Elaboró: Dra. Aida M.

Zamora Contreras

BIOLOGÍA DE PLÁSMIDOS
Elaboró: Dra. Aida M. Zamora Contreras
Unidad de Aprendizaje: Tópicos Selectos de Biotecnología II
Carrera: Ingeniería Biotecnológica
Plantel: UPIBI-IPN
Fecha de elaboración: Diciembre 2020
Versión: 1.0
Manipulación e Ingeniería Genética Elaboró: Dra. Aida M. Zamora Contreras

• Para lograr obtener un organismo genéticamente modificado (OGM), es necesario introducir un material genético
nuevo (secuencia de ADN), que no se encontraba originalmente en dicho organismo.

• La nueva secuencia de ADN puede provenir de cualquier otro organismo, de la misma familia o de una diferente,
incluso de otro género o reino.

• El organismo que recibe esa nueva secuencia se llama OGM o transgénico.

• Hay muchas razones para querer fabricar un OGM, pero una muy común es lograr que ese nuevo ADN se exprese,
es decir que se transcriba a ARNm y a su vez se traduzca a una proteína.

• Además, debe poder copiarse, es decir, replicarse, cada vez que la célula se divide y produce una nueva
generación de células.
 Elaboró: Dra. Aida M. Zamora Contreras
Manipulación e Ingeniería Genética
• La forma más básica de manipulación genética es la Ingredientes:
formación in vitro (en microtubos) de nuevas 1. DNA de interés (Ej. Gen
combinaciones de material genético. codificante)
2. Vehículo genético (vector o
plásmido)
• Es necesaria la inserción de ADN de interés 3. Tijeras (Ej.:enzimas de restricción)
(normalmente un gen completo) en un vehículo
genético (vector). 4. Pegamento (Ej.: enzima ligasa)
5. Presencia de un gen de selección
6. Célula receptora
• Para que el vector funcione, es necesario introducirlo
dentro de algún organismo hospedero mediante
alguna técnica de transformación.

• Posteriormente el organismo con el vector se

multiplica, propaga y expresa el ADN híbrido o
recombinante.

Modificado de: https://www.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-cloning-tutorial/a/overview-dna-cloning

Vectores Genéticos: Elaboró: Dra. Aida M. Zamora Contreras

A continuación, se muestra una tabla que condensa todos los tipos de vectores que se pueden utilizar para diferentes aplicaciones en ingeniería
genética. Debido a las ventajas que presenta, el más comúnmente utilizado es el plásmido y es en el que se centrará el curso.
Máximo tamaño de
Tipo de vector Descripción Origen Aplicaciones Limitaciones
inserto (kpb)
Clonación de ADN, expresión de proteínas,
ADN de doble cadena, circular, basado en Artificial, basado Tamaño de inserción restringido,
subclonación, secuenciación directa del
los plásmidos que se encuentran en los plásmidos expresión de proteínas limitada al
Vectores plasmídicos Aprox. 12 inserto, reservorio de secuencias como
naturalmente en muchas bacterias y naturales de las número de copias del plásmido dentro
bibliotecas genómicas de fragmentos
algunas levaduras. bacterias. de la célula o a la fuerza del promotor.
pequeños de ADN.
Secuencias de ADN de cadena sencilla lineal
de origen fágico (fagos: virus que infectan
bacterias como el fago lamba y el M13). Se Limitación al empaquetamiento del
Artificial, basado
les ha eliminado las secuencias dañinas para Bibliotecas genómicas, bibliotecas de cDNA ADN por su tamaño de inserción, no se
Vectores bacteriófagos en el genoma de Aprox. 25
la bacteria y sólo se han dejado las y bibliotecas de expresión. puede replicar o expresar en otros tipos
fagos.
necesarias para empaquetarlo en una de celulas, excepto bacterianas.
partícula viral y que esta pueda introducir el
ADN a la bacteria.
Es plásmido de doble cadena ciruclar con Limitación al empaquetamiento del
Bibliotecas genómicas, bibliotecas de
sitios Cos, que son secuencias que el fago Bacterias/Fago ADN por su tamaño de inserción, no se
Cósmidos Aprox. 35 cDNA, clonación de fragmentos grandes de
lambda necesita para empaquetarlo e lambda puede replicar o expresar en otros tipos
ADN.
infectar a la bacteria. de celulas, excepto bacterianas.
Replicación restringida a bacterias, no
Artificial, se usa
BAC (Cromosona Artificial Bibliotecas genómicas, clonación de se puede usar para expresión de
Es un ADN de doble cadena circular. para transformar Aprox. 300
Bacteriano) fragmentos grandes de ADN. muchas proteínas, por ejemplo, rutas
bacterias.
metabólicas completas.
Es un ADN de doble cadena circular, pero se
Artificial, se usa
YAC (Cromosoma Artificial abre al insertarse en las levaduras. Contiene Bibliotecas genómicas, clonación de Limitado a replicación en levadura. No
para transformar 200-2000
de Levaduras -Yeast) un centrómero para migrar con el huso fragmentos grandes de ADN. es ideal para expresión de proteínas.
levaduras.
mitótico durante la división celular.
Basado en plásmidos que se encuntran de Depende del tipo Sólo se limita a la transformación del
Bacteriano Transferencia de genes al núcleo de
Vector Ti forma natural en el género Agrobacterium de vector Ti ADN nuclear de algunos tipos de
(Agrobacterium) algunos tipos de plantas.
que utiliza para infectar plantas. utilizado plantas.
Vectores Genéticos: Plásmidos Elaboró: Dra. Aida M. Zamora Contreras
-Son vehículos genéticos cuyo objetivo es contener una secuencia genética de interés para lograr introducirla a algún tipo de célula (bacteria, hongo,
planta, animal).

