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Revista Mexicana de Fitopatología

ISSN: 0185-3309
mrlegarreta@prodigy.net.mx
Sociedad Mexicana de Fitopatología, AC
México

Hernández-Lauzardo, Ana Niurka; Bautista-Baños, Silvia; Velázquez-del Valle, Miguel Gerardo; Trejo-
Espino, José Luis
Identificación de Rhizopus stolonifer (Ehrenb .: Fr.) Vuill., Agente causal de la pudrición por Rhizopus de
Frutas y vegetales
Revista Mexicana de Fitopatología, vol. 24, núm. 1, enero-junio, 2006, págs.65-69
Sociedad Mexicana de Fitopatología, AC
Texcoco, México

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=61224110

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 Revista Mexicana de FITOPATOLOGIA/ sesenta y cinco

Identificacion de Rhizopus stolonifer (Ehrenb .: Fr.) Vuill., Causal

Agente de la enfermedad de la pudrición por Rhizopus de frutas y verduras

AnaNiurkaHernández-Lauzardo, Silvia Bautista-Baños, Miguel Gerardo Velázquezdel

Valle, y José Luis Trejo-Espino, Instituto PolitécnicoNacional, Centro de Desarrollo de
Productos Bióticos, km 8.5 Carr. Yautepec-Jojutla, San Isidro, Yautepec, Morelos,
México CP 62731. Correspondencia a: aniurka10@hotmail.com

(Recibido: 14 de septiembre de 2005 Aceptado: 26 de diciembre de 2005)

