Ingenieria-genetica.

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Yasiraalozanoo

Biología

2º Bachillerato de Ciencias y Tecnología

San Severiano

Reservados todos los derechos.

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
 Ingeniería genética
1. ADN recombinante
La ingeniería genética es la rama de la genética que manipula el material genético de los organismos con el fin de
obtener a partir de su expresión productos específicos de utilidad para el ser humano.

La tecnología del ADN recombinante es el conjunto de técnicas y procedimientos de la ingeniería genética que permite
analizar y modificar el ADN. Esta se sirve de distintas herramientas moleculares y técnicas de manipulación del ADN para
conseguir la clonación molecular.

El ADN recombinante son nuevas combinaciones de segmentos de ADN que se han obtenido mediante la unión de ADN
que provienen de diferentes fuentes biológicas de manera artificial

2. Herramientas moleculares
2.1 Endonucleasas de restricción o restrictasas
Son enzimas que poseen actividad endonucleasa, es decir, pueden inducir cortes en el interior del ADN. Estas no
escinden el ADN al azar, sino que lo hacen en secuencias específicas de nucleótidos, las cuales se denominan secuencias
diana. Las más utilizadas son aquellas que escinden la cadena por lugares separados del centro geométrico de la
secuencia diana, formando extremos cohesivos.

2.2 Vectores de clonación

Son moléculas de ADN que se usan como vehículo para introducir el ADN que interesa en la célula hospedadora, en la
cual se replicará y expresará. Estos tienen las siguientes características:

1. Son de pequeño tamaño

2. Poseen un origen de replicación que permite replicarse dentro de la célula hospedadora
3. Cuentan con marcadores de selección que permiten verificar su presencia en las células hospedadora
4. Presentan secuencias diana únicas para al menos una enzima de restricción
5. Tienen genes con funciones indicadoras en lo que se ubican las secuencias diana, por ello cuando el gen
deseado se introduce en las secuencias diana, el gen indicador queda interrumpido

tipos de
vectores

vectores en vectores en
procariotas eucariotas
Plásmidos: Bacteriófabo lambda: Vectores en levaduras: Vectores en plantas:
pequeñas moleculas de El ADN de este es muy versátil debido a se usan los plasmidos propios de se usan los procedentes del virus
ADN circular propias de sus extremos cohesivos (region COS). este tipo de organismo y los mosaico del tabaco y el Ti de la
Gracias a ello se puede integrar de cromosomas YAC bacteria agrobacterium tumefaciens
las bacterias
forma reversible en EcoRi

Vectores en animales:
Cósmidos: se usan los derivados del ADN
Se trata de plásmidos artificiales que viral. los mas habituales son los
reunen las caracteristicas de los retrovirus o papilomavirus entre
plasmidos bacterianos y las regiones otros
COS

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 3. TÉCNICAS DE MANIPULACION DEL ADN
3.1 Hibridación del ADN
El objetivo de la hibridación del ADN es localizar el fragmento de ADN que interesa en el conjunto total del ADN del
organismo para su posterior aislamiento, clonación o manipulación. Se basan en el apareamiento específico de las bases
nitrogenadas

HIBRIDACION DE COLONIAS

1. Cultivo de las posibles células portadoras del gen que se desea rastrear en placas de cultivo hasta que se formen
las diferentes colonias
2. Transferencia de las colonias a un filtro de nitrocelulosa
3. Lisis de las colonias del filtro y desnaturalización de su ADN
4. Incubacion del filtro en una bolsa de hibridación junto a una solución tampón y una sonda de ADN de cadena
sencilla marcada radiactivamente. Durante la incubación, la sonda forma un hibrido de doble cadena con las
secuencias complementarias del filtro
5. Se lava el filtro para eliminar el exceso de sonda y aplicación sobre una película de rayos X. Después se compara
la posición de las manchas en la película con la posición de las colonias en la placa de cultivo de partida, así se
identifica las colonias que tienen el gen de interés.

