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FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
Noviembre de 2008
EFECTO DEL GEN fadH1 EN LA PRODUCCION DE PHA CONTENIENDO
MONOMEROS INSATURADOS POR Pseudomonas putida
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar al título de
MICROBIOLOGO INDUSTRIAL
FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
Noviembre de 2008
NOTA DE ADVERTENCIA
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en
sus trabajos de tesis. Solo velará por qué no se publique nada contrario al dogma y a la
moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona
alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
Biólogo , Ph.D.
Director
Dr. Rafael Costa Santos Rocha Dra Sonia Regina Silva Queiroz
Jurado Jurado
EFECTO DEL GEN fadH1 EN LA PRODUCCION DE PHA CONTENIENDO
MONOMEROS INSATURADOS POR Pseudomonas putida
APROBADO
A mi mamá sencillamente por todo. Sin ella nada de esto hubiera sido posible
A la Dra. Sonia Regina Silva Queiroz por todas sus enseñanzas, consejos y
orientaciones durante este trabajo
A la profesora Dra. Luiziana Ferreira da Silva por haberme permitido usar las
instalaciones de su laboratorio para desarrollar parte de este trabajo.
A todas las personas que de una u otra manera hicieron parte colaborando con este
trabajo
vii
TABLA DE CONTENIDO
viii
5.3. Condiciones de cultivo ................................................................................................ 40
5.4 Manipulación de ADN ................................................................................................. 41
5.4.1 Extracción de ADN plasmídico ............................................................................. 41
5.4.2 Digestión de ADN con enzimas de restricción...................................................... 42
5.4.3 Ligación de ADN .................................................................................................. 42
5.4.4 Preparación de células competentes ...................................................................... 42
5.4.5 Transformación Bacteriana ................................................................................... 42
5.4.6 Electroforesis en gel de agarosa ............................................................................ 43
5.4.7 Purificacion de ADN a partir del gel de agarosa ................................................... 43
5.5 Construcción del plásmido por inserción del fragmento purificado a partir del gel de
agarosa................................................................................................................................ 43
5.6 Complementación......................................................................................................... 43
5.7 Ensayos de acumulación de polímero a partir de ácido linoléico................................. 44
5.7.1 Determinación de Masa seca celular (MSC) ......................................................... 44
5.7.2 pH .......................................................................................................................... 45
5.7.3 Cantidad y composición de PHA .......................................................................... 45
6. RESULTADOS Y DISCUSION ............................................................................47
6.1 Evaluación en la producción de PHA por mutantes deficientes en la utilización de
ácidos grasos insaturados ................................................................................................... 47
6.2 Clonación del gen fadH1 en pBBR1MCS-5 ................................................................ 48
6.3 Complementación de Pseudomonas putida IPT 046 y los mutantes deficientes en
crecimiento en ácido 4-pentenoico con el gen fadH1. ....................................................... 53
7. CONCLUSIONES ..................................................................................................60
8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................61
9. ANEXOS ................................................................................................................70
ix
LISTA DE TABLAS
Tabla 8. Perfil de crecimiento de IPT 046 y los mutantes frente a las cepas
complementadas con pBBR::fadH1 en MMGGm, MMV y MM4P 52
x
LISTA DE FIGURAS
xi
Figura 17. Evaluación de crecimiento de los mutantes complementados en
MM4PGm 56
Figura 18. Evaluación de crecimiento entre IPT 046::pBBR1MCS-5::fadH1 y
mutantes complementados. 57
Figura 19. Evaluación de crecimiento entre IPT 046::pBBR1MCS-5::fadH1 y
mutantes complementados 58
xii
LISTA DE ABREVIATURAS
µL microlitro
3HD 3- Hidroxidecanoato
3HDd 3-Hidroxidodecanoato
3HHx 3-Hidroxihexanoato
3HO 3-Hidroxioctanoato
CoA Coenzima A
IPTG (isopropil-tio-β-D-galactósido)
Gm Gentamicina
Kb Kilopares de bases
kDa kilodalton
LB Luria-Bertani
mM milimolar
Min minutos
mL mililitro
xiii
MM medio mineral
P3HV Poli-3-Hidroxivalerato
P3HB-co-3HV Poli-3-Hidroxibutirato-co-hidroxivalerato
PHA Polihidroxialcanoatos
PHPE Polihidroxipentanoato
PP polipropileno
X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido)
xiv
RESUMEN
plásmido pBBR1MCS-5 fue posible complementar a los mutantes con este gen el
sido complementados con el gen fadH1. Los mutantes que presentaron mayor
fadH1
xv
1. INTRODUCCION
Los plásticos de origen petroquímico son ampliamente utilizados debido a su fácil
moldeamiento y alta resistencia química, pero son un problema ambiental, debido a
su alto peso y conformación molecular, la acción de los microorganismos en los
procesos degradadores es mínima, por lo cual permanecen en el ambiente durante
amplios periodos de tiempo.
Los PHA poseen una amplia gama de propiedades que permiten su aplicación en
diversas áreas. Son termoplásticos, insolubles en agua, no tóxicos, biocompatibles y
biodegradables. Estos poliésteres son una alternativa ecológica a los plásticos
derivados del petróleo.
16
La posibilidad de usar diferentes sustratos renovables para la producción de PHA
hace más atractivo el proceso, ya que dentro de las grandes posibilidades se
encuentran el uso de carbohidratos, pasando por alcoholes, hasta aceites vegetales,
los cuales están constituidos por triglicéridos y radicales con cadenas de ácidos
grasos saturados e insaturados.