-Se dividen básicamente en vectores de clonación y expresión.

-Vectores de clonación sirven para que se les inserte una secuencia y sirvan principalmente de reservorio de la misma (bibliotecas
genómicas).
-Vectores de expresión sirven para que la secuencia se les inserte, además de conservarla, se pueda expresar en una célula.

-Deben tener ciertas características para que funcionen como vectores genéticos:

-Capacidad de replicación autónoma (origen de replicación, sitio Ori).

-Marcadores seleccionables: genes que confieren algún rasgo rastreable o seleccionable fácilmente en laboratorio
-genes que confieren resistencia a antibióticos,
-genes que producen proteínas de colores o fluorescentes,
-genes que producen proteínas que metabolizan algún compuesto,
-genes que completan alguna auxotrofía (tienen la versión completa de un gen mutado, no funcional, en el hospedero).

-Una zona que pueda ser “abierta” mediante alguna estrategia de clonación para insertar la secuencia de interés. La más común es
con el uso de enzimas de restricción, el plásmido contiene una zona que concentra varios sitios de reconocimiento de enzimas de restricción
denominado sitio de clonación múltiple (SCM o MCS por sus siglas en inglés).

-Una vez que se ha insertado una secuencia de interés, normalmente se desea verificar la identidad y sentido de inserción por lo que se puede
recurrir a algunas estrategias para lograrlo como secuenciación. Para ello, normalmente flanqueando al SCM se encuentran secuencias
conocidas que tienen como fin, ser usadas como sitios de hibridación para cebadores para secuenciación.

-Puede contener otros elementos funcionales para favorecer la expresión (transcripción/traducción) de la secuencia que se quiere
insertar:
-Trascripción: promotores, señal de poliadenilación, terminadores.
-Traducción: sitio de unión a ribosoma, codones de inicio y paro si es que la secuencia que se
inserta no los contiene.
Vectores Genéticos: Plásmidos Elaboró: Dra. Aida M. Zamora Contreras

-En la siguiente página se muestra un esquema simple de un plásmido en donde se pueden

visualizar la disposición de las partes funcionales más comunes.

-El promotor, RBS, ATG, señal polyA, codón de paro y terminador deben estar colocados de
tal manera que cuando la secuencia se inserte en el sitio de clonación múltiple usando una o
dos de los sitios de restricción, el gen pueda expresarse. Es decir que se puede transcribir y
traducir.

-Además el plásmido debe poder replicarse varias veces con la maquinaria de replicación
celular para permitir que las siguientes generaciones de células contengan copias.

