INVESTIGACION DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN MUESTRAS DE

AGUA (TECNICA DE NUMERO MÁS PROBABLE)

Jeinis Alexandra De la Cruz Gonzales, Keilys Yamith Rosellón Guerra, Juan

Segundo Sánchez Arrieta, María Alejandra Sánchez Giraldo.

Departamento de Ingeniería Ambiental

Universidad de la Guajira

RESUMEN (ABSTRACT).

El análisis microbiológico de un agua, tiene como finalidad, el control de calidad

microbiológica de la misma, según establece el Ministerio. En esta práctica, se
determinan las bacterias coliformes presentes en un agua mediante el Método de
los tubos múltiples, con el objetivo de poder diferenciar los organismos coliformes
totales de los fecales y así mismo realizar una buena interpretación de los
resultados obtenidos en el procedimiento.

Para el objetivo mencionado anteriormente se realizan dos pruebas, una prueba

presuntiva y otra confirmativa. En la prueba presuntiva se prepara una dilución con
la muestra originas y 9 ml de agua de dilución estéril que se encuentra
previamente en los tubos de ensayos y así se obtiene una dilución de 10-1, este
procedimiento se realiza las n veces necesaria; a partir de las últimas tres
diluciones se inoculan las muestras en tubos que contienen caldo lactosado
dejándose incubado a una temperatura de 34º entre 24 y 48 horas. Al realizar la
verificación después de pasadas las horas podemos identificar si los resultados
son negativos o positivos, teniendo como base la turbiedad y la producción de gas
en la muestra para este último. En relación a los resultados positivos en la prueba
presuntiva, se continúa con la prueba confirmatoria para coliformes fecales
inoculando con tres asadas en tubos que contienen Bilis verde brillante,
incubándolos durante 24 horas.
Los microorganismos coliformes totales y fecales son componentes habituales de
la microbiota comensal del intestino del hombre y de animales y es por ello, que
sirven de indicadores de una posible contaminación fecal del agua en estudio.
Además, debido a que presentan distintos grados de resistencia a los factores
medioambientales, su cuantificación nos permite establecer la evolución de la
contaminación en el tiempo.

Palabras claves: Coliformes totales, Coliformes fecales, número más probable.