Para la producción sostenible de PHAMCL se buscan sustratos que cumplan con las
condiciones para la obtención del polímero, por lo cual, entre las mejores opciones,
está el uso de ácidos grasos derivados a partir de aceites vegetales, debido a que son
de bajo costo, son renovables y además, su constitución presenta insaturaciones, las
cuales sirven como precursores de monómeros insaturados para la incorporación al
polímero, modificando sus propiedades químicas y así proporcionarle características
propias que amplían su aplicación industrial. Además de eso, las insaturaciones
sirven como blanco para modificaciones químicas posteriores.
17
2. REVISION BIBLIOGRÁFICA
2.1. Biopolímeros
Una amplia variedad de polímeros son sintetizados a partir de materia viva,
productos agrícolas y de procesos biotecnológicos Dependiendo de su estructura
química, estos polímeros se clasifican en: ácidos nucléicos, poliamidas,
polisacáridos, poliésteres, politioésteres, polianhídridos, poli-isoprenoides y
polifenoles (STEINBÜCHEL, 2001).
18
compuestos recalcitrantes que quedarán en el ambiente durante largos
periodos de tiempo (KHANNA & SIVRASTAVA, 2004).
2.2 Polihidroxialcanoatos
Los Polihidroxialcanoatos (PHA) son una familia de poliésteres compuestos
principalmente de ácidos R-3 hidroxialcanoicos acumulados en forma de gránulos
intracelulares, que pueden representar hasta el 80% de la masa seca celular (Fig. 1),
los cuales sirven como fuente de carbono, energía y equivalentes reductores.
(MADISON & HUISMAN, 1999) Son producidos bajo condiciones desbalanceadas
de cultivo, es decir, con exceso en la fuente de carbono y limitación en los elementos
esenciales (N, S, O, P, Mg) (ANDERSON & DAWES, 1990).
1µm
Figura 1. Microfotografía electrónica de P. putida con gránulos de PHA (Luengo et al. 2003)
19
el proceso de enquistamiento (Azotobacter sp.) y de esporulación (Bacillus sp.), para
la protección de complejo nitrogenasa en las bacterias fijadoras de nitrógeno, ya que
el PHA actúa como compuesto oxidable y también es constituyente de la membrana
citoplasmática de bacterias (ALMEIDA et al., 2004; ANDERSON & DAWES,
1990, FILIPOV, 2000).
Los PHA pueden ser clasificados en dos grandes grupos: (i) de cadena corta (HASCL-
“HydroxyAcids of Short-Chain-Length”), teniendo de 3 a 5 átomos de carbono en la
cadena principal, y (ii) de cadena media (HAMCL-“HydroxyAcids of Medium-Chain-
Length”) teniendo de 6 a 16 átomos de carbono en la cadena principal
(STEINBÜCHEL & VALENTIN, 1995).
20
La empresa estadounidense Procter & Gamble desarrolló y comercializó en 2004, un
copolímero de P3HB y 3HA con radicales laterales con más de 3 carbonos utilizando
microorganismos genéticamente modificados (NODA et al. 2004).
21
DSM, Holanda Desconocido Desconocido 2006-Presente
Beijing TianZhu Biomaterials, China PHBHHx PHA como Bio- 2003 - presente
Implantes
Jiangsu Nan Tian Group, China PHB Escala piloto 1990s - presente
22
Figura 2 Estructura General de los Polihidroxialcanoatos (LEE, 1996)
La masa molecular de los PHA es del orden de 50kDa hasta 100kDa, esto depende
de la naturaleza del polímero (MADISON & HUISMAN, 1999). Intracelularmente,
el P3HB, existe en unos estados líquidos y amorfos, mientras que, después de su
extracción mediante el uso de solventes orgánicos, éste pasa a un estado cristalino,
confiriéndole características rígidas, pero a su vez quebradizo. Su punto de fusión es
relativamente alto (180° C), pero cerca del punto de degradación térmica (200° C)
(KIM & LENZ, 2001).
23
PHAMCL tienen un alongamiento para ruptura mayor que 100%, mientras que los
PHASCL poseen un alongamiento para ruptura menor que 5%; la incorporación de
unidades de 3HV al P3HB permite aumentar la maleabilidad y resistencia,
alcanzándose valores de alongamiento para ruptura cerca de 50% (SUDESH et al.,
2000).
Tabla 2 Propiedades físicas de PHA y PP. Modificado de REHM, 2007. Tg(Temperatura de transición
vítrea) Tm( Temperatura de cristalización)
2.2.3. Aplicaciones
El mercado de los PHA se puede clasificar en dos grandes grupos: (i) Envases
desechables biodegradables, con un mayor volumen de demanda, debido a que son
producidos bajo formas predeterminadas, pero en donde los productos petroquímicos
tienen ventaja debido a su excelente procesabilidad y bajo costo de producción. En
este grupo, el objetivo fundamental es crear un mercado “ecológico” donde su
biodegradabilidad le confiera un valor agregado al producto terminado, ya que según
Nonato y colaboradores (2001), el PHB puede ser vendido a US$5.83 por Kilo,
siendo mucho más barato que el polímero producido por Biomol® cuyos precios
24
oscilan entre US$10-20 por kilo, dependiendo de la naturaleza de este. Algunos
productos comerciales fabricados a partir de PHA son botellas, recipientes para
cosméticos, bolígrafos, palos de golf, entre otros. (ii) Área farmacéutica, ya que
desde 1990, los PHA están siendo estudiados como posibles microencapsulados para
liberación controlada de medicamentos. Algunas sustancias de origen natural como
el colágeno ya fueron utilizadas para tratamiento de tejidos cardiacos afectados, pero
se observó una baja eficiencia en la reparación debido a que durante el
procedimiento quirúrgico, las partículas pueden migrar de lugar del implante antes
del crecimiento del nuevo tejido (GALEGO et al., 2000). En el campo de la
oncología, los PHA también están siendo evaluados en diferentes tratamientos, como
por ejemplo, el P3HB y el PHPE son utilizados como microesferas portadores de
NzPC, un colorante fotosensibilizador el cual es usado en terapia fotodinámica. (RÉ
et al., 2005). Diversas pruebas han sido realizadas y han mostrado que el P3HB es
biocompatible, debido a que R-3-Hidroxibutirato es un constituyente normal de la
sangre en concentraciones entre 0.3 y 1.3 mM, así mismo, estudios demuestran que
no existe alteración en los parámetros funcionales, bioquímicos y fisiológicos en los
pacientes, además de presentar propiedades mecánicas iguales o mejores que los
termoplásticos convencionales. Los PHAMCL, gracias a sus características
elastioméricas, poseen aplicaciones potenciales como precursores de moléculas con
propiedades anti-reumáticas, analgésicas, radiopotenciadores, anti-tumorales, además
en biopelículas médicas y dispositivos especiales como soporte de fármacos, nuevos
tipos de suturas, soporte regenerativo de tejidos vasculares, etc. (POUTON &
AKHTAR. 1996; ZINN et al. 2001; SANCHEZ et al. 2003; SHISHATSKAYA et al.