-El gen de resistencia debe contener una forma de poder expresarse, es decir que la
maquinaria celular pueda producir la proteína que le dará la resistencia al antibiótico en el
medio, o al mecanismo de selección que se haya elegido, por lo que se requiere exista un
promotor antes del gen para que se pueda transcribir y, por consiguiente, traducir.
Vectores Genéticos: Plásmidos Elaboró: Dra. Aida M. Zamora Contreras

Promotor
Sitio de Unión a Ribosoma
Promotor del gen de Codón de inicio
resistencia

SCM
Sitios de hibridación
de cebadores para
secuenciación
Gen de Selección
para Resistencia Codón de paro
a Ampicilina Terminador
Señal de Poliadenilación de la
Transcripción
Origen de replicación

Las flechas indican el sentido de lectura de la secuencia. Por ejemplo, el promotor que está antes del SCM indica que el inicio del inserto (5’) debe estar de ese lado y el final (3’)
del lado de la señal de polyA y terminador. Si se quisieran usar dos enzimas de restricción para insertar el gen, la combinación debería estar en el orden que permita ese sentido
de inserción.
Por ejemplo: 5’-NheI-BamHI-3’, 5’-BamHI-EcoRV-3’, 5’-XhoI-XbaI-3’. Si se usara la combinación 5’-EcoRI-BamHI-3’ ó 5’-NotI-KpnI-3’, la inserción sería en el sentido contrario (en la
cadena complementaria), es decir el inicio del gen quedaría del lado de la polyA y el final del lado del promotor por lo que no se podría expresar.
Imagen creada con el editor de secuencias pDRAW, obtenido de https://www.acaclone.com/
De donde viene los plásmidos artificiales: Elaboró: Dra. Aida M. Zamora Contreras
Como se ha mencionado antes, los plásmidos son moléculas de ADN de doble cadena circular que se encuentran en
muchas bacterias y les confieren diferentes capacidades al contener genes que no tienen en sus cromosomas.

En general estos plásmidos naturales se pueden clasificar de la siguiente manera :

-Los que contienen genes de resistencia (Plásmidos de resistencia o R). Existen en la naturaleza hongos que producen
antibióticos con el fin de eliminar a las bacterias del entorno que compiten por nutrientes. Hay bacterias que obtuvieron la
forma de sobrevivir al tener plásmidos con genes de resistencia por ejemplo a la penicilina. Otras bacterias tienen
plásmidos que producen proteínas tóxicas como la colicina. Las bacterias que tienen estos plásmidos también tienen el
gen que les confiere inmunidad ante la colicina.

-Los que contienen enzimas degradativas (Plásmidos degradativos). Hay bacterias que en vez de defenderse de los
organismos con los que podrían cohabitar, tienen plásmidos que les permiten sobrevivir en nichos donde otros no pueden.
Tienen plásmidos que contienen secuencias que codifican para enzimas que pueden metabolizar substratos inusuales o
recalcitrantes como metales pesados o pesticidas.

-Los que contienen secuencias que les confiere virulencia (Plásmidos virulentos). Estos plásmidos contienen secuencias
que codifican para elementos que les permiten a las bacterias invadir otros organismos. Como ejemplo algunos plásmidos
le permiten a bacterias del género Salmonella o E. coli infectar el intestino de humanos o el plásmido Ti le permite a las
bacterias Agrobacterium infectar plantas. Aunque en la naturaleza, esto puede resultar perjudicial para el organismo
infectado, son herramientas que ahora se usan en biología molecular para poder introducir plásmidos a cierto tipo de
células. Tomado de: https://blog.addgene.org/plasmids-101-environmental-plasmids
De donde viene los plásmidos artificiales: Elaboró: Dra. Aida M. Zamora Contreras
Los plásmidos artificiales se comenzaron a construir en los años 70’s. Y se hicieron tomando fragmentos de utilidad de plásmidos
naturales como genes que confieren resistencia, sitios de corte de enzimas de restricción, orígenes de replicación.
A continuación, se muestran tres plásmidos naturales y algunas características que contienen. A partir de estos plásmidos se construyó
uno de los primeros plásmidos artificiales que fue el pBR322.
Sitios de
Plásmido Tamaño (Kpb) Restricción que Características
contiene
XhoI, EcoRI, PvuII,
pSC101 6.5 HincII, HindIII, Resistencia a tetraciclina.
BamHI, SalI

ColE1
Producción de Colicina E1, inmunidad a
(parecido al 8 EcoRI
colicina E1.
pMB1)

Producción de Colicina E1, inmunidad a

RSF2124 11 EcoRI, BamHI
colicina E1. Resistencia a ampicilina.

