TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO

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UD.5 TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN

DE POBLACIONES CELULARES

-Técnicas de separación celular

-La citometría de flujo
-Funcionamiento del citómetro de flujo
-El análisis de los datos obtenidos por citometría
-Aplicaciones de la citometría de flujo
-Otras técnicas de separación celular
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1. LAS TÉCNICAS DE SEPARACIÓN CELULAR

Vamos a estudiar técnicas encaminadas a la preparación e

identificación de poblaciones celulares para fines diagnósticos y también
de investigación.
Fundamentalmente, veremos la citometría de flujo útil como técnica
de separación e identificación de poblaciones celulares y conocer su estado
de activación y funcionalidad midiendo la expresión de diferentes
marcadores.
Veremos también otras técnicas de separación utilizados cuando no
es posible desarrollar la citometría de flujo.

2. LA CITOMETRÍA DE FLUJO

La citometría de flujo es una técnica de análisis de poblaciones

celulares en suspensión.
Su mayor aplicación es la caracterización de las distintas
subpoblaciones de linfocitos. Técnica con alto poder resolutivo que permite
analizar grandes cantidades de células de un modo multiparamétrico, pero
con el inconveniente de que sólo se puede aplicar a células en suspensión.

2.1 EL FUNDAMENTO DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO

Técnica que consiste en pasar una suspensión de células u otras

partículas incluidas en un flujo de líquido isotónico a pasar, alineadas de
una en una por delante de uno varios detectores que recogen y miden sus
características físicas y/o químicas, al mismo tiempo que se las ilumina con
un haz de luz, normalmente un láser.
Las características analizadas por la citometría de flujo son el reflejo
de dos grupos de parámetros:
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• Los parámetros derivados de la luz dispersada cuando ésta
incide sobre una célula. Tamaño y granularidad.
• Los parámetros asociados con la luz generada como
consecuencia de la presencia de fluorocromos sobre la célula o
partícula, de forma natural (autofluorescencia) o bien unidos a
ella de forma artificial (anticuerpos marcados).

Las mediciones se realizan sobre cada célula o partícula

individual.
Las señales convertidas en impulsos eléctricos son enviadas a un
ordenador que las integrará, y la frecuencia de las poblaciones
marcadas aparecerá en un gráfico tridimensional.
Algunos modelos de citómetros, como el separador de células
activado por fluorescencia realizan un análisis multiparamétrico de
las células y además las aisla mediante una técnica denominada FACS.
Estas subpoblaciones aisladas pueden ser utilizadas en pruebas
funcionales.
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Algunos de los parámetros medibles por citometría de flujo

2.2 PREPARACIÓN DE SUSPENSIONES CELULARES

Requisitos que debe reunir una suspensión celular para ser analizada
por citometría de flujo:
• Ser representativa del tejido que es objeto de estudio
• Ser de alta calidad, con pocos agregados y restos y bajo coeficiente de
variación.
• Que preserve las características celulares.
• Que contenga suficiente muestra celular.

Se pueden preparar a partir de la disgregación de material fresco.

En materiales sólidos, existen diversos métodos de disgregación
(mecánicos o enzimáticos) que pueden producir alteraciones de las
características celulares.
Hay que tener en cuenta estas alteraciones y escoger un método de
preparación que no afecte a la población celular que se estudia.
Los métodos más habituales se basan en el tamaño y densidad celular
mediante centrifugación.
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3. FUNCIONAMIENTO DEL CITÓMETRO DE FLUJO

3.1 EL CITÓMETRO DE FLUJO

La suspensión de células se conduce de forma mecánica hasta una

sección que la convierte en una fina corriente de fluido que se dispersará
en gotitas microscópicas, en las que incidirá la luz.
Cada célula dispersa la luz en dos direcciones determinando así dos
parámetros físicos de las células:
Forward scattering (FSC). Dispersión frontal a 0º. Mide el tamaño de la
célula.
Side scattering (SSC). Dispersión lateral a 90º. Corresponde a la
complejidad superficial y a la granularidad de la célula.

Ventajas del citómetro de flujo

Objetividad, elevada sensibilidad, velocidad de análisis y posibilidad
de realizar análisis multiparamétricos sobre una célula.

Desventajas del citómetro de flujo

Elevado coste de instrumentación e imposibilidad de visualizar las
células analizadas.

Si las células han estado incubadas con anticuerpos específicos

marcados que emiten fluorescencia, fluorocromos, se excitarán con láser y
emitirán luz.
Cada fluorocromo tiene una longitud de onda de excitación y de
emisión. Los más utilizados son la fluoresceína y la ficoeritrina. Ambos
pueden ser utilizados con un láser de 488 nm.
Los citómetros modernos permiten múltiples combinaciones de
fluorocromos.
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Esquema de combinaciones de fluorocromos

La citometría de flujo nos permite la separación de las poblaciones

celulares mediante el separador de células activado por fluorescencia FACS,
que permite separar las células mediante la aplicación de carga eléctrica
momentánea.
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3.2 COMPONENTES DE LOS CITÓMETROS DE FLUJO

Los componentes básicos son:

Sistema hidráulico
Sistema de iluminación
Sistema óptico
Sistema electrónico
Sistema de adquisición y análisis de datos.

Sistema hidráulico
Conduce la suspensión celular a una velocidad constante y controlada
a través de la cámara de flujo o zona de detección, donde incide el haz de
luz.
Está formado por un capilar por el que pasa un líquido isotónico que
envuelve la suspensión:
Permite la formación de un flujo laminar sin turbulencias.
Las células viajan centradas y una tras otra en el chorro de inyección.