2001; LUENGO et al. 2003).
25
oleovorans y Pseudomonas aeruginosa. (STEINBÜCHEL, 1996; STEINBÜCHEL
& LÜTKE-EVERSLOH, 2003).
Figura 3. Síntesis de PHB. (1) β-Cetotiolasa (2) acetoacil CoA reductasa (3)PHB polimerasa
Uno de los factores clave en la síntesis de PHAMCL es la enzima pha sintasa del
grupo II, producida por Pseudomonas, la cual es diferente a la pha sintasa producida
por C. necator en cuanto a la afinidad que tiene por sustratos que poseen de 6 a 16
átomos de carbono (AMARA & REHM, 2003).
26
Distintas vías metabólicas han sido propuestas para la biosíntesis de PHAMCL a partir
de diferentes tipos de sustrato (Figura 4).
El metabolismo de los ácidos grasos (β-oxidación) es una de las vías más comunes
para producir PHA de cadena media. La composición de estos polímeros está
directamente relacionada con la estructura de la fuente de carbono. Cuando el
sustrato posee de 6 a 12 átomos de carbono, los monómeros de PHA poseen la
27
misma longitud, o tienen 2, 4 o 6 carbonos menos. Cuando se suministran ácidos
grasos de 13 a 18 carbonos, la composición del PHA no es relacionada con la
longitud del sustrato, debido a que el monómero más largo que es incorporado
posee 12 o 14 carbonos, aunque en su estructura puede presentar insaturaciones
(ÁVILA-LEÓN, 2007). Aun no está claro si una epimerasa, 3-cetoacil reductasa o
enoil-CoA hidratasa (Figura 5) es la encargada de realizar el transporte de
intermediarios de la β-oxidación para la síntesis de PHAMCL (GOMEZ, 2000).
28
543nm han sido utilizados para distinguir colonias acumuladores de PHA de las
colonias que no acumulan el polímero. (SPIEKERMAN et al. 1999).
29
Figura 6. Hidrolisis de Triglicéridos (http://www2.ufp.pt/~pedros/bq/fatty.htm)
En el modelo propuesto para E. coli por DiRUSSO y colaboradores (1999) los ácidos
grasos entran a la célula mediante un mecanismo de translocación que involucra a
dos enzimas: FadL, que sirve como receptor de los ácidos grasos y ayuda a su paso a
través de la membrana externa; y fadD (Acil-CoA Sintetasa), proteína encargada de
la activación del ácido graso internalizado. La oxidación de esta molécula activada se
da mediante la acción de las proteínas fadF y fadG (Acil-CoA deshidrogenasa), las
cuales tienen afinidad por sustratos de cadena media-larga y cadena corta
respectivamente. El producto generado es un enoil-CoA (Acil-CoA con insaturación
en la posición 2). El producto del gen fadE es una flavoproteína encargada del
transporte de electrones necesarios en la acción de las Acil-CoA deshidrogenasas.
30
Figura 7. Modelo de β-Oxidación de Ácidos Grasos Modificado de DiRusso, 1999
Las enzimas que continúan con el proceso oxidativo de los ácidos grasos están
agrupados en un complejo multienzimático conocido como el operón fadBA, en el
cual son producidas las siguientes enzimas: 2-enoil-CoA hidratasa, 3-hidroxiacil-
CoA deshidrogenasa, 3-oxoacil-CoA tiolasa, 3-hidroxiacil-CoA epimerasa y 3-cis-
2-trans-enoil-CoA isomerasa. Este complejo está compuesto por una subunidad alfa
31
de 78 kDa y una subunidad beta de 42 kDa. (PRAMANIK et al., 1979; KUNAU et
al. 1995).
32
2.6. Pseudomonas spp.
Pseudomonas spp., es un género de bacterias aeróbicas, Gram-negativas,
quimioheterótrofas, móviles y de forma bacilar (MERCADO-BLANCO, 2007)
adaptadas a un gran variedad de ambientes debido a sus simples requerimientos
nutricionales y por la misma razón ampliamente distribuido en el suelo formando
asociaciones con plantas. Crecen a pH casi neutro y en temperaturas mesofílicas,
hasta 43° C. Se ha reportado que muchas especies de Pseudomonas crecen
eficientemente en medios químicamente definidos conteniendo diferentes
compuestos alifáticos (carbohidratos, ácidos grasos, ácidos dicarboxílicos y
tricarboxílicos, alcoholes) y aromáticos como fuente de carbono (MARTÍNEZ-
BLANCO et al., 1990; MIÑAMBRES et al., 1996).