Balbás, Paulina, et.al. (1986) Plasmid vector pBR322 and its special-purpose derivatives-a review. Gene, (50) 3-40. Tomado de: https://www.researchgate.net/publication/20121016_Plasmid_vector_pBR322_and_its_special-
purpose_derivatives--a_review/link/5bd731e3299bf1124fab3915/download
De donde viene los plásmidos artificiales: Elaboró: Dra. Aida M. Zamora Contreras
El siguiente esquema resume como se fue desarrollando una estrategia de ingeniería genética hasta obtener el plásmido artificial
pBR322.
Origen de Resistencia a Resistencia a
replicación de tetraciclina de ampicilina de
pMB1 pSC101 RSF2124

Plásmido pMB-9 (plásmido

de tamaño pequeño)

Plásmido pBR312
(plásmido de gran tamaño)
Se elimina ADN no necesario

Plásmido pBR313
(plásmido de gran tamaño)
Se elimina ADN no necesario

Plásmido pBR322
(plásmido de 4.36kpb)
Balbás, Paulina, et.al. (1986) Plasmid vector pBR322 and its special-purpose derivatives-a review. Gene, (50) 3-40. Tomado de: https://www.researchgate.net/publication/20121016_Plasmid_vector_pBR322_and_its_special-
purpose_derivatives--a_review/link/5bd731e3299bf1124fab3915/download
Los primeros plásmidos artificiales: pBR322 Elaboró: Dra. Aida M. Zamora Contreras
• Uno de los primeros plásmidos artificiales creados para funcionar como
herramientas de biología molecular fue el pBR322 que es una quimera de varios
plásmidos bacterianos naturales.
• pBR322 fue uno de los primeros ampliamente utilizado E. coli para clonación de
vectores.

• Creado en 1977 en el laboratorio de Herbert Boyer en la Universidad de California

en San Francisco, que fue nombrado con las iniciales de los investigadores
postdoctorales que lo desarrollaron. La p significa "plásmido" y BR para "Bolívar"
y "Rodríguez“, mexicanos.

• pBR322 tiene 4361 pares de bases de longitud y alberga el origen de replicación

del plásmido pMB1, un pariente cercano del plásmido ColE1.

• pBR322 contiene también el gen de resistencia a la ampicilina (AmpR), el TetR gen

que codifica para una proteína de resistencia a tetraciclina.

• pBR322 contiene el gen que codifica para la proteían Rop, que es un restrictor del
número de copias del plásmido, por lo que es un plásmido que se puede replicar
con baja eficiencia.
• Su sitio de clonación múltiple no está tan bien definido como el de sus sucesores.
• Su función principal es de plásmido de clonación.
Los primeros plásmidos artificiales: pUC Elaboró: Dra. Aida M. Zamora Contreras
• pUC19 es un plásmido creado en la Universidad de California a inicios la década de los 90’s.
•
• P: Plásmido
• UC: Universidad de California

• Es un ADN de doble cadena circular y tiene 2686 pares de bases.

• pUC19 es uno de los plásmidos más utilizadas como vector recombinante, y puede distinguirse de los no recombinantes con diferencias de color de
colonias en medios de cultivo.

• Es un sucesor del plásmido pBR322 en donde se cambió el gen TetR por el lacZ que es el gen que codifica para la enzima b-galactosidasa, la cual
hidroliza a la lactosa en glucosa y galactosa.

• En este plásmido ya se diseñó un sitio de clonación múltiple más definido y con más sitios corte de enzimas de restricción. Siete codones del gen lacZ
están modificados para lograr insertar el SCM, pero se eligieron de tal forma que no se afecte la estructura y funcionalidad de la b-galactosidasa.

• El SCM se encuentra dentro de la secuencia del gen lacZ, por lo que, si el gen se logra insertar, la enzima b-galactosidasa no se producirá.

• Al plásmido pUC se le eliminaron varias zonas innecesarias del pBR322 para hacerlo más pequeño y más fácil de transformar en bacterias, ya que este
tiene 2686pb cuando está vacío.

• También se modificó su origen de replicación para hacer que su replicación sea más eficiente y por lo tanto se obtengan más número de copias dentro
de la célula.

• La característica más novedosa fue que tiene un sistema de inducción de la expresión de su inserto basado en el OPERÓN LAC.