Hernández-Lauzardo, AN, Bautista-Baños, S., Velázquezdel
Valle, MG, y Trejo-Espino, JL 2006. Identificación de
Rhizopus stolonifer (Ehrenb .: Fr.) Vuill., Agente causal de la
pudrición por Rhizopus de frutas y verduras. Revista
Mexicana de Fitopatología 24: 65-69.
Abstracto. Rhizopus stolonifer comúnmente causa enfermedades
poscosecha en muchas frutas y verduras. Los objetivos de esta
investigación fueron evaluar la tasa de crecimiento y esporulación
de tres cepas deR. stolonifer en diferentes medios, para cuantificar
los esporangióforos, esporangios y esporangiosporas de tres cepas
mediante análisis de imágenes, determinando las frecuencias
relativas de las formas de las esporas y mediante microscopía
electrónica de barrido, para confirmar su forma y ornamentación.
Los resultados indicaron una mejor definición de micelios,
esporangios y esporangiosporas cuando los aislados se cultivaron
en agar papa-dextrosa (PDA). La tasa de crecimiento y la
esporulación fueron mayores en este medio de cultivo. Las
esporangiosporas eran principalmente globosas, siguiendo las
formas elipsoidales y angulares. Los valores de longitud, diámetro y
área de esporangióforos, esporangios y esporangiosporas variaron
entre los aislamientos. La ornamentación de las esporangiosporas
mostró crestas continuas a lo largo de la superficie de las esporas.
PDA fue el medio más adecuado para caracterizar aún másR.
stolonifer. Con base en la caracterización morfológica y
cuantitativa, los tres aislamientos correspondieron aR.
stolonifer.
Palabras clave adicionales: esporangióforos, esporangios,
esporangiosporas, análisis de imágenes, microscopía
electrónica de barrido.
Resumen. Rhizopus stolonifer ocasionalmente
enfermedades postcosecha enmuchas frutas y hortalizas.
Los objetivos de esta investigación fueron evaluar la tasa
de crecimiento y la esporulación de tres aislamientos deR.
stolonifer en diferentes medios, cuantificar los
esporangióforos, esporangios y esporangiosporas de los tres
aislamientos mediante análisis de imágenes, determinando la
frecuencia relativa de las formas de las esporas, ymediante
microscopía electrónica de barrido, confirmar su forma y
ornamentación. Los resultados muestran una mejor
definición del micelio, esporangios y esporangiosporas cuando
los aislamientos se cultivaron en papa-dextrosa-agar (PDA). La
velocidad de crecimiento y esporulación fuemayor en este
medio de cultivo. Las esporangiosporas fueron principalmente
globosas, seguidas de formas elipsoidales y angulares. Los
valores de longitud, diámetro y área de los esporangióforos,
esporangios y esporangiosporas variaron entre los
aislamientos. La ornamentación de las esporangiosporas
mostró estrías continuas a lo largo de la superficie de las
esporas. El PDA fue el mediomás adecuado para caracterizar aR
. stolonifer. Basándonos en lamorfología y en la caracterización
cuantitativa, los tres aislamientos correspondieron aRhizopus
stolonifer.
Palabras claves adicionales: Esporangióforos, esporangios,
esporangiosporas, análisis de imágenes, microscopía
electrónica de barrido.
Rhizopus stolonifer (Ehrenb .: Fr.) Vuill. es el agente causal
de la pudrición por rizopo de diversas frutas y verduras.R.
stolonifer comúnmente causa enfermedades poscosecha en
muchas frutas y verduras. Por lo general, causa una podredumbre
blanda y acuosa, y es un hongo de rápido crecimiento que se
desarrolla en una amplia gama de temperaturas y humedades
relativas (Nishijimaet al., 1990). Los hongos fitopatógenos se suelen
identificar teniendo en cuenta criterios morfológicos. Las
características más importantes para identificar morfológicamente
los hongos son las esporas (forma, tamaño y color) y cuerpos
fructíferos (Agrios, 2001), y en menor medida los micelios; por
tanto, es muy recomendable seguir claves de géneros para una
identificación precisa. IdentificarR. stolonifer, Farr et al. (1989)
recomiendan recurrir a la descripción genérica publicada por
Schipper (1984). Es importante identificar y cuantificar las posibles
fuentes de variabilidad deR. stolonifer. Por ejemplo, se sabe que el
estado de los nutrientes afecta el crecimiento de varios hongos.
Para llevar a cabo la caracterización morfológica, será importante la
selección del mejor medio, ya que los nutrientes que contienen el
medio pueden facilitar o no el desarrollo de estructuras como
esporangióforos, esporangios y esporangiosporas. ParaR. stolonifer
, se informa de diferentes sustratos de cultivo para evaluar in vitro
desarrollo. Schipper
66 / Volumen 24, Número 1, 2006
(1984) menciona malta-agar como el mejor medio de crecimiento,
mientras que en muchos otros estudios se utiliza patata-dextrosa-agar
como el más común, pero puede que no sea el mejor medio para cultivar
este hongo (Mari et al., 2002; Nishijimaet al., 1990; Northover y Zhou,
2002). Actualmente, el análisis de imágenes es un método cuantitativo
rápido que se usa comúnmente para analizar las características de las
imágenes y proporcionar datos más precisos y exactos. Por ejemplo, en
las enfermedades de las plantas, el análisis de imágenes también es un
método confiable para identificar hongos correspondientes al género
Penicillium, determina la biomasa fúngica, variaciones en la morfología
de los conidios después del quitosano, y caracteriza las diferencias
morfológicas en caldos de cultivo (Dorge et al., 2000; Hernández-López,
2002; Lucateroet al., 2004; Morgan et al., 1991). La microscopía
electrónica de barrido es otro método confiable para integrar la
identificación de hongos, lo que permite la observación de formas
distintas y la definición ornamental de la superficie de las esporas
(Schipper, 1984). Los objetivos de esta investigación fueron evaluar la
tasa de crecimiento y esporulación de tres cepas deR. stolonifer en
diferentes medios; cuantificar esporangióforos, esporangiosporas y
esporangios de las tres cepas mediante análisis de imágenes,
determinando las frecuencias relativas de las diversas formas deR.
stolonifer esporas, y para confirmar la forma y ornamentación mediante
microscopía electrónica de barrido.
Microorganismos y condiciones de cultivo. Tres aislamientos de
R. stolonifer se obtuvieron de tomates infectados naturalmente (
Lycopersicon esculentum Mill.) Cosechado en tres regiones
diferentes del estado de Morelos, México: Cuautla (R1), Oaxtepec
(R2) y Yautepec (R3). La fruta infectada se colocó en cámaras
húmedas a 25 ° C hasta que aparecieron los síntomas (California.
cuatro días). Se colocaron porciones del tejido infectado en placas
de Petri que contenían PDA y se volvieron a inocular en tomate.
A B
D mi
Fig. 1. Crecimiento de Rhizopus stolonifer en diferentes medios, a las 24 h: A) patata-dextrosa-agar (PDA),
B) malta-agar (MA), C) Czapeck (CZ), y después de 48 h: D) PDA, E) MA, F) CZ.
fruto para obtener cultivos puros. Para obtener cultivos
monospóricos, se prepararon diluciones en serie a partir de cultivos
puros y se recogieron y cultivaron esporas individuales en PDA.
Evaluaciones morfológicas y de crecimiento. Se colocó una pequeña
porción (0,5 cm de diámetro) de cada cultivo puro en el centro de las
placas de Petri que contenían PDA, malta-agar (MA) o medio Czapeck
(CZ). Para la caracterización morfológica, la descripción del micelio se
llevó a cabo teniendo en cuenta las características particulares del
micelio y los rizoides (Schipper, 1984). Para determinar la tasa de
crecimiento de cada aislamiento, se midió el crecimiento micelial cada 6
h durante un período de incubación de 96 ho cuando el micelio alcanzó
el borde de la placa de Petri. La esporulación se evaluó a las 48 y 72 h.
Las suspensiones de esporas se prepararon inundando las colonias con
agua destilada, agitando con una varilla de vidrio estéril y filtrando a
través de lana de vidrio. El recuento de esporas se realizó utilizando un
hemocitómetro de Neaubauer y un microscopio (Nikon, Alphaphot-2YS2)
a 40 aumentos. El experimento se repitió tres veces utilizando cinco
placas de Petri como unidad experimental. Los tratamientos se
organizaron en un diseño completamente aleatorio.
Estudios microscópicos. Se midieron los esporangióforos, esporangios
y esporangiosporas de cada aislamiento después de la incubación en
PDA durante 48 h. Las imágenes de esporangióforos y esporangios se
obtuvieron utilizando un estereoscópico (Nikon, SMZ1500) y las
imágenes de esporangiosporas utilizando un microscopio (Nikon,
Alphaphot-2YS2) con una cámara de video cargada (DL 330 DAGE-MTI).
Los aumentos de las imágenes fueron 4X, 8X y 10X para
esporangióforos, esporangios y esporangiosporas, respectivamente. Las
imágenes se analizaron utilizando el software de la serie Meta Imaging
(versión 4.0 para Microsoft Windows, Universal Imaging Corporation). La
longitud (ìm)
C
F
 Revista Mexicana de FITOPATOLOGIA/ 67

