Cátedra de Biotecnología – Titular: Ing. Ricardo Puglisi – JTP: Ing.

Noelia Robles

TRABAJO PRÁCTICO DE LABORATORIO Nº3: Análisis bacteriológico del agua

OBJETIVO

 El objetivo del análisis es identificar los microorganismos del agua y medir su concentración.
 Adquirir conocimientos en técnicas de diluciones para preparar las muestras.
 Conocer los distintos métodos de análisis.
 Realizar determinaciones del NMP de coliformes en una muestra de agua.

ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DEL AGUA

La población microbiana del agua puede estar compuesta por:

Bacterias patógenas: Microorganismos con núcleo difuso, se encuentran en el límite entre los reinos
animal y vegetal. Su identificación se efectúa sobre medios especiales que permiten aislarlas y
clasificarlas, se reproducen por división nuclear (en medio favorable), y por producción de esporas (en
medios desfavorables). Ej: bacilos de fiebre tifoidea (Salmonella tiphi), disentéricos (Shigella flexneri),
vibrio colérico (Vibrio cholerae), tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis) conocido también como
bacilo de Koch, etc.

Virus y bacteriófagos: Agentes patógenos muy pequños, sólo visibles al microscopio electrónico. Sólo
se pueden multiplicar en el interior de una célula viva. Está formado de la asociación de un ácido
nucleico (ADN o ARN) con una proteína. Ej: virus de la poliomielitis, hepatitis infecciosa, gripe, diarrea,
etc. Se eliminan principalmente por floculación.

Hongos: Las esporas de los hongos se eliminan por floculación y filtración, son resistentes al cloro.

Amebas: Son protistas unicelulares, eucariotas caracterizadas por su forma cambiante, puesto que
carecen de pared celular, y por su movimiento ameboide a base de pseudópodos, que también usan
para capturar alimentos a través del proceso llamado fagocitosis. Las especies de este género viven
libres en agua o tierra, mientras que las de otros géneros relacionados parasitan el intestino del hombre
o de los animales.

Gusanos

Insectos

Plancton: Es el conjunto de organismos, principalmente microscópicos, que flotan en aguas saladas o

dulces.

DETERMINACIÓN DE BACTERIAS PATÓGENAS

Vía directa: Es un método lento, poco ágil y costoso, que puede exigir el empleo de técnicas
complicadas, es aplicable sólo a trabajo de investigación.

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Organismo indicador: Se basa en el hecho de que la presencia de ciertos organismos en el agua

permiten inferir su origen, trayectoria y grado de contaminación. Para poder cumplir con esta función
deben tener ciertas condiciones:

 Ser provenientes sólo de heces y orina de animales de sangre caliente y el hombre.

 Ser detectado y cuantificado ráopida y fácilmente.
 Ser fácilmente eliminado por tratamiento.
 Con posibilidades de supervivencia igual o mayor al más resistente de los patógenos.
 Estar presentes en mayor cantidad que los patógenos.

Los organismos elegidos como indicadores suelen ser del grupo coliformes de bacterias y las
bacterias streptococos fecales.

GRUPO COLIFORMES

Está formado por bacterias aerobias o anaerobias facultativas, bacilos Gram (-) que no esporulan
y que fermentan la lactosa con producción de gas y acidez dentro de las 48 horas de incubación a 35ºC.
Los principales géneros que lo componen son:

Escherichia Coliformes fecales

Coliformes totales Citrobacter

Enterobacter Grupo CEK

Klebsiella

De ellos, el indicador específico de contaminación fecal es la especie Escherichia coli. Por lo

tanto, si en el análisis del agua se hallan coliformes totales, deberá investigarse la presencia de
Escherichia coli.

La denominación de “coliformes fecales” ha sido cuestionada porque en el método que se

describe a continuación, junto con Escherichia coli pueden desarrollar lo que se denominó “coliformes
termotolerantes”. La ambigüedad ha sido subsanada con el empleo de sustratos específicos de
Escherichia coli (M.U.G.).

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M.U.G.

El uso de este grupo como indicador tiene una serie de ventajas:

 Se encuentran en cantidad en las heces humanas y de los animales de sangre caliente.

 El ensayo es simple, económico y reproducible.
 Los coliformes son sensibles a los tratamientos paralelos del agua contra tifus y el cólera.
 Viven más tiempo en el agua que los gérmenes patógenos intestinales.
 Históricamente le ensayo ha sido satisfactorio.

El uso de este grupo como indicador tiene una serie de desventajas:

 El ensayo es lento y se necesitan 48 horas para completarlo.