• Por lo que además de ser un plásmido de clonación, puede usarse como plásmido de expresión.
Los primeros plásmidos artificiales: pUC Elaboró: Dra. Aida M. Zamora Contreras

En el plásmido pUC12, no se
incluye el operón lac completo,
sino los elementos necesarios
para favorecer una expresión
mediante inducción.
-Promotor
-Operador
-Gen lacZ

Gen lacZ
-El promotor del regulador y gen
Gen de resistencia a Ampicilina AmpR
de LacI serán los que la bacteria
Promotor del operón lac
E. coli ya tiene en su genoma.
Origen de replicación

Operador o sitio de unión del represor LacI (LacR)

-No se incluyen los otros dos
Sitio de clonación múltiple que sustituye algunos
genes del operón ya que no son codones de lacZ
necesarios para la expresión del
inserto.
Modificado de: https://bocascientific.com/standard-cloning-vector-puc18-p-773.html
Operón Lac Elaboró: Dra. Aida M. Zamora Contreras
• En las bacterias que tengan este operón en su genoma como E. coli, la
producción de la enzima b-galactosidasa está regulada mediante el
operón lac.
• Un operón es una serie de genes que están regulados bajo la expresión
de un mismo promotor y e transcriben de forma policistrónica.
• El operón está compuesto de los siguientes elementos:
• Promotor lac: es el promotor que rige la expresión de los tres genes que componen el
operón y es un promotor inducible, es decir que requiere de algún mecanismo molecular
para favorecer la expresión de sus genes.
• Genes: lacZ, lacY y lacA que codifican para las enzimas b-galactosidasa, Permeasa y
Transacetilasa respectivamente; todas involucradas en el ingreso de lactosa a la célula y su
metabolismo.
• Operador: es una región (secuencia) que se encuentra entre el promotor lac y los genes y
sirve para regular la expresión del operón.
• Regulador: codifica para la proteína LacI, que tiene afinidad por el operador.
• Promotor del regulador: es el promotor que rige la expresión del regulador y es un
promotor constitutivo, es decir que siempre expresa a su gen.

• COMO FUNCIONA EL OPERADOR:

1. La enzima RNA polimerasa se une al promotor del regulador para
Tomado de: https://www.nature.com/scitable/topicpage/operons-and-prokaryotic-gene-regulation-992/#
expresarlo y producir al inihibidor LacI.
2. LacI se une al operador por lo que le estorba a la RNA polimerasa unida
al promotor lac para expresar sus tres genes.
3. Cuando se introduce lactosa a la célula, esta funciona como atrayente 5. Las tres enzimas se empiezan a producir y la lactosa a metabolizar.
del inhibidor LacI, el cual es más afín a la lactosa que al operador. 6. Si más lactosa no se introduce al medio, esta dejará de atraer al
4. El operador se libera y la RNA polimerasa puede empezar a transcribir inhibidor, ya que será metabolizada por la b-galacotosidasa y entonces
el policistrón de los genes lacZ, lacY y lacA. se volverá a inhibir el operón.
Los primeros plásmidos artificiales: cómo se usa Elaboró: Dra. Aida M. Zamora Contreras
el operón lac en el plásmido pUC
-Como ya se mencionó, el inductor del operón lac es la lactosa.
-La forma de saber que el operón lac está activo es porque la lactosa se está hidrolizando en glucosa y galactosa por la enzima b-
galactosidasa.
-POR OTRO LADO, EL OBJETIVO DE LA PRESENCIA DEL SCM DENTRO DEL MARCO ABIERTO DE LECTURA DEL GEN lacZ ES QUE, SI
LA INSERCIÓN DEL GEN DE INTERÉS SE LLEVA A CABO, LA SECUENCIA DE lacZ SE INTERRUMPE POR LO QUE LA b-
GALACTOSIDASA NO SE EXPRESA Y POR LO TANTO NO HAY HIDRÓLISIS DE LACTOSA. SI NO HAY INSERCIÓN DEL GEN DE
INTERÉS EN EL SCM, LA SECUENCIA DE lacZ SE MANTIENE INTACTA Y LA b-GALACTOSIDASA SE EXPRESA Y PUEDE HIDROLIZAR A
LA LACTOSA.
-Sin embargo, ninguna de esas moléculas tiene alguna característica que permita visualizar fácilmente en el medio que la
hidrólisis se está llevando a cabo.
-Por lo que se desarrollaron moléculas análogas a la lactosa que pueden por un lado activar al operón lac y además dar una
coloración que permita diferenciar cuando si la enzima b-galactosidasa.
-El isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido o IPTG es una molécula que es afín al regulador LacI pero no es metabolizable por la b-
galactosidasa por lo que puede inducir el operón pero no se requiere estar alimentando al cultivo ya que no se agota.
-El 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido o X-gal es una molécula que no es afín al regulador LacI pero sí es
metabolizable por b-galactosidasa. Cuando es hidrolizada a galactosa y 5-bromo-4-cloro-3-hidroxindol. Este último es oxidado a
5,5'-dibromo-4,4'-dicloro-índigo, que es un compuesto azul insoluble. Este color es claramente observable en las colonias que
crecen.
Los primeros plásmidos artificiales: cómo se usa Elaboró: Dra. Aida M. Zamora Contreras
el operón lac en el plásmido pUC