Tabla 1. Tasa de crecimiento de tres aislamientos de Rhizopus stolonifer serie durante cinco minutos cada una, secada con CO (SAMDRI-780B
2
cultivados en medios de papa-dextrosa-agar (PDA), malta-agar (MA) Tousimis) y recubierta por pulverización catódica con oro paladio en un
y Czapeck (CZ) durante un período de incubación de 96 ha 25 ° C. recubrimiento pulverizado Nanotech (BAL-TECSDC050). Las muestras se
mantuvieron en un desecador hasta su examen con un electrón de
Tasa de crecimiento (mm / h)z barrido utilizando un microscopio Karl Zeiss DSM 940 operado a 30 kV.
Aisla PDA MAMÁ CZ Se tomaron micrografías en una película Polaroid tipo 52 (Polaroid Corp.).
R1 2,29 a 1,84 b 1,93 c
R2 2,32 una 1,96 b 1,94 b Datos y análisis estadístico. Los tratamientos se organizaron en un
R3 2,17 una 1,87 b 1,92 b diseño completamente aleatorio. Los datos se analizaron mediante
z Letras diferentes entre filas indican diferencias significativas ANOVA (Sigma Stat versión 2.0). La separación media por Kruskal-Wallis
(Tukey, p> 0,05). se llevó a cabo para la esporulación y la separación media por la prueba
de rango múltiple de Tukeys (P <0,05) para la tasa de crecimiento. Las
de esporangióforos, diámetro (ìm) y factor de forma elíptica (EFF) medias y las desviaciones estándar se realizaron a partir de los datos de
de esporangios, y área (ìm)2), la longitud y la EFF de las esporangióforos, esporangios y esporangiosporas. Frecuencias relativas
esporangiosporas se midieron en 90 o 300 observaciones por entre las formas observadas de esporangiosporas de cada uno de los
aislamiento. Los rangos de EFF se dieron de la siguiente manera: tres aislados de
globoso (0,5-1,15), elipsoidal (1,16-1,30) y angular (> 1,31). Rhizopus también se calcularon.
Microscopía electrónica de barrido. Las esporangiosporas de un período de Los tres aislamientos mostraron un desarrollo de micelio
incubación de 72 h cultivadas en PDA se fijaron con glutaraldehído al 6% ramificado bien definido en PDA después de 24 h (Fig. 1A). Aunque
durante 24 h a temperatura ambiente, se enjuagaron tres veces con tampones menos ramificado, se observó un crecimiento casi similar cuando se
de fosfato 0.02M, se fijaron con tetraóxido de osmio al 2% durante 2 ha 20 ° C, cultivó en MA (Fig. 1B). En CZ, el crecimiento de micelio fue escaso
se deshidrataron en un etanol (Fig. 1C). A las 48 h, se acentuó abundante micelio algodonoso y
aéreo en los tres cultivos cultivados en PDA, mostrando las
características distintivas del géneroRhizopus tales como la
50 formación de esporangióforos y esporangios (Fig. 1D), y las
A R1 R2 R3 B B B
45 características de la stolonifer especie como la formación de
40 rizoides complejos, bien definidos (imagen no mostrada). Cuando
35 se incuba en MA,R. stolonifer el crecimiento fue menos definido con
Esporas / mL