INTRODUCCION necesario contar con

microorganismos que funcionen como
Uno de los objetivos de este indicador de contaminación fecal.
laboratorio es aplicar y entender la Estos deben de ser constantes,
forma en que se realiza un análisis abundantes y exclusivos de la
microbiológico de la muestra de un materia fecal, deben tener una
agua que presenta contaminación sobrevivencia similar a la de los
fecal, esta práctica se basa en patógenos intestinales y deben ser
determinar la presencia o ausencia capaces de desarrollarse
de bacterias indicadoras como las extraintestinalmente [ CITATION Gui
coliformes totales y fecales. Las \l 3082 ]
bacterias indicadoras poseen ciertas
características comunes que deben El agua potable debe estar libre de
cumplir para que sean consideradas microorganismos, sustancias
de esta forma. químicas y desechos biológicos, entre
otros; ya que la presencia de los
Debido a que un gran número de agentes mencionados antes, dentro
enfermedades son transmitidas por del organismo humano conlleva a una
vía fecal-oral utilizando como serie de invasiones y afecciones que
vehículo los alimentos y el agua, es perjudican el equilibrio del cuerpo de
manera que la salud se ve afectada eliminar los peligros y realizar un
(García, 2010). monitoreo operativo para garantizar la
eficacia de las barreras del sistema y
La calidad del agua se determina c) elaborar planes de gestión que
comparando las características describan las medidas que deben
físicas y químicas de una muestra de adoptarse en circunstancias normales
agua con estándares de calidad del y si se producen incidentes.
agua. En el caso del agua potable, (Organización Mundial de la Salud
estas normas se establecen para [OMS], 2014).
asegurar un suministro de agua
limpia y saludable para el consumo Es importante la identificación de
humano y, de este modo, proteger la coliformes totales así como de E. coli
salud de las personas (Organización en el agua, ya que estos
de Naciones Unidas-Departamento microorganismos son patógenos para
de Asuntos Económicos y Sociales el humano. El grupo coliforme
[ONU-DAES], 2014). constituyen un grupo heterogéneo
con hábitat primordialmente intestinal
Para garantizar sistémicamente la para la mayoría de las especies que
inocuidad del agua del consumo y involucra, es constante, abundante y
proteger la salud pública, debe casi exclusivo de la materia fecal, su
presentarse atención especial a la capacidad de sobrevivencia y
aplicación de un marco para la multiplicación fuera del intestino
seguridad del agua y de planes de también se observan en aguas
seguridad del agua (PSA) completos. potables, por lo que este grupo se
Para gestionar la inocuidad utiliza como indicador de
microbiana del agua de consumo es contaminación fecal en agua;
preciso: a) evaluar el conjunto del encontrándose que mientras mayor
sistema, para determinar los posibles sea el número de coliformes en agua,
peligros a los que pueden estar mayor será la probabilidad de estar
expuesto; b) determinar las medidas frente a una contaminación reciente.
de control necesarias para reducir o
Para su estudio, se dividen en dos  Muestra de agua de diferente
grupos. El grupo de bacterias naturaleza.
coliformes totales el cual comprende  Mechero Bunsen.
a todos los bacilos Gram-negativos  Cerillos o encendedor
aerobios o anaerobios facultativos, no  15 tubos con campana
esporulados, que fermentan la Durham, conteniendo caldo
lactosa con producción de gas en un lactosado Estéril
lapso máximo de 48 h. a 35°C ± 1ºC.  15 tubos con campana
Este grupo está conformado por 4 Durham, conteniendo Caldo
géneros principalmente: Lactosa Bilis Verde Brillante
Enterobacter, Escherichia, Citrobacter estéril.
y Klebsiella. El grupo de coliformes
 2 Cajas de Petri conteniendo
fecales, está constituido por bacterias
Agar Endo estéril.(o VRB)
Gram-negativas capaces de
 Gradillas para tubos de 18 x
fermentar la lactosa con producción
150 y de 13 x 100 mm.
de gas a las 48h de incubación a 44.5
 Asa Bacteriológica.
± 0.1°C. Este grupo no incluye una
 Incubadora a 35 °C.
especie determinada, sin embargo la
 Incubadora de 44 °C (±0.5 °C).
más prominente es Escherichia coli.

La demostración y el recuento de PRUEBA PRESUNTIVA

organismos coliformes, puede
realizarse mediante el empleo de Todas las operaciones deberán
medios de cultivo líquidos y sólidos efectuarse en absolutas
con características selectivas y condiciones de asepsia.
diferenciales. [ CITATION Gui \l
3082 ]
1. Agitar vigorosamente la
muestra por lo menos 20