IPTG, molécula que activa o induce al X-gal, molécula que no activa o induce al operón
operón lac de forma artificial al lac pero que, al adicionarlo de forma artificial a
adicionarlo en un cultivo, pero no es un cultivo, es metabolizable por b-galactosidasa
metabolizable por b-galactosidasa. y genera una coloración azul en las colonias.

Lactosa, molécula que activa o induce al

operón lac de forma natural dentro de las
bacterias que lo contengan.
Placa de medio LB en donde se adicionó ampicilina, IPTG y X-gal.
-Sólo las bacterias que tengan plásmido, vacío o con inserto, crecerán en la aplica
debido a la selección de la ampicilina.

-Las bacterias que tengan el plásmido vacío, tendrán la secuencia del gen lacZ intacta,
debido a la presencia del IPTG, se expresará la enzima b-galactosidasa y ésta
hidrolizará al X-gal por lo que se generará un color azul.

-Las bacterias que tengan el plásmido con el inserto, tendrán interrumpida la

secuencia del gen lacZ, por lo que ya no se expresará la b-galactosidasa. El X-gal
entonces no será hidrolizado y no se generará el color azul, y estas colonias
permanecen del color crema original. Por otro lado, debido a la presencia del IPTG, se
expresa la proteína que sea codificada por el gen de interés que se haya insertado.

-POR LO TANTO, LAS COLONIAS DE INTERÉS SON LAS DE COLOR CREMA.

Los primeros plásmidos artificiales: Familia de Elaboró: Dra. Aida M. Zamora Contreras
plásmidos pBlueScript (pBS)
• Son plásmidos derivados del pUC19 y comercializados por la empresa Stratagene.

• Tienen todos los elementos del pUC19 más algunas mejoras.

• Son ejemplo de una combinación entre plásmidos y fagos, por lo tanto, la obtiene un lugar dentro
de la categoría de los vectores conocidos como fagémidos.

• Contienen el origen de replicación f1 para poder generar una secuencia de cadena sencilla y poder
usarlos para empaquetarse en un fago, con la ayuda de otro fago empaquetador.

• Contienen el gen lacZ y el promotor y operador lac por lo que pueden ser inducibles mediante IPTG
y hacer la selección entre transformantes y recombinantes por el color de las colonias (blue
screening, de ahí el nombre del plásmido).

• Adicionalmente tienen los promotores bacterianos T3 y T7 para poder realizar transcripción in vitro
y generar cadenas de ARN mensajero en microtubos adicionando el plásmido y la ARN polimerasa
adecuada.

• Además, tiene el gen de resistencia a ampicilina para selección de transformantes.

• Tiene el origen de replicación bacteriano ColE1 que tiene alta eficiencia en replicación por lo que es
un plásmido que genera muchas copias dentro de las células.
• Son cuatro miembros de la familia pBlueScript: KS (+), KS(-), SK(+), SK(-).
Familia de plásmidos pBlueScript (pBS) Elaboró: Dra. Aida M. Zamora Contreras
El término SK y KS se refiere a los sitios de enzimas de restricción que tienen en los extremos del SCM: SacI y KpnI.
Los plásmidos SK tiene a SacI del lado del promotor lac y a KpnI hacia el final del gen lacZ.
Los plásmidos KS tienen a KpnI del lado del promotor lac y a SacI hacia el final del gen lacZ.
Los plásmidos positivos (+) tienen el origen de replicación f1 en la cadena que codifica a lacZ.
Los plásmidos negativos (-) tiene el origen de replicación f1 en la cadena complementaria a la que tiene codificado al gen lacZ.

pBluescript II Phagemid Vectors. Instruction Manual. Revisión A.01. Obtenido de: https://www.chem-agilent.com/pdf/strata/212205.pdf
Otros elementos funcionales en un plásmido: Elaboró: Dra. Aida M. Zamora Contreras
ANTIBIÓTICOS
Aunque Ampicilina es el antibiótico más
comúnmente utilizado en biología molecular como
marcador de selección en bacterias, existen otros
que se usan con el mismo fin o para seleccionar
transformantes en otro tipo de células. Se
muestran algunos ejemplos, su clasificación,
mecanismo de acción y concentración de uso
sugerida.