33
Clasificación científica de Pseudomonas sp (BERGEY, 2005).
Dominio: Eubacteria
Phylum: Proteobacteria
Clase: Gamma Proteobacteria
Orden: Pseudomonadales
Familia: Pseudomonadaceae
Género: Pseudomonas
Las Pseudomonas poseen una amplia variedad de enzimas lipolíticas, las cuales son
de vital importancia para su metabolismo. P. fluorescens y P. aeruginosa presentan
enzimas hidrolíticas de tipo éster enantioselectivas, las cuales las hacen participes de
los procesos de biotransformación y esterificación.
34
3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION
Tomando en cuenta esto, los biopolímeros, en especial los PHA aparecen como una
de las opciones más viables, debido a su alta tasa de biodegradabilidad y a su
generación a partir de sustancias naturales, productos de la agricultura, en general, de
productos renovables.
35
El uso de sustratos baratos y de fácil adquisición como los aceites de origen vegetal,
los cuales confieren monómeros de diferentes conformaciones, como insaturaciones
y radicales acilos que poseen mayor numero de átomos de carbono, que pueden ser
incorporados a la estructura de los PHA para así, proporcionarles nuevas
características y así permitir que las insaturaciones puedan ser blanco para nuevas
modificaciones.
36
4. OBJETIVOS
37
5. MATERIALES Y MÉTODOS
Microorganismos Caracteristicas
Escherichia coli XL1-Blue PHA-, Lac-, Gms, Kans
Escherichia. coli S17-1 PHA-, F- 80dlacZ M15 (lacZYA-argF) U169 recA1 endA1hsdR17(rk-,
mk+) phoAsupE44 -thi-1 gyrA96 relA1 (SIMON et al., 1983)
Pseudomonas putida IPT 046 Glu+, PHA+, Lin+, Val+, 4Pen+, Gms, Kans (GOMEZ, 1996)
Pseudomonas putida AG46,AK1, Pseudomonas putida IPT 046, mutantes obtenidos con el plásmido
BG45, BJ5, CF12, CN25, DG45, pUTKm2 conteniendo transposon mini-Tn5 Glu+, PHA+, Lin+, Val+,
DM26, DR52, DW4, DX38 4Pen+, Gms, Kanr (SILVA-QUEIROZ, 2007)
Pseudomonas putida AM1, CM29, Pseudomonas putida IPT 046, mutantes obtenidos con el plásmido
CM51, CR4, DU54, EB50 pUTKm2 conteniendo transposon mini-Tn5 Glu+, PHA+, Lin+, Val+, 4Pen-
, Gms, Kanr (SILVA-QUEIROZ, 2007)
Plásmido Características
pGEM:fadH1 pGEM conteniendo el gen fadH1 (SILVA-QUEIROZ, 2007)
pBBR1MCS-5 Gmr lac POZ, MCS, Mob (KOVACH et al. 1995)
38
5.3.1Medio LB (Luria-Bertani)
(SAMBROOK et al., 1989)
Las siguientes denominaciones fueron dadas a los diferentes medios minerales con
diferentes fuentes de carbono:
39
MMGGm: Medio mineral con glucosa (1g/L) y gentamicina (15µL/mL)
MM4P: Medio mineral con ácido 4-pentenóico (1g/L)
MM4PGm: Medio mineral con con ácido 4-pentenóico (1g/L) y gentamicina
(15µL/mL)
MMV: Medio mineral con ácido valérico (1g/L)
MML: Medio Mineral con ácido linoléico (2,5g/L)
MMLGm: Medio Mineral con ácido linoléico (2,5g/L) y gentamicina
(15µL/mL)
40
5.4 Manipulación de ADN
También fue utilizado el método BIRBOIM & DOLY (1979), modificado. E. coli
cargando el plásmido de interés fue cultivada “overnight” en 25mL de LB con el
antibiótico al cual es resistente. El cultivo celular fue centrifugado en alícuotas de
1,5mL por 5 minutos a 13000 rpm. El sobrenadante fue descartado y las células
fueron resuspendidas en 100µL de solución GETL [Lisozima 4mg/mL; Glucosa
50mM; EDTA de calcio y sodio (etileno diamino tetracetato) 10mM; Tris/HCL
(hidrocloruro de hidroximetil aminometa) 25mM; pH 8,0] enfriado previamente,
agitadas vigorosamente e incubadas en baño de hielo durante 5 minutos. Se
adicionaron 200µL de SDS en NaOH 0,2M, se mezcló por inversión y se incubó
durante 5 minutos en baño de hielo. Para la precipitación de ADN cromosómico y
proteínas, se adicionaron 150µL de solución de acetato de potasio (Acetato de
potasio 60mL; Ácido acético 11.5mL; H2O 8.5mL) enfriado previamente y
nuevamente incubada durante 5 minutos en baño de hielo. Después de esto, la
solución fue centrifugada durante 10 minutos, 6000rpm, 4° C. El sobrenadante,
conteniendo el ADN plasmidial fue transferido para un nuevo tubo, donde se realizó
la extracción con fenol/cloroformo (250µL de fenol y 250µL de cloroformo), luego
se centrifugó durante 10 minutos, 13000rpm, 4° C. En seguida fue hecha la
precipitación con etanol absoluto (750µL), se incubó durante 15-30 minutos en baño
de hielo para luego centrifugar durante 20 minutos, 13000rpm, 4° C. Posteriormente
se realizó un lavado con etanol 70% para luego centrifugar durante 10 minutos,
13000 rpm, 4° C y el “pellet” fue secado en incubadora a 65° C hasta que todo el
41
etanol remanente se evaporara. El “pellet” fue resuspendido en 30µL de solución TE
(Tris 10Mm, EDTA 1Mm, pH 7.5) para luego ser almacenado a -20° C.