METODOLOGIA veces para lograr una

distribución uniforme de los
Materiales
microorganismos.
2. Dependiendo del origen de la 8. Después de 24 horas de
muestra y el contenido incubación efectuar una
bacteriano esperado, preparar primera lectura para observar
diluciones. si hay tubos positivos, es decir,
3. Para preparar las diluciones, con turbidez y producción de
con una pipeta estéril tomar gas en el interior de la
una alícuota de 1 mL de la campana Durham.
muestra original y llevarlo a 9. Al hacer esta verificación es
uno de los tubos conteniendo 9 importante asegurarse que la
mL de agua de dilución estéril, producción de gas sea
obteniendo de esta manera resultado de la fermentación
una dilución de 10-1. (Fig.1) de la lactosa, en cuyo caso se
4. Agitar el tubo de la dilución 10- observará turbidez en el medio
1 y con otra pipeta estéril de cultivo, y no confundir con
tomar una alícuota de 1 mL y burbujas de aire.
llevarlo a otro tubo con 9 mL 10. Para evitar este tipo de
de agua de dilución estéril para confusiones es recomendable
obtener una dilución de 10-2. revisar las campanas Durham
5. Proceder de la misma manera antes de proceder a la
hasta obtener una dilución de inoculación y desechar
10-3 o hasta donde sea aquellos tubos cuyas
necesario. campanas contengan burbujas
6. Inocular asépticamente con 1 de aire o de alguna manera
mL de muestra por eliminar éstas y así poder
quintuplicado, tubos de utilizarlos.
fermentación conteniendo 11. De los tubos que en la primera
caldo lactosado, a partir de las lectura den positivos, ya se
últimas 3 diluciones pueden hacer las pruebas
7. Incubar todos los tubos a una confirmatorias para coliformes
temperatura de 35 °C durante totales y coliformes fecales.
24-48 horas.
 12. En caso de no apreciarse
crecimiento en el resto de los
tubos, continuarán en
incubación 24 horas más
13. Después de 48 horas (±2h) a
partir de la inoculación, se
hace la lectura final.
14. Si pasadas 48 h tampoco se
aprecia crecimiento ni
producción de gas, los tubos
se toman como negativos. PRUEBA CONFIRMATORIA PARA
COLIFORMES FECALES:
INTERPRETACION:
 A partir de cada uno de los
 Si el total de tubos son tubos que han resultado
NEGATIVOS: El examen se da positivos en la prueba
por terminado, reportando la presuntiva, agitándolos para
AUSENCIA DE COLIFORMES homogeneizar, inocular con
TOTALES Y FECALES en la tres asadas tubos conteniendo
muestra analizada. caldo Lactosa Bilis Verde
 Todos aquellos tubos que den Brillante.
POSITIVOS para prueba  Incubar durante 24 horas a
presuntiva se anotarán 44.5 ± 0.2 °C. y después de
convenientemente y se este período, observar
procederá a realizar la presencia de turbidez y gas.
PRUEBA CONFIRMATORIA
para Coliformes Fecales INTERPRETACION:

 Si se observa turbidez y
producción de gas:
La prueba se considera POSITIVA,
debiendo anotar el número de tubos
positivos y establecer el código para
posteriormente hacer el cálculo del
NMP
manera: a la primera serie de 5 tubos
se inoculan con 10ml de la muestra
cada uno, la segunda serie con 1ml y
por ultimo con 0.1ml a la tercera serie
de tubos (fig. 2).

 Si no se observa producción
de gas, aun cuando se
observe turbidez:

Se consideran negativos,
estableciéndose el Código 0, 0,0 para
efecto del cálculo del NMP.

 Si todos los tubos dan

negativos o todos dan Especificaciones para la
positivos recolección y Transporte de
Con base en los grados de dilución Muestras Ambientales
analizados, considerar la necesidad
de repetir el análisis a partir de Una técnica adecuada de toma de
grados de dilución menores (mayores muestras es la parte crítica en el
volúmenes de muestra) o mayores análisis de la calidad sanitaria del
(menores volúmenes de muestra), agua, las muestras para un análisis
respectivamente. microbiológico deben ser
recolectadas en forma aséptica y
Nota: si se presume que la muestra reflejar en la forma más precisa
de agua posee un contenido posible, las características del agua
bacteriano bajo (aguas tratadas), se en el momento del muestreo.
procede a inocular los tubos con el
medio de cultivo, directamente de la
MUESTRAS DE LLAVES Y GRIFOS:
muestra de agua, de la siguiente
Las muestras deben ser recolectadas
en envases limpios, de vidrio
borosilicato o plástico polipropileno
estéril y contener 0.1 mL de una
solución de tiosulfato de sodio al 10%
por cada 120 ml de muestra