https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition?_ga=2.9122870.2013504827.1606805728-1851023619.1606805728
Otros elementos funcionales en un plásmido: Elaboró: Dra. Aida M. Zamora Contreras
ORÍGENES DE REPLICACIÓN Expresión de RNAII que hibrida
con el Ori. RNAsaH degrada el
-El origen de replicación original RNAII y funcionan como
de pMB1 que incluye el sistema primer.
de la proteína rop es el primero
utilizado en plásmidos artificiales.
-El plásmido pUC tiene una
versión mutada de este Ori pero
Expresión de RNAI. Se hibrida
existen otras versiones que se con RNAII y evita la
fueron añadiendo a los siguientes degradación por RNAsaH. Rop
plámidos que permiten controlar (Represión of primer) estabiliza
el número de copias dentro de la el dúplex
célula.

RNAI y -pUC no expresa

Rop rop y tiene 2
RNAII mutaciones en
RNAI que debilitan
hibridación.

RNAI y -ColE1 es de fago y

Rop permite
RNAII replicación de
https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-
3rd-edition?_ga=2.9122870.2013504827.1606805728-
ssDNA
1851023619.1606805728
Otros elementos funcionales en un plásmido: Elaboró: Dra. Aida M. Zamora Contreras
PROMOTORES PROCARIONTES
-A continuación, se muestran
promotores que se pueden
encontrar en plásmidos que
estén diseñados para expresar
algún gen en bacterias.

https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition?_ga=2.9122870.2013504827.1606805728-
1851023619.1606805728
Otros elementos funcionales en un plásmido: Elaboró: Dra. Aida M. Zamora Contreras
PROMOTORES EUCARIONTES
-A continuación, se muestran
promotores que se pueden
encontrar en plásmidos que
estén diseñados para expresar
algún gen en células eucariontes;
ya sea levaduras, plantas, líneas
celulares derivadas de insectos o
mamíferos.
CONTINÚA EN LA SIGUIENTE
PÁGINA…
Otros elementos funcionales en un plásmido: Elaboró: Dra. Aida M. Zamora Contreras
PROMOTORES EUCARIONTES

https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-
edition?_ga=2.9122870.2013504827.1606805728-1851023619.1606805728
Otros elementos funcionales en un plásmido: Elaboró: Dra. Aida M. Zamora Contreras
PROTEÍNAS FLUORESCENTES
-Las proteínas fluorescentes son herramientas muy útiles en biología
molecular, ya que permiten entre otras cosas identificar transfectantes y/o
recombinantes después de un experimento de transformación/transfección
celular.

-La proteína verde fluorescente (GFP) por sus siglas en inglés, aislada de la
medusa Aequorea victoria, es la más utilizada. La ingeniería genética ha
permitido mutar algunas bases del sitio que codifica para “el fluoróforo”,
cambiando de aminoácidos y por lo tanto produciendo diferentes colores en
la gama de azules, verdes y amarillos principalmente. Los colores en la
gama de los rojos se obtienen muchas veces, con una proteína diferente.

-La tabla muestra en cual longitud de onda son visibles los colores y, por lo
tanto, la combinación de proteína y tipo de fuente de excitación (lámpara)
para la proteína para que sea visible.

https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition?_ga=2.9122870.2013504827.1606805728-1851023619.1606805728
Otros elementos funcionales en un plásmido: Elaboró: Dra. Aida M. Zamora Contreras
PROTEÍNAS FLUORESCENTES
-La primera tabla muestra las posiciones
exactas del aminoácido mutado y por cual fue
modificado para obtener el nuevo fluoróforo
en la proteína GFP.

-La segunda tabla muestra la función o

fenotipo observado por cada mutación en
GFP.

https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition?_ga=2.9122870.2013504827.1606805728-1851023619.1606805728
Otros elementos funcionales en un plásmido: Elaboró: Dra. Aida M. Zamora Contreras
TAGS (etiquetas)

-Los “tags” o etiquetas son secuencias que se codifican fusionadas

con el gen que se desea expresar. Es decir que se colocan uno
detrás del otro sin codón de paro intermedio, para poder expresar
todo en el mismo transcrito.