HIBRIDACION DE SOUTHERN

1. Fragmentación del ADN mediante el uso de enzimas de restricción y posterior separación electroforética de los
fragmentos
2. Desnaturalización del ADN dentro de gel de agarosa en fragmentos de cadena sencilla
3. Transferencia del ADN a un filtro de nitrocelulosa, para lo que se coloca el gel con el ADN desnaturalizado sobre
una esponja parcialmente sumergida en una cubeta con una disolución tampón. Sobre el gel se pone un filtro
que se cobre con hojas de papel secante y un peso. La solución tampón al pasar por el gel, los fragmentos de gel
se transfieren al filtro
4. Hibridacion de los fragmentos de ADN del filtro con una sonda radiactiva, mediante incubación dentro de una
bolsa hermética. Solo formarán híbridos aquellos fragmentos de ADN que sean complementarios a la secuencia
de nucleótidos de la sonda
5. Lavado del filtro para eliminar el exceso de sonda para su aplicación sobre una película de rayos X
6. Revelado de la película, de tal modo que las bandas en las que ha habido hibridación se visualizan como
manchas. Estos fragmentos se extraen posteriormente

3.2 La reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Esta técnica sirve para la amplificación del ADN. Se lleva a cabo de forma automática en unos termocicladores

1. Desnaturalización: se eleva la tª a 98oC, para separar las cadenas de ADN.

2. Hibridación de los cebadores: los oligonucleótidos que servirán como cebadores se hibridan con las secuencias
de los extremos 3’ de las dos cadenas separadas del molde
3. Elongación de los cebadores: se incuban a una tª de entre 68 y 72oC, en presencia de la ADN polimerasa y los
cuatro dNTP, lo que permite a la ADN polimerasa sintetizar las cadenas complementarias a cada hebra molde a
partir de los cebadores
4. Amplificación exponencial: cada molécula de ADN de doble cadena sometida a varios ciclos de replicación se
amplifica exponencialmente hasta obtener millones de copias.

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 3.3 Secuenciación del ADN
SECUENCIACIÓN DE SANGER

Permite establecer la secuencia completa de un fragmento de ADN de gran tamaño

1. Síntesis de un cebador marcado radiactivamente e hibridación de este con el ADN de cadena sencilla que se
desea secuenciar
2. Adición de ADN polimerasa, los dNTP y los nucleótidos terminadores los cuales carecen del OH de su extremo
3’, en muy baja proporción y marcado cada uno con fluorescencia.
3. Extensión de los cebadores por adicion de dNTP en su extremo 3’OH. Cuando un ddNTP se une a la cadena en
crecimiento detiene la síntesis, ya que carece del extremo 3’OH al que hay que añadir un nuevo nucleótido,
transformándose en el ultimo nucleótido de la cadena.
4. Separacion electroforética de los fragmentos en función de su tamaño. Al revelar el gel de las posiciones de las
bandas de migración electroforética se deduce la secuencia de nucleótidos del ADN de forma que la banda
correspondiente al fragmento de menor tamaño y que mas lejos ha migrado, indica el primer nucleótido de la
secuencia.

4.Clonación molecular
1. ELECCION DE UN VECTOR: este vector lleva un marcador de selección, un gen indicador y una secuencia diana dentro
del gen indicador

2. ELECCION DE UN FRAGMENTO DE ADN: se escoge el gen que se desea clonar, se extrae el ADN a través de la lisis de
la célula y el núcleo y se aisla el ADN y se fragmenta en trozos grandes mediante endonucleasas de restricción

3. AUMENTO DE LA CANTIDAD DE ADN: los fragmentos obtenidos se amplifican mediante PCR

4. FABRICACIÓN DEL ADN RECOMBINANTE: los fragmentos de ADN se mezclan con vectores cortados previamente con
la misma endonucleasa de restricción, de tal modo que poseen idénticos extremos cohesivos. Los fragmentos que se
liguen con los vectores darán lugar a vectores recombinantes, entre los cuales alguno llevará el gen que se desea clonar