 Escoger la llave o grifo que

estén en buenas condiciones
de funcionamiento
DISCUSION Y RESULTADOS
 Para obtener la muestra el
muestreador deberá lavarse
Medio de cultivo usado: caldo Bilis Verde Brillante
las manos con agua y jabón (BRILLA)

 Abrir completamente la llave o

grifo y dejar correr el agua por Prueba Presuntiva: Es un
lo menos 3 minutos procedimiento mediante el cual, una
 Reducir el flujo de agua para reacción negativa excluye la
permitir la toma de la muestra presencia del grupo coliforme,
 Abrir el frasco y obtener la mientras que una reacción positiva
muestra sin enjuagar y la indica su presencia inequívoca. Se
cantidad requerida según consideran tubos positivos aquellos
análisis. Llenar el envase en los que se observe aparición de
hasta ¾ partes de su gas en la campana Durham. La
capacidad para permitir la prueba presuntiva del medio de
agitación de la muestra cultivo usado arrojo los siguientes
 Tapar inmediatamente el datos:
frasco cuidando cerrar bien
5 tubos inoculados con 10 ml   de la
para evitar filtraciones
dilución del material:
 Completar los datos de
los cinco (5) son positivos
etiqueta adherida al frasco de
muestra
5 tubos inoculados con 1 ml de la 5 tubos inoculados con 10 ml   de la
dilución del material: los cinco (5) es dilución del material:
positivo los cinco (5) son positivos

5 tubos inoculados con 1 ml de la 5 tubos inoculados con 1 ml de la

dilución del material: solo dos (2) es dilución del material: los cinco (5) es
positivo positivo

Prueba De Confirmación De 5 tubos inoculados con 1 ml de la

Coliformes Totales: Deben dilución del material: solo uno (1) es
someterse a esta prueba todos los positivo
tubos que hayan resultado positivos
Interpretación
en la prueba presuntiva. A partir de
ellos y tras homogenizar su Como se puede observar en la
contenido, se procederá a sembrarlos combinación de positivos de la
mediante asa en tubos nuevos con primera prueba que es la presuntiva,
caldo específico para coliformes. donde nos da como resultados
Para el cálculo del NMP de coliformes obtenidos una lectura de 5-5-2 que
totales se contabilizarán como corresponden a 500 NMP de los
positivos aquellos tubos de la serie tubos de 10 ml, 1ml y 0.1 ml de
que hayan dado una prueba de material. Esta se parte utilizando
confirmación positiva. Las aguas 100ml de agua a ver si está
aptas para consumo humano deben contaminada haciendo tres replicas
tener ausencia de coliformes tanto con la cantidad de tubos especificada
totales como fecales en un mínimo de anteriormente, luego de ser añadida
100 ml de agua analizada. La prueba el agua, se introduce a un incubador
de confirmación de coliformes totales a 37°C durante 24-48 horas. Al
del medio de cultivo usado arrojo los analizar el resultado tras la
siguientes datos: incubación si en las muestras existen
coliformes se producirá gas que
quedará atrapado dentro de la
campana. Al analizar el resultado de
los enterococos fecales si se
presenta turbidez al agitarlo un poco
es que es positivo y si no presenta
turbidez es negativa. Prueba Prueba
presuntiva confirmativa
Y en la combinación de positivos de Tubos positivos Tubos positivos de
la segunda prueba de confirmación de 10ml: 5 10ml: 5
de coliformes totales, donde nos da Tubos positivos Tubos positivos de
como resultados obtenidos una de 1ml: 5 1ml: 5
lectura de 5-5-1 que corresponden a Tubos positivos Tubos positivos de
300 NMP de los tubos de 0,1ml: 2 0,1ml: 1
específicamente de 10 ml, 1ml y 0.1
ml de material. El compuesto verde
brillante del caldo bilis, inhibe el
crecimiento de bacterias no entéricas
luego se inoculan de cada tubo
presuntivo que se utilizó
anteriormente para confirmar que los
tubos presuntamente positivos lo son
en realidad. Estos se introducen en
un incubador durante 24 horas a
37°C. Y al analizar el resultado para
coliformes, si en los tubos aparecen
gas atrapado en las campanas se
considerará positiva y si en los
enterococos fecales se observan
cocos gram positivos en cadenas se
considerará positiva.