-Entre algunas funciones que puede tener un tag son:

-Purificación de la proteína que se expresa
fusionada,
-Detección de la proteína fusionada,
-Solubilización de la proteína fusionada,
-Localización subcelular de la proteína fusionada,
-Protección contra proteasas, como inhibidor, entre otras.

-La tabla muestra ejemplos de algunos “tags”. Incluye el nombre, la

secuencia aminoacídica, su masa y función.

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Otros elementos funcionales en un plásmido: Elaboró: Dra. Aida M. Zamora Contreras
TAGS Y FLAGS (etiquetas)
-De los tags para purificación más utilizados están el
6xHisTag. Se trata de una serie de al menos 6 residuos de
aminoácido histidina colocados al inicio o final de la
proteína de interés.

-La histidina tiene alta afinidad por iones metálicos cuando

se encuentra en pH básico (8); por lo que al hacer pasar
la mezcla de proteínas por una columna con una resina
que contenga como ligandos iones metálicos como niquel,
zinc o cobalto, la etiqueta de histidinas tendrá afinidad por
ellos. Al acidificar el pH del medio, la histidina se protona,
se libera del ión metálico y se puede recuperar.

-El tag normalmente ya viene codificado en diferentes

vectores muy utilizados y se coloca del lado 5’ o 3’ del gen
que codifica la proteína que se desea expresar y purificar,
cuidando de mantener el mismo marco de lectura y sin
codones de paro intermedios.

-Alternativamente, el HisTag se puede integrar a la

secuencia del gen mediante PCR, incluyendo la secuencia
de histidinas en alguno de los cebadores. https://en.wikipedia.org/wiki/Polyhistidine-tag#/media/File:His-tag.png
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TAGS Y FLAGS (etiquetas)

-Otra etiqueta de purificación común es la de glutatión S

transferasa (GST). Se trata de una enzima que igualmente
se coloca antes o después de la proteína que se desea
purificar.

-La enzima GST tiene como sustrato al glutatión. Este se

coloca en una resina como ligando y cuando se pone en
contacto con la mezcla de proteínas, sólo la proteína de
interés que tiene fusionada la GST será purificada, al
interactuar con su sustrato.

-Para recuperar a la proteína, se adiciona más glutatión

libre al medio para que la GST lo prefiera sobre el ligando
inmovilizado y se libere de la resina para recuperar a la
proteína que tiene fusionada.

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687914000706
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SECUENCIAS DE CORTE DE PROTEASAS

-Las secuencias de corte para proteasas son secuencias aminoacídicas que se colocan entre un tag y la proteína de interés,
con el objetivo de eliminar el tag una vez que ha cumplido su función. Por ejemplo, una vez que se ha purificado una
proteína usando una columna de níquel usando un 6xHisTag, si en la construcción se colocó una secuencia de corte de
enzima, por ejemplo, de trombina, la proteína de interés se puede liberar del 6xHisTag usando esa proteasa.

-La secuencia genética que codifica para el sitio de corte de trombina se coloca entre la secuencia genética del tag y del
gen, en el mismo marco de lectura y cuidando de no introducir codones de paro tempranos.

Codón de Codón de
inicio paro
CORTE DE -
5’ GEN DE INTERÉS TAG
-
PROTEASA 3’
Expresió
n
NH2- -
COO
Proteasa H
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Proteólis
is
NH2-
-
COO
H
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LINKERS (péptidos de unión) PARA PROTEÍNAS DE FUSIÓN

-Los “linkers” o péptidos de unión se utilizan las construcciones de

ADN recombinante para modificar o mejorar las características de una
quimera de proteínas.

-Una proteína quimérica es una proteína que no existe en la

naturaleza y que se construye con dos proteínas fusionadas o
dominios.

-Para unirlos, se colocan las secuencias genéticas que los codifican,

una delante de la otra, en marco y sin codón de paro intermedio. Sin
embargo, cuando se expresan, es necesario que exista distancia
entre ambos elementos de la quimera para que puedan estructurarse y
funcionar correctamente. Dicho espacio se proporciona con un
péptido de unión intermedio, que dependiendo de la función que se
necesite, será el contenido de aminoácidos.

-Si se requiere flexibilidad y distancia entre ambas proteínas o https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3726540/pdf/nihms-411484.pdf

dominios o se requiere que ambas interactúen, se usan suficientes

aminoácidos pequeños como glicina para dar espacio entre ellos.

-Si se requiere rigidez y espacio entre ambas partes se usan

aminoácidos que formen estructuras helicoidales o prolinas ya que es
un aminoácido rígido.