30 la formación ocasional de esporangióforos y esporangios (Fig. 1E).

25 Después de 72 h en este medio, hubo abundante producción de
20 cuerpos fructíferos (datos no mostrados). Las cepas cultivadas en
15 CZ no mostraron cuerpos fructíferos en ningún momento de
10 incubación (Fig. 1F). La tasa de crecimiento más alta deR.
5 a a a a a a stolonifer durante el período de incubación de cuatro días se mostró en
x 1000 0
PDA en los tres aislamientos probados (R1 = 2.2, R2 = 2.3 y R3 = 2.1 mm h
CZ EMA PDA
-1 , Tabla 1). La esporulación fue notablemente más alta usando PDA
Medios culturales
como medio de cultivo para los tres aislamientos probados.

700 C
B R1 R2 R3
600 C
C 50
R1 R2 R3
500 45
Esporas / mL

40
Frecuencia relativa (%)

400
35
300 30
200 25
B B B 20
100
a a a 15
x 1000 0 10
CZ EMA PDA 5
Medios culturales 0
Angular Elipsoidal Globoso
Fig. 2. Esporulación de tres aislamientos de Rhizopus stolonifer
(R1, R2, R3) incubados en Czapeck (CZ), papa-dextrosagar Forma
(PDA) y malta-agar (MA) durante 48 h (A) y 72 h (B). Letras Fig. 3. Ocurrencia de forma de esporangiosporas de tres
diferentes indican diferencias significativas entre medios aislamientos de Rhizopus stolonifer (R1, R2, R3) cultivados en agar
(Kruskal-Wallis, p = 0.05). papadextrosa durante 48 h (n = 100).
68 / Volumen 24, Número 1, 2006

Tabla 2. Observaciones cuantitativas por análisis de imágenes de esporangióforos, esporangios y esporangiosporas de tres
aislamientos de Rhizopus stolonifer cultivado en agar patata-dextrosa durante 48 h.