42
cloro-3-indolil-β-D-galactósido) fueron adicionados para diferenciar los clones
recombinantes conteniendo el fragmento de interés.
5.5 Construcción del plásmido por inserción del fragmento purificado a partir
del gel de agarosa
El plásmido pBBR1MCS-5 fue digerido con la enzima de restricción ApaI y ligado
al fragmento fadH1 purificado utilizando la enzima de ligación T4 DNA ligasa
(Fermentas Inc.). El plásmido fue transferido por transformación para E. coli S17-1
y XL1-Blue
5.6 Complementación
E.coli S17-1::pBBR1MCS-5::fadH1 fue sembrada en LBGm mientras que P. putida
IPT046 y los mutantes mini-Tn5, fueron sembradas en LB. Colonias aisladas fueron
inoculadas en 25mL de medio LBGm para el caso de E. coli y en 25mL de medio
LB para el caso de Pseudomonas. Después de 24 horas de cultivo a 37° C, 150rpm
las células (25mL) fueron centrifugadas durante 10 minutos, 5000 rpm. Cada uno de
los “pellets” obtenidos fueron resuspendidos en 10mL de solución salina (SS) y
43
centrifugados de nuevo durante 10 minutos, 5000 rpm. Estos “pellets” fueron
nuevamente resuspendidos en 1mL de SS. Fueron sembrados 100µL de E.coli S17-1
en agar MMGGm y homogenizados utilizando espátula de Drigalski. Una vez seca
esta capa, fueron sembrados 100µL de suspensión celular de P. putida IPT046 y los
mutantes en cada una de las cajas e incubadas a 30° C durante 24 horas.
Las colonias crecidas fueron repicadas en una nueva caja con MMGGm e incubadas
durante 24 horas, 30° C. Después de este periodo, las colonias aisladas fueron
sembradas en MMGGm, MM4P, MM4PGm y MMV para evaluar el crecimiento.
44
MMC= masa de la membrana y células después del secado
5.7.2 pH
El pH fue determinado a partir del sobrenadante obtenido de la centrifugación, en un
potenciómetro (Mettler modelo Delta 350) utlizando patrones de pH de 4,0; 7,0 y 9,0
(Ingold – Mettler Toledo Int. Inc.).
45
se usó el mismo factor de respuesta del componente saturado con 12 carbonos, es
decir, el 3HDd.
46
6. RESULTADOS Y DISCUSION
Tabla 6. Composición monomérica de PHA acumulados por P. putida IPT 046, AG46, BJ5, CF12, CN25 Y
DU54, cultivadas en ácido linoléico*
IPT 046 0,77 6.72 12,73 31.06 32,75 2,95 20,49 26.11
AG46 0,72 6,70 10,36 30,10 32,75 4,93 21,86 24,21
BJ5 0,87 6,98 8,67 25,78 33,57 4,35 27,6 25,43
CF12 0,83 6,87 10,62 27,59 34,95 3,38 23,42 30,74
CN25 0,67 6,65 10,84 26,67 31,85 4,72 21,75 27,49
DU54 0,93 6,94 9,70 26,20 34,51 4,61 24,95 42,70
*Los resultados corresponden al valor medio de dos replicas
La cepa salvaje (IPT 046) acumuló cerca de un 26% de biomasa en forma de PHA.
3HD y 3HO fueron, respectivamente, los monómeros producidos en mayor
porcentaje. Si bien se conoce que a partir de la β-oxidación del ácido linoléico no se
produce 3HDd, este monómero fue detectado en proporciones mínimas en todos los
microorganismos evaluados. La producción de este compuesto probablemente se da
debido a la biosíntesis de ácidos grasos, en donde, moléculas de Acetil-CoA
producidas a partir del metabolismo del ácido linoléico son condensadas hasta
formar compuestos de mayor peso molecular. La fracción molar de 3HDd∆6
producida por IPT046 fue de 20,49mol %.
47
Los mutantes AG46 y CN25 mostraron una gran similitud en cuanto a la producción
de 3HDd∆6, presentando valores de 21,86 mol% y 21, 75 mol% respectivamente.
Estos valores no difieren mucho de los mostrados por la cepa salvaje IPT 046.
En 2007, SILVA-QUEIROZ utilizó la secuencia del gen fadH de E. coli y buscó por
secuencias similares en los genomas de Pseudomonas que han sido secuenciadas y
encontró en todas al menos un gen fadH. En Pseudomonas aeruginosa se
identificaron dos genes, denominados fadH1 y fadH2. Gracias a la elaboración de
un dendograma, logró clasificar estos genes en dos grupos: fadH1 presentes en todas
las Pseudomonas y fadH2 presente solamente en P. aeruginosa. Mediante el
alineamiento de las secuencias del gen fadH1 de diferentes subespecies de P. putida,
fueron diseñados iniciadores para la amplificación de este. ADN genómico de
Pseudomonas putida KT2440 y Pseudomonas putida IPT O46 fueron usados como
molde para realizar esta amplificación, obteniendo amplicones de 2,6Kb del genoma
de Pseudomonas putida KT2440, mientras que, a partir del genoma de
Pseudomonas putida IPT O46 no obtuvo ninguno, sugiriendo una diferencia en esa
región del genoma. Esta hipótesis se fundamenta en el estudio de nuevos genomas
secuenciados de diferentes sub-especies de Pseudomonas putida, los cuales muestran
48
que en regiones adyacentes al gen fadH1 se encuentran diferencias significativas
(Fig. 8), por lo cual, es recomendable rediseñar los iniciadores para la amplificación
de esta región genómica de P. putida IPT046. El producto de esta amplificación fue
ligado al vector de clonación pGEM T-Easy® (ver Anexo I) y transferido para E.
coli XL1-Blue mediante transformación (SILVA-QUEIROZ, 2007).