Aplicamos la técnica estadística del

número más probable y buscamos el
resultado en la tabla del estadístico.
 Prueba presuntiva abastecimiento para determinar

Prueba de confirmación de
coliformes totales

Aplicando así la prueba estadística

del número más probable indicada en
la tabla anterior con flechas. Como se
usaron cantidades 10 veces menores
(1/10) de aquellas con las que se
construyó la tabla de confirmación de
coliformes totales, el valor es de 300
organismos por 100 (ml) de material,
el cual el valor de 300 debe
multiplicarse por 10, lo que
proporciona un valor de 300 x 10 =
3000 organismos por 100 g (ml) de
material.
cualquier fuente de contaminación
Como usualmente se expresa por g
que este alterando la calidad.
(ml) de material, este valor (3000)
debe dividirse sobre 100. El recuento CONCLUSION
obtenido por el NMP es en este caso Partiendo de los resultados obtenidos
de 30 organismos por g (ml) de durante la práctica al observar
material analizado. Lo que quiere turbidez y gas, además de su alto
decir que el agua de la prueba final índice de NMP, se logra evidenciar la
de la confirmación de coliformes presencia de coliformes totales en las
totales contiene un alto índice de muestras de agua sometidas a
NMP la cual no es acta para el análisis, lo cual nos indica la
consumo humano, y es señal de que presencia de contaminación fecal,
deben tomarse medidas correctivas y existe un numero de coliformes muy
la necesidad de una inspección alta, o sea esta contaminación es
sanitaria completa del sistema de reciente, y por ende no son aptas
para el consumo humano, y que se vertidas a aguas y bienes nacionales,
debe identificar la fuente de dicha así como las descargas vertidas al
contaminación y su posterior suelo (uso en riego agrícola) es de
tratamiento como medidas para su 1,000 y 2,000 NMP/100 ml para el
mejoramiento y mantenimiento del promedio mensual y diario
mismo. Es de vital importancia respectivamente”.
realizar este tipo de procesos para
2. Mencionar 5 enfermedades
comprobar la presencia de estos
transmitidas por el agua, indicando
indicadores en el agua puesto que su
el agente etiológico
consumo y uso es la base de nuestra
correspondiente
vida. Es importante mencionar que la
producción de gas se registra a una .
determinada temperatura y esto es
a) La fiebre tifoidea es
una muestra fehaciente de la
provocada por bacterias
presencia de estos coliformes.
peligrosas llamadas
Salmonella typhi. La bacteria
Salmonella typhi está
CUESTIONARIO
emparentada con las bacterias
que causan la salmonelosis,
1. ¿Cuáles son los límites máximos otra infección intestinal grave,
permisibles de Coliformes Fecales pero son distintas.
para las descargas de aguas b) La poliomielitis, o parálisis
residuales vertidas a aguas? infantil, es una enfermedad
infecciosa que afecta
El punto 2 de “Especificaciones” de la
principalmente al sistema
NOM-001-ECOL-1996 establece que
nervioso. La enfermedad la
“para determinar la contaminación por
produce el poliovirus. Se
patógenos se tomará como indicador
llama infantil porque las
a los coliformes fecales” y que “el
personas que contraen la
límite máximo permisible para las
enfermedad son
descargas de aguas residuales
principalmente niños. Se
 transmite de persona a personas en su porción
persona a través de anterior (duodeno) y se
secreciones respiratorias o por transmite en las heces de una
la ruta fecal oral. persona o animal infectado.
c) La disentería amebiana o