 No todo está relacionado a los contaminantes fecales: coliformes fecales/contaminantes totales
≈ 1/5.
 Permite diferenciar la contaminación debida al suelo producida por los animales, pero no
diferencia esta última de la producida por el hombre.
 Los virus son más resistentes al tratamiento que los coliformes.

MUESTRAS

a) Características que deben cumplir

 Deben recogerse en un recipiente esterilizado.
 Debe ser representativo del abasteciminento del cual procede.
 Se debe evitar su contaminación durante y después de la recolección hasta el momento
de análisi.
 Debe analizarse lo más pronto posible después de ser recogida.
 Si hubiese que diferir el análisis, debe conservarse entre 0ºC y 10ºC de temperatura.
b) Diluciones en el laboratorio

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Los tubos tienen 9 ml de diluyente. El mismo debe estar desprovisto de toda acción bacteriana
(cloro activo, etc.).

Los diluyentes más apropiados son:

a) Solución tampón (pH 7 – 7,2) diluida de fosfatos.

b) Solución Ringer:

 ClNa: 9,00 g.
 ClK: 0,42 g.
 ClCa: 0,48 g.
 CO3HNa: 0,20 g.
 H2O destilada: 1.000 ml.

Se pueden emplear esterilizados a 120ºC, 15 minutos; siempre y cuando se contemple el

porcentaje de pérdidas por evaporación en el autoclave.

FRECUENCIA DE LOS ENSAYOS (NORMA O.M.S.)

La frecuencia es función de la población servida según:

Población servida (Nº de habitantes) Nº mínimo de muestras mensuales

30 a 2.500 2
2.501 a 3.300 3
3.301 a 4.100 4
4.101 a 4.900 5
4.901 a 5.800 6
5.801 a 6.700 7
6.701 a 7.600 8
7.601 a 9.400 10

MÉTODOS DE ANÁLISIS BACTERIOLÓGICOS

Estos son:

1. Recuentos en placas para determinar el Nº de bacterias presentes.

2. Pruebas que revelan la existencia de Coliformes y su diferenciación.
3. Identificación de otros organismos presentes.

Esquemáticamente la secuencia de trabajo sería la siguiente:

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BACTERIAS AERÓBICAS MESÓFILAS TOTALES

Las bacterias que se desarrollan en el agua tienen condiciones y necesidades nutritivas de

crecimiento muy variables. Así las técnicas usuales solo desarrollan una pequeña porción de las
presentes.

Es un parámetro microbiológico de calidad del agua aunque también pueden haber entre ellas
bacterias patógenas.

La determinación se efectúa en medio sólido (Ágar nutritivo) preparado de la siguiente manera:

 Extracto de carne: 3g.

 Peptona: 5g.
 Ágar: 15g.
 Agua destilada: 1000 cm3.
 pH: 7,2.

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TÉCNICAS DE PREPARACIÓN Y SIEMBRA

Según la naturaleza del agua, la muestra se sembrará:

 1/1 ó 1/10 si se trata de aguas profundas o superficiales purificadas.

 1/10, 1/100, 1/1.000, según sea el grado de contaminación para las aguas superficiales no
purificadas.

Se deberán sembrar dos diluciones de cada muestra y dos cajas por cada dilución.

Los 10 ml de agar fundido por caja se mezclan con 1 ml de muestra diluida (42 – 45ºC) y se
distribuyen uniformemente por movimientos rotatorios y rectilíneos sobre la superficie de la mesada. Se
deja solidificar y se incuba con la caja invertida. El tiempo transcurrido desde que se efectúan las
diluciones hasta que se agregue ésta al medio de cultivo no debe exceder los 15 minutos. Luego de
transcurrido el periodo de incubación se sacarán las cajas de la estufa para su lectura, si ésta no puede
realizarse inmediatamente, se las debe guardar en la heladera para evitar que continúe el desarrollo.

Se informa en UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (U.F.C.)/ml. En una caja de Petri donde

se cuenten no más de 60 – 70 colonias, se multiplica por 10 elevado a la potencia de la dilución. Por
ejamplo: 35 x 103 u.f.c./ml. Esta forma de expresar el resultado pone en evidencia la precisión de la
determinación

BACTERIAS COLIFORMES

Su determinación se basa en la propiedad que tienen estos microorganismos de fermentar la

lactosa, produciendo ácido y gas. Debido a la existencia de otras bacterias que tienen la misma

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propiedad se debe evitar su influencia. Este ensayo permite presumir la presencia de bacterias
coliformes. En caso de resultado positivo se debe proceder a la diferenciación de los microorganismos
presentes:

 Con caldo MAC CONKEY a 44ºC y durante 48 horas para determinar la presencia de “Escherichia
coli”.
 En medio de CITRATO DOBLE DE KOSER a 37ºC durante 48 horas para determinar la presencia
de bacterias “Intermediarios Aerogenes y Cloacae” (I.A.C.) actualmente este grupo se denomina
C.E.K. (Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella).