Figura 8. Regiones del genoma de diferentes subespecies Pseudomonas putida donde se encuetra el gen
fadH1
A partir de esto, uno de los objetivos de este trabajo fue la construcción del
plásmido pBBR1MCS-5::fadH1, con el fin de expresar el gen fadH1 en P. putida y
los mutantes obtenidos a partir de esta. La construcción de este plásmido se llevo a
cabo en dos etapas. La primera consistió en la obtención del fragmento de DNA de
interés (fadH1) el cual estaba inserido en el vector de clonación pGEM T-Easy®
(SILVA-QUEIROZ, 2007).
49
gen fadH1 (Figura 9), se determinó que todas las enzimas tenían sitio de corte dentro
de la región codificadora, y por tanto no eran adecuadas para la clonación. La única
excepción fue la enzima ApaI, la cual presenta un sitio de corte dentro del amplicón
pero no en la región codificadora. Asi ApaI fue seleccionada para realizar la
clonación del gen fadH. Para la clonación del gen fadH1 se realizó la extracción del
plásmido y posteriormente se utilizó la enzima de restricción ApaI para separar el
gen fadH del resto del plásmido
TGTCCCATCCTTTTGTCAGCATGAGCGAACCCTCCGGGCGCACTGAGTAGGCGCCACGTTCCATGGGTGGATGAT
CAAACGTGCTTGAAGAGTCTGGCAGAGCCGCGTTGTCTGGCAAATGCGCGGGGAGACTGTTTGGCGATCAAGCCA
GGCGAACCTTATAGCGCTGAAGTTCTGGAGCCTTCCCGACAGTCGCTGCCTCTGCTGTTCATCACGATCATTAAC
TTGTCAGTTTTGATCATTGAGGCAATTCAAACGGCTGTTTAATGTCGCAGGCAGACAAACGACGGGGCCCGCCAC
CCAGTGAGGTGCCCGCATTCCGTGATCACGCCATCAGGGGACCTTTCCATGGCCGCCGACCGCTACCCGCACCTG
CTTGCTCCGCTGGACCTGGGCTTTACCACCTTGCGCAACCGCACCCTGATGGGCTCGATGCACACCGGCCTCGAA
GAGCGCCCCGGCGGCTTCGAGCGCATGGCAGCTTACTTTGCCGAGCGCGCCCGGGGCGGCGTTGGCCTGATGGTC
ACGGGCGGCATTGCGCCCAATGATGAAGGCGGGGTGTATTCCGGTGCGGCAAAGCTCAGCACCGAGGAAGAGGCC
GACAAGCACCGCATCGTCACCGAGGCGGTGCACGCTGCCGGTGGCAAGATCTGCCTGCAGATACTGCATGCCGGG
CGCTACGCCTACAGCCCACGGCAGGTGGCACCTAGCGCGATCCAGGCGCCGATCAACCCGTTCAAGCCCAAAGAG
CTGGATGAGGCGGGCATCGAGAAGCAGATCGCCGACTTCGTCAATTGTGCCGTGCTGGCTCAGCGTGCCGGTTAC
GACGGCGTCGAAATCATGGGTTCGGAAGGCTACTTCATCAACCAGTTCCTGGCCGCCCACACCAACCACCGCACC
GACCGCTGGGGCGGCAGTTATGAAAACCGCATGCGCCTGGCAGTGGAAATCGTCAGCCGGGTGCGTGGCGCGGTA
GGGCCGAACTTCATCATCATCTTCCGCCTGTCGATGCTCGACCTGGTCGAGGGTGGCAGCACCTGGGACGAGATC
GAGCTGCTGGCCAAGGCCATCGAGCAGGCCGGCGCGACCTTGATCAACACCGGAATCGGTTGGCACGAGGCGCGT
ATTCCGACCATCGCCACCAAAGTGCCGCGTGCGGCCTTCAGCAAAGTCACCGCCAAGTTGCGCGGCGTGGTGAGC
ATTCCGCTGATCACCACCAACCGCATCAACACCCCGGAAGTGGCCGAGGCAGTGCTGGCCGAGGGCGATGCGGAC
ATGGTCTCGATGGCGCGACCGTTTCTCGCCGACCCGGACTTCGTCAACAAGGCCGCTGCCGGTCGTGCGGATGAA
ATCAACACCTGCATCGGCTGCAACCAGGCCTGCCTGGACCATACCTTCGGCGGCAAGCTGACCAGTTGCCTGGTC
AACCCGCGGGCCTGCCACGAGACCGAACTCAACTACTTGCCTGTACGTACGGTGAAACGCATTGCCGTGGTCGGC
GCCGGCCCGGCTGGCCTGGCGGCGGCCACCGTGGCGGCCGAGCGGGGCCACGCGGTGACCCTGTTTGACGCCGCC
AGCGAAATCGGTGGCCAGTTCAACGTGGCCAAGCGGGTGCCGGGCAAGGAAGAATTCTTCGAAACGCTGCGTTAC
TTCCGCAACAAGGTCAAAAGCACGGGCGTCGACCTGCGCCTGAATACCCGCGTGGATGTGCAGGCACTGGTGGGC
GGCGGCTTTGATGAAGTCATCCTGGCTACCGGCATCGCCCCGCGTACCCCGGACATCGCGGGCGTGGAGCATGCC
AAGGTGCTCAGCTACCTGGACGTGCTGCTCGAGCGCAAGCCGGTGGGCAAGTCGGTGGCCGTGATTGGCGCGGGA
GGTATCGGCTTCGATGTGTCCGAGTACCTGGTGCATCAGGGCGTGGCCACCAGTCAGGACCGAGCGGCATTCTGG
AAAGAGTGGGGCATCGATACCCATCTTCAGGCGCGAGGTGGTGTGGCCGGGATCAAGGCCGAGCCGCATGCTCCG
GCGCGGCAGGTGTACCTGTTGCAGCGCAAGAAATCCAAGGTGGGCGACGGGCTCGGCAAGACGACCGGCTGGATT
CACCGCACCGGGTTGAAGAACAAGGGGGTGCAGATGCTCAACAGTGTCGAGTATCTGGGTATCGACGATGCCGGC
CTGCACATTCGTGTGGACGGCGGCGAGCCCCAGGTGCTGGCGGTGGATAACGTGGTGATCTGTGCCGGGCAAGAT