3. Además de representar un
amebiasis es la forma de
riesgo para la salud pública el
diarrea, infecciosa con sangre
vertido de aguas residuales
y moco, causada por
tratadas inadecuadamente o sin
Entamoeba histolytica.
tratar a los depósitos naturales,
Además de ello la ameba
¿Qué otros efectos indeseables
puede atacar el hígado
puede representar?
causando un absceso hepático
amebiano. Grandes desechos de aguas
d) La hepatitis A (antes hepatitis contaminadas que hacen mucho
vírica, también hepatitis viral y daño al medio ambiente. La mayoría
hepatitis infecciosa)1 es la de esas aguas es descargada en los
enfermedad infecciosa que ríos, lagos, mares, en los suelos a
más comúnmente produce cielo abierto o en el subsuelo, a
aguda en el mundo. Es través de los llamados pozos sépticos
causada por el virus de la y rellenos sanitarios. Las fuentes de
hepatitis A (VHA), cuyo agua (ríos, acuíferos, lagos, mar),
reservorio natural es han sido incapaces por sí mismas
solamente humano. para absorber y neutralizar esta carga
e) La giardiasis es una contaminante, y por ello estas masas
enfermedad diarreica de agua han perdido sus condiciones
ocasionada por Giardia naturales de apariencia física y su
intestinalis (conocido también capacidad para sustentar una vida
como Giardia lamblia), acuática adecuada, que responda al
parásito microscópico equilibrio ecológico que de ellas se
unicelular que vive en el espera para preservar los cuerpos de
intestino delgado de las agua. Como resultado, pierden
aquellas condiciones mínimas que les E. coli enterotoxigénica (ETEC),
son exigidas para su racional y
E. coli enteroinvasiva (EIEC),
adecuado aprovechamiento como
fuentes de abastecimiento de agua, E. coli enteroagregativa (EAEC),
como vías de transporte o fuentes de
E. coli productora de toxina Shiga
energía.
(STEC),
Un agua contaminada puede llevar a
E. coli de adherencia difusa (ADEC) y
la eliminación de especies completas
por la falta de oxígeno, convirtiéndose E. coli enterohemorrágica (EHEC).
en un medio totalmente hostil para la
El patotipo EIEC se ha asociado con
vida de plantas y animales acuáticos
la enfermedad de Crohn, mientras
4. ¿Cuáles con los tipos de E. coli? que el patotipo DAEC se asocia con
colitis ulcerativa.
Las cepas patogénicas de E. coli
productoras de diarrea en el hombre Hay tipos híbridos, como la E. coli
se han clasificado según el factor enteroagregativa hemorrágica
genético que define su virulencia y (ECEAH) que lleva genes de
que contribuye al cuadro clínico virulencia de la EAEC y la ECST. Las
asociado, definiendo a diferentes cepas de E. coli son altamente
tipos patogénicos, conocidos como heterogéneas y continuaran
patotipos o virotipos; de esta forma se adaptándose.
han definido al menos siete tipos de
BIBLIOGRAFÍA
patotipos intestinales son:

E. coli enteropatogénica (EPEC),

Guia de laboratorio. Darsis Ballesteros Movil

Instituto de investigaciones químicas y biológicas. 2015.

http://documentacion.ideam.gov.co/openbiblio/bvirtual/018834/MEMORIAS2004/C
apituloI/1Legislacionreferenteaaguasresiduales.pdf

https://es.wikipedia.org/wiki/Enfermedades_de_origen_h
%C3%ADdrico#:~:text=Enfermedades%20transmitidas%20por%20el%20agua
%20son%20aquellas%20causadas%20por%20el,del%20agua%2C%20antes
%20de%20consumirla.

https://blogdelagua.com/actualidad/internacional/como-afecta-la-contaminacion-
del-agua-al-medio-ambiente/

https://es.wikipedia.org/wiki/Escherichia_coli#Microbiolog%C3%ADa