.
12. Desecha el asa de Driglaski en el contenedor de solución desinfectante.

SIEMBRA MASA EN PLACA.

1. Trabaja siempre, al menos, por duplicado para que los resultados obtenidos
sean concluyentes.
2. Toma una pipeta de Fasteur estéril.
3. Sin soltar la pipeta en la mano derecha, toma con la izquierda el vial que
contiene la muestra de agua estancada y con el dedo meñique y el anular
de la derecha sujeta el tapón.
4. Flamea suavemente la boca del vial.
5. lntroduce la pipeta y toma una pequeña porción del líquido del vial.
6. Vuelve a flamear la boca del vial y ciérralo.
7. Con la mano izquierda abre un poco una placa de Petri estéril nueva.
8. Sin abrirla totalmente y en el entorno del mechero, deposita veinte gotas
(aproximadamente 1 mL) gotas en el centro.
9. Desecha la pipeta al contenedor con solución desinfectante.
10. Añade a la placa 15-20 mL de agar PCA atemperado a 45-50 "C.
1 1. Homogeniza con suaves movimientos de vaivén en una dirección en ambos
sentidos, en la dirección perpendicular, y con suaves movimientos circulares
en sentido horario y antihorario.
12. Deia solidificar e invierte.

Cnpfrup 8
 Trpos DE culTrvos v r.cNrcAs DE
''EMBRA ![

ACTIVTDADES DE AUTOEVALUACIÓN

1. El tipo de medio de cultivo se debe elegir acorde a:

X a) Lo que queramos observar, medir o producir.
tr b) El microorganismo objeto de investigación.
! c) Lo que queramos observar medir o producir y el microorganismo objeto
de investigación.

2. Ala hora de realizar una siembra para un análisis, ésta estará condicionada por:
I a) El tipo de medio y el objetivo que se desea conseguir.
n b) El tipo de microorganismo.
tl c) Nada. Cualquier tipo de siembra es válida para cualquier tipo de medio
y microorganismo.

3. En medio sólido por picadura, se siembra con pincho en lugar de asa. Esto se hace por:

! a) Entubos y con medio sólido siempre se emplea el pincho, por su facilidad

de introducción.
I b) Minimizar en el medio la difusión de oxígeno del aire.
I c) Nada en particular. Se puede utilizar indistintamente el pincho y el asa.

4. La diferencia fundamental entre el uso de la siembra en placa por agotamiento en es-

tría y la siembra en placa por siembra en superficie:
n a/ El objetivo, la siembra en placa por agotamiento en estría se utiliza para
aislar microorganismos, y Ia siembra en placa en super{icie para recuentos.
I b) El uso del medio, la siembra en placa por agotamiento en estría utiliza
todo el medio, y la siembra en placa en superficie, como su nombre indica
sólo utiliza Ia superficie.
! c) La técnica de la siembra.

5. A la hora de realizar la descripción de las colonias de un cultivo, para determinar la

consistencia de las mismas, se debe utilizar:
I a) Asas y pinchos de siembra.
ll b) Asas de Driglaski y pipetas.
n c) Los dedos por su máxima sensibilidad.

SOLUCIONES:

l.EtEd 3.8Iiltr s'EEE

2.trllE 4.8tr8

C¡piiur-o 8