5. INSERCIÓN DEL ADN RECOMBINANE EN EL HOSPEDADOR: los vectores recombinantes se mezclan con las células
hospedadoras como por ejemplo la bacteria escherichia coli. Estas pasan a llamarse bacterias transformadas

6. CULTIVO DE LAS CÉLULAS RECOMBINANTES: se siembran en un medio de cultivo que permita identificar las colonias
que proceden de bacterias transformadas con el vector recombinante. Las que no lo posean mueren, las que contienen
un plasmido no recombinante poseen una característica concreta y las que lo poseen otra característica que las
identifica

7. SELECCIÓN DE LA COLONIA PORTADORA DEL GEN QUE INTERESA: mediante las técnicas de hibridación en colonias
se localizan las colonias portadoras del ADN recombinante con el gen que se desea clonar. Estas se cultivan con el fin de
amplificar las copias del ADN recombinante

8. PRODUCCIÓN DE LA PROTEÍNA RECOMBINANTE: las células recombinadas con el gen que interesa se replican, de
modo que se forma una población de células idénticas. Estas células pueden expresar el gen recombinante y producir la
proteína recombinante

5. Aplicaciones de la tecnología del ADN recombinante

OBTENCIÓN DE GENOTECAS

Estas suponen una fuente directa de genes que se seleccionan fácilmente mediante técnicas de hibridación de colonias

1. Se fragmenta el genoma completo del organismo con restrictasas

2. Se amplifican los fragmentos resultantes mediante PCR
3. Se fabrica el ADN recombinante usando los fragmentos anteriores
4. Se insertan los vectores recombinantes en bacterias
5. Se cultivan todas las bacterias obtenidas

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 OBTENCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES como por ejemplo la insulina

OBTENCIÓN DE MICROORGANISMOS RECOMBINANTES los cuales tienen capacidad de formar polímeros

biodegradables, combustibles, etc. Son principalmente usados para eliminar contaminantes

ESTUDIOS DE FILIACION EN MEDICINA FORENSE los cuales permiten obtener la huella genética. Se analizan varias
muestras de ADN para determinar el grado de similitud.

OBTENCIÓN DE ORGANISMOS TRANSGÉNICOS

La transgénesis es una técnica que permite introducir en el genoma de un organismo eucariota ADN foráneo
procedente de una especie distinta de manera que afecte a todas sus células. Se forma un organismo transgénico y el
gen involucrado se denomina transgen.

En animales es usada principalmente para la producción de proteínas humanas o para la obtención de órganos
histocompatibles con los humanos.

En plantas las aplicaciones son principalmente la resistencia a herbicidas, virus e insectos; incremento del rendimiento
fotosintético; retraso en la maduración de frutos; síntesis de productos de interés sanitario u obtención de plantas con
capacidad para fijar el nitrógeno atmosférico

DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES GENÉTICAS Y TERAPIA GÉNICA

La terapia génica consiste en localizar genes responsables de enfermedades para sustituirlos por genes sin anomalías,
llamados genes terapéuticos los cuales se transfieren a las células portadoras del gen mutado a través de vectores
construidos con las técnicas de ADN recombinante.

En seres humanos solo se realiza en células somáticas para modificar exclusivamente las células de la persona en las que
se actúa

6. Proyecto genoma humano

Conclusiones:

- El genoma humano contiene unos 3200 millones de pares de bases

- Incluye unos 25000 genes codificadores de proteínas

- Solo el 2% son exones

- El 25% son intrones

- Las secuencias repetitivas representan el 60%

- Las diferencias de composición de los exones son relativamente constantes

Se puede conseguir:

- Conocer con detalle las bases genéticas del desarrollo embrionario y la expresión y regulación génicas

- Crear herramientas de diagnóstico eficaces y diseñar tratamientos nuevos para enfermedades con componentes
genéticos

- Desvelar las claves de la evolución

- Desarrollar medicina preventiva

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