Esporangióforosy Esporangiosy Esporangiosporasz

Aisla Diámetro de la longitud EFF Longitud del área

(yo) (yo) (adimensional) (soy2) (soy)
R1 2173,3 ± 277 364,0 ± 85 1,0 ± 0,06 110,9 ± 29 13,9 ± 1,9
R2 2230,1 ± 362 327,4 ± 77 1,1 ± 0,07 117,4 ± 28 14,4 ± 2,0
R3 2317,4 ± 418 332,1 ± 74 1,0 ± 0,06 98,9 ± 26 13,2 ± 1,8
Medias y desviaciones estándar de 90y y 300z observaciones.

(R1 = 6,7 x 105, R2 = 5 x 105y R3 = 5,5 x 105 esporas / mL) después de
un período de incubación de 72 h (Fig.2). No se observó
esporulación en CZ para los tres aislamientos después de 48 o 72.
La ocurrencia relativa de forma de esporangiospora (EFF) fue
principalmente globosa (R1 = 47, R2 = 47 y R3 = 45%) seguida por el
elipsoidal (R1 = 38, R2 = 35 y R3 = 39%) y formas angulares (R1 = 15,
R2 = 18 y R3 = 16%) (Fig.3). Las observaciones cuantitativas
realizadas por análisis de imágenes mostraron diferencias entre los
tres aislamientos (Tabla 2). La longitud de los esporangióforos
osciló entre 2173,3 y 2317,4 µm. El diámetro de los esporangios
varió de 327,4 a 364,0 µm. EFF (California. 1.0) indica que los
esporangios estaban más cerca de la forma circular. El área de
esporangiosporas varió entre 98.9 a 117.4 ì m2, mientras que su
longitud osciló entre 13,2 y 14,4 ìm. Las imágenes representativas
de la microscopía electrónica de barrido confirmaron las diversas
formas (globosa, elipsoidal y angular) ya obtenidas por el análisis
cuantitativo de la
tres aislados. Ornamentaciones de superficie deR. stolonifer eran
crestas continuas y distintas a lo largo de la espora (Fig. 4). Los
resultados de la caracterización morfológica y cuantitativa de este
estudio, corroboran queR. stolonifer fue el organismo evaluado.
Schipper (1984) menciona como rasgo distintivo de este hongo el
aéreo y algomicelio. En PDA, los tres aislamientos tuvieron mayor
tasa de crecimiento, una adecuada esporulación y la formación de
estructuras particulares deR. stolonifer luego de 48 h de
incubación, representando entonces el medio más adecuado para
evaluar otras características descriptivas de esta especie como la
formación de rizoides complejos y bien desarrollados (Romero-
Cova, 1988). Sin embargo, nuestros resultados sobre el medio MA
difieren del informe anterior de Schipper (1984), quien indicó que el
MA era el mejor medio de cultivo para caracterizar las
características morfológicas deR. stolonifer. En este estudio, el PDA
superó a los otros dos medios de cultivo probados con la
posibilidad de realizar mediciones de estructuras relevantes.

A B

C D

Fig. 4. Microscopía electrónica de barrido de esporangiosporas de Rhizopus stolonifer cultivado

en agar papadextrosa. 30 KV 2000X (A y B), 5000X (C) y 10000X (D).
 Revista Mexicana de FITOPATOLOGIA/ 69
en menos de 48 h. Los valores de esporangióforos y esporangios
informados en esta caracterización ocurrieron dentro de los rangos
ya informados por Schipper (1984). A nuestro leal saber y entender,
este es el primer informe sobre mediciones deR.
stolonifer esporangiosporas como área, longitud y EFF junto con la
proporción relativa (%) de cada forma distintiva (globosa, elipsoidal
y angular). Pensamos que en futuros estudios, principalmente los
relacionados con el control deR. stolonifer, podría ser importante
incluir estas evaluaciones para cuantificar posibles cambios en las
proporciones relativas de esporangiosporas por efecto de cualquier
tipo de tratamiento. Con la ayuda de la microscopía electrónica de
barrido, confirmamos las formas de las esporas y la ornamentación
de la superficie deR. stolonifer mencionado por Schipper (1984).
Agradecimientos. Este trabajo fue apoyado por el Instituto
Politécnico Nacional, México, a través de la beca CGPI:
20040452.
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