En este ensayo se siembran tubos de caldo lactosado L.B.V.B. (Lactosa – Bilis – Verde – Brillante)
o en caldo MAC CONKEY (presenta las mismas características bioquímicas que el L.B.V.B.) con las
cantidades apropiadas de muestra. Cada tubo deberá estar provisto de una campana de fermentación
DURHAM y se incuban 48 hs en estufa a 37ºC. se considerará positivo todo tubo que demuestre
presencia de ácido (el medio cambia de color hacia el amarillo verdoso) y formación de gas (más del 10%
del volumen de la campana).

El “número más probable” (NMP) de coliformes se puede calcular con la fórmula que sigue:

NMP [coliformes/100 ml] = 100/V ln N/(N – A)

Donde:

V: volumen de la porción ensayada.

N: número total de tubos.

A: número total de tubos positivos.

La forma práctica es leer el NMP/100 ml en una tabla en función del número de tubos positivos
por dilución de la muestra.

El caldo MAC CONKEY responde a la siguiente composición:

 Concentración simple:
 Taurocolato de sodio comercial: 5g.
 Lactosa: 10g.
 Peptona: 20g.
 Cloruro de sodio: 5g.
 Agua destilada: 1.000 ml.
 pH: 7,4

Se fracciona a 5 ml por tubo.

 Concentración doble:
 Cantidad doble de drogas en un litro de agua destilada.

Se fracciona a 10 ml por tubo.

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EJECUCIÓN PRÁCTICA

En el desarrollo de la práctica se analizará una muestra de agua:

 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
- Se entregará a cada grupo una muestra de cada agua a analizar.
- Con cada muestra se procederá a hacer las diluciones correspondientes:
- Muestra tal cual.
- 1/10 (0,1 de muestra tal cual).
- 1/100 (0,01 de la muestra tal cual).
- 1/1.000 (0,001 de la muestra tal cual).

 DETERMINACIÓN DE COLIFORMES TOTALES

Se pueden sembrar series de 2, 3, 4, 5 números de tubos por dilución.

- Siembra en tubos grandes doble concentrado y medianos simple concentrado:

A) MUESTRA DE AGUA

- Sembrar 3 tubos doble concentrado con 10 ml de muestra tal cual.

- Sembrar 3 tubos simple concentrado con 1 ml de muestra tal cual.
- Sembrar 3 tubos simple concentrado con 1 ml de muestra 1/10.
- Sembrar 3 tubos simple concentrado con 1 ml de muestra 1/100.
- Etc…

Llevar a estufa las siembras a 37ºC y luego de 48 horas proceder a su lectura, considerando
positivos aquellos tubos que poseen gas en la campana y han experimentado cambio de color.

Informar el NMP de coliformes por cada 100 ml de muestra de acuerdo a las tablas siguientes
para cada tipo de muestra.

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MUESTRA DE AGUA

Valores del N.M.P. cuando se siembran 3 tubos por dilución para distintas combinaciones de
tubos positivos y negativos y límites de confianza para el 95%

Límites de confianza para el

3 tubos con 10 3 tubos con 1 3 tubos con 0,1
[N.M.P./100ml] 95%
ml ml ml
Inferior Superior
0 0 0 <3 ----- -----
0 0 1 3 <0,5 9
0 1 0 3 <0,5 13
1 0 0 4 <0,5 20
1 0 0 7 1 21
1 1 1 7 1 23
1 1 0 11 3 36
1 2 0 11 3 36
2 0 0 9 1 36
2 0 1 14 3 37
2 1 0 15 3 44
2 1 1 20 7 89
2 2 0 21 4 47
2 2 1 28 10 150
3 0 0 23 4 120
3 0 1 39 7 150
3 0 2 64 15 380
3 1 0 43 7 210
3 1 1 75 14 230
3 1 2 120 30 280
3 2 0 93 15 380
3 2 1 150 30 440
3 2 2 210 35 470
3 3 0 240 36 1300
3 3 1 460 71 2400
3 3 2 1100 150 4800
3 3 3 >2400 ----- INFINITO