CCGCTGCGCGAGCTGCAGGAAGGGCTGGTGGCGGCGGGGCAGTCGGTGCACCTGATCGGCGGCGCGGATGTGGCG
GCCGAGCTGGATGCCAAGCGGGCGATCAACCAAGGCTCGCGGTTGGCGGCTGAGCTCTGAGGTTGTCGGGGCTGC
GTGAGCCCGACACCTGCACGCGTGGGAGCGGGCATGCCCGCGAAACAGGTGACGCGGTGGATGGCACCGGCATTG
CCGGTGTTCGCGGGTGAACCCGCTCCTACGACGGGCTGTGCCGGGGCATCGATGCCTGTGTCGAGCCACCCTGGC
ACTGTGATGCCTCGGCGGGGGCGGGTCATCGATTACAAGCGCTTGCGGGATTACCCTGTAAACTGCGATCCATG
Figura 9 Secuencia de la región del amplicón conteniendo el gen fadH1.En rojo están
señalados los sitios reconocidos por endonucleasas
50
El plásmido pGEM T-Easy ® fue digerido con la enzima de restricción ApaI y el
fragmento de 2,6Kb fue purificado a partir del gel de agarosa después de la
electroforesis. El vector pBBR1MCS-5 fue también digerido con la endonucleasa
ApaI . y enseguida ligado al fragmento previamente purificado utilizando utilizando
la enzima T4 DNA Ligasa. El producto de ligación fue transferido por
transformación para E. coli XL1-Blue Los clones transformantes fueron
seleccionados en cajas de Petri con agar LBGm, IPTG y X-Gal. Varias colonias
blancas fueron seleccionadas y fueron sembradas en una caja de Petri con agar
LBGm, IPTG y X-Gal utilizando palitos de madera. (Figura 10)
Figura 10. Cajas con LBGm, IPTG y X-Gal mostrando colonias transformadas posiblemente con
pBBR1MCS-5::fadH1
51
Figura 11. Electroforesis en gel de agarosa. 1. 1Kb ladder; 2-11. ADN plasmidial digerido con ApaI
Figura 12. Electroforesis en gel de agarosa. 1. 1Kb ladder; 2. pGEM; 3. pBBR1MCS-5::fadH1 digerido con
Apa1; 4. pGEM:fadH1; 5. pGEM::fadH1 digerido con ApaI; 6. pBBR1MCS-5::fadH1
52
6.3 Complementación de Pseudomonas putida IPT 046 y los mutantes deficientes
en crecimiento en ácido 4-pentenoico con el gen fadH1.
Para la complementación de P. putida IPT 046 y los mutantes, inóculos de estos y de
E. coli S17-1:pBBR1MCS-5::fadH1 fueron sometidas a conjugación en medio
mineral con glucosa como fuente de carbono y gentamicina, que es una marca de
resistencia del plásmido pBBR1MCS-5. Cada una de las cepas no podría crecer en
este medio, porque E. coli S17-1 no crece en medio mínimo con glucosa como
fuente de carbono y P. putida IPT 046 junto con los mutantes, no crece en medio
con gentamicina, por lo cual, en este medio de cultivo solo podrían crecer bacterias
del género Pseudomonas que hubieran recibido el plásmido mediante conjugación.
Después de esto, las bacterias recombinantes fueron repicadas en un nuevo
MMGGm con el fin de aislar el clon recombinante y descartar cualquier interferencia
de las cepas utilizadas para la conjugación. Luego de esto, colonias aisladas de cada
uno de los microorganismos fueron repicadas en MMGGm, MMV y MM4P, con el
objetivo de evaluar el crecimiento en ácido graso insaturado. (Ver Tabla 8)
Tabla 8. Perfil de crecimiento de IPT 046 y los mutantes frente a las cepas complementadas con
pBBR::fadH1 en MMGGm, MMV y MM4P
53
DW4 - ++ + ++ + +/-
DX38 - ++ + ++ + +
EB50 - ++ + ++ + +
Esta tabla muestra una comparación del crecimiento en MMGGm, MMV y MM4P
de P. putida IPT 046 y los mutantes cuando están complementados con
pBBR1MCS-5::fadH1 y cuando no poseen el plásmido. En el caso de la cepa salvaje
y los mutantes sin complementar, no presentaron crecimiento en MMGGm, mientras
que las cepas que si poseen el plásmido con la resistencia a gentamicina crecieron
normalmente en este medio.
54
Algunos mutantes mostraron un crecimiento regular en MM4P, tal es el caso de
CN25 (Ver Fig.14) DR52 y DU54 (Ver Fig.16) mientras que otros mutantes
mostraron un crecimiento mínimo, como es el caso de AG46, AK1 (Ver Fig.13)
BG45, CF12, CM29, CM51 (Ver Fig.14) CR4, DG45, DM26 (Ver Fig.15) DW4,
DX38 y EB50 (Ver Fig.16). Dos mutantes (AM1 y BJ5) no mostraron ningún
crecimiento en este medio.
Figura 13. EVALUACIÓN DE CRECIMIENTO NO. “1”. 1. IPT 046, 2. AG46, 3. AK1, 4. AM1, 5. BJ5, 6.
IPT 046::pBBR1MCS-5::fadH1, 7. AG46::pBBR1MCS-5::fadH1, 8. AK1::pBBR1MCS-5::fadH1, 9.
AM1::pBBR1MCS-5::fadH1, 10. BJ5::pBBR1MCS-5::fadH1
55
Figura 14.EVALUACIÓN DE CRECIMIENTO NO. “2”. 1. IPT 046, 2. BG45, 3. CF12, 4. CM29, 5. CM51,
6. IPT 046::pBBR1MCS-5::fadH1, 7. BG45::pBBR1MCS-5::fadH1, 8. CF12::pBBR1MCS-5::fadH1, 9.
CM29::pBBR1MCS-5::fadH1 y 10. CM51::pBBR1MCS-5::fadH1
Figura 15. EVALUACIÓN DE CRECIMIENTO No. “3”. 1. IPT 046, 2. CN25, 3. CR4, 4. DG45, 5. DM26,
6. IPT 046::pBBR1MCS-5::fadH1, 7. CN25::pBBR1MCS-5::fadH1, 8. CR4::pBBR1MCS-5::fadH1,
9.DG45::pBBR1MCS-5::fadH1, 10. DM26::pBBR1MCS-5::fadH1
Figura 16. EVALUACIÓN DE CRECIMIENTO No. “4” 1.IPT 046, 2. DR52, 3.DU54, 4. DW4, 5. DX38, 6.
EB50, 7. IPT 046::pBBR1MCS-5::fadH1, 8. DR52::pBBR1MCS-5::fadH1, 9. DU54::pBBR1MCS-
5::fadH1, 10. DW4::pBBR1MCS-5::fadH1, 11. DX38::pBBR1MCS-5::fadH1, 12. EB50::pBBR1MCS-
5::fadH1.
56
Seguido de esto, el paso siguiente fue evaluar el crecimiento de los mutantes
complementados con el plásmido pBBR1MCS-5::fadH1 en MM4PGm, con el fin de
evidenciar una posible expresión de este gen. (Tabla 9) (Fig. 17) Una vez que sin la
presión selectiva del antibiótico para mantener el plásmido en la célula, la no
complementación de los mutantes podría resultar de la pérdida del plásmido y no de
la incapacidad del gen fadH1 para complementar el mutante.
Microorganismo
MM4PGm
recombinante
AG46::pBBR1MCS-5::fadH1 +++
AK1::pBBR1MCS-5::fadH1 -
AM1::pBBR1MCS-5::fadH1 -
BJ5::pBBR1MCS-5::fadH1 -
BG45::pBBR1MCS-5::fadH1 +++
CF12::pBBR1MCS-5::fadH1 -
CM29::pBBR1MCS-5::fadH1 -
CM51::pBBR1MCS-5::fadH1 -
CN25::pBBR1MCS-5::fadH1 -
CR4::pBBR1MCS-5::fadH1 +++
DG45::pBBR1MCS-5::fadH1 +++
DM26::pBBR1MCS-5::fadH1 -
DR52::pBBR1MCS-5::fadH1 -
DU54::pBBR1MCS-5::fadH1 -
DW4::pBBR1MCS-5::fadH1 +++
DX38::pBBR1MCS-5::fadH1 -
EB50::pBBR1MCS-5::fadH1 -
57
Figura 17. Evaluación de crecimiento de los mutantes complementados en MM4PGm.
1. AG46::pBBR1MCS-5::fadH1, 2. BG45::pBBR1MCS-5::fadH1, 3. CR4::pBBR1MCS-5::fadH1, 4.
DG45::pBBR1MCS-5::fadH1 y 5. DW4::pBBR1MCS-5::fadH1
A B
58
A B
En estas cajas se observó que existía una tasa de crecimiento muy similar entre las
cepas recombinantes, resaltando que las colonias que están en los extremos de las
cajas crecieron más debido a la disponibilidad de sustrato. Por otro lado, las colonias
que se encuentran en el interior de la caja mostraron un crecimiento uniforme. Estos
resultados son compatibles con una mutación en el gen fadH en estos mutantes, pues
el fenotipo salvaje es restablecido. Además de eso, una vez que los mutantes
presentaron algún crecimiento en ácido 4-pentenóico, están parcialmente afectados,
lo que sugiere la existencia de más de un gen fadH en P. putida.
Inicialmente se creía que el gen fadH debería codificar para la enzima mas
importante en la metabolización de ácidos grasos con insaturaciones extendiéndose
desde carbono par hacia impar y que, mutantes afectados en este gen, deberían
presentar una mayor incorporación de 3HDd∆6 . Entre tanto, el mutante BJ5,
presentó una mayor producción de 3HDd∆6 (Ver Tabla 6) pero no fue
complementado con el gen fadH1, lo cual sugiere la existencia de otros genes
involucrados específicamente en el metabolismo de estos ácidos grasos.
59
7. CONCLUSIONES
60
8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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69
9. ANEXOS
ANEXO I. Esquema del plásmido pGEM T-Easy
70