Fluidos del sistema

Sistema de iluminación

Proporciona el haz de luz que ilumina la muestra, generalmente un

láser.
La luz emitida es una mezcla de longitudes de onda.
Las longitudes de onda se definen por la energía emitida por el electrón
al caer de una órbita más alta a otra más baja.
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Las longitudes de onda más utilizadas (nm): 488, 568, 630 y 647. Los
emisores láser más utilizados son los de argón con luz monocromática de
488 nm.

Sistema óptico

A medida que las células o las partículas van atravesando el haz

luminoso, el sistema detecta la luz dispersada y selecciona la fluorescencia
emitida.
El sistema recoge la luz emitida por las células:
La fluorescencia
Señal de luz a 90 grados, relacionada con la refractariedad y las
estructuras celulares.
Dispersión frontal de la luz, relacionada con el tamaño celular.

Además de las lentes y detectores, el citómetro contiene filtros que

sirven para eliminar y separar la luz recogida.
Filtros coloreados o de absorción
Band pass: dejan pasar un rango de longitudes de onda.
Short pass: dejan pasar por debajo de una longitud de
onda determinada.
Long pass: dejan pasar por encima de una longitud de
onda determinada.
Filtros dicroicos o de interferencia, reflejan la luz.
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Sistema electrónico

Detecta y amplifica la respuesta de las células. Transforma las señales

en forma digital y controla el proceso de separación celular.

Sistema de adquisición y análisis de datos

Permite la adquisición multiparamétrica, el análisis en tiempo real de

los datos y el análisis de las subpoblaciones seleccionadas.
Procesa la señal obtenida y proporciona la información estadística de
los datos, representándolos en forma de histogramas monoparamétricos o
biparamétricos.

3.3 CALIBRACIÓN Y PUESTA A PUNTO DEL CITÓMETRO

El citómetro para que funcione correctamente debe estar bien

calibrado. Este proceso consiste en la calibración del láser, control de
calidad diario y verificación de la alineación de cada láser respecto de la
celda de flujo.
Además de estas tareas realizadas por el personal del laboratorio es
necesario una calibración externa anual por personal técnico especializado.
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La calibración del láser…

Control de calidad diario

Verificación de la alineación de cada láser respecto a la celda de flujo

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3.4 MANTENIMIENTO PREVENTIVO DEL CITÓMETRO

Según las indicaciones del fabricante y los requisitos del laboratorio

es necesario la realización de verificaciones y controles determinados.

Procedimientos de mantenimiento

4. EL ANÁLISIS DE LOS DATOS OBTENIDOS POR CITOMETRÍA

Los citómetros de flujo analizan las suspensiones celulares a una

velocidad entre 500-1000 células/segundo.

4.1 EL ANÁLISIS DE LOS DATOS

Se basa en la obtención de los porcentajes de células fluo-

rescentes y de la media de intensidad de fluorescencia.

Los datos obtenidos se comparan entre las muestras problema y los

controles.
Para que un resultado sea válido estadísticamente, hay que repetir
los experimentos tres veces.
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Para analizar los resultados, se utilizan filtros para poder ob-
tener un resumen de los datos.
Información obtenida:
La concentración, en células o partículas por ml.
El porcentaje de células positivas y negativas para cada canal.
La intensidad media de fluorescencia.

4.2 LA PRESENTACIÓN DE LOS RESULTADOS

Los datos se pueden reflejar de manera numérica y también gráfica

mediante histogramas de frecuencias, diagramas de dispersión o
diagramas de contorno.
Los datos que obtenemos son:
Tamaño celular (FSC)
Complejidad o granulosidad celular (SSC)
Fluorescencia (FL)

Histogramas de frecuencia

Histogramas monoparamétricos: en estos histogramas se representa

en cada valor de X (intensidad de fluorescencia) el número de células que
emiten esa intensidad.
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Histogramas biparamétricos:
En el eje X se representa una fluorescencia y el eje Y otra

Diagramas de dispersión o dop-plots

Las células con características similares, en función de su tamaño o la
emisión de fluorescencia forman un grupo en un gráfico. Cada célula está
representada por un punto. Pueden ser biparamétricos o
monoparamétricos.
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Diagramas de contornos o contour-plots

Proporcionan una representación en 3D, X e Y además de la

altura la cual representa el número de células con una determinada
combinación de ambos parámetros.

5. APLICACIONES DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO

Esta técnica tiene muchas aplicaciones tanto en investigación como en

la rutina clásica.
Mediante citometría de flujo se pueden analizar:
A escala supracelular: organismos pluricelulares, esferoi-
des e hibridomas.
A escala celular: protoplastos vegetales, células animales, levadu-
ras y bacterias.
A escala subcelular: viriones, liposomas, cromosomas, or-
gánulos y núcleos.
A escala molecular: proteínas, ácidos nucleicos e inmunocomple-
jos.
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5.1 DETERMINACIÓN DE POBLACIONES CELULARES EN SANGRE

PERIFÉRICA.

Para identificar y clasificar las células se emplea la determinación de

antígenos mediante anticuerpos monoclonales (producidos por un solo
clon de linfocitos B) marcados con flourocromos.

Principales parámetros que se utilizan para la identificación

y caracterización de las células

Mediante esta técnica se pueden identificar el inmunofenotipo de

superficie o los antígenos intracelulares.
Inmunofenotipo de superficie: identifica subpoblaciones celulares.
Detección de antígenos intracelulares: requiere de técnicas de
permeabilización que preserven los epítopos que se quieren determinar.

La monitorización de las subpoblaciones linfocitarias tiene especial

relevancia es importante, por ejemplo, en el diagnóstico y clasificación de
inmunodeficiencias primarias, en la monitorización de enfermedades
primarias o en el seguimiento de trasplantes de médula ósea.
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• Para determinar los linfocitos T: se utiliza un anticuerpo
monoclonal anti-CD3. Las subpoblaciones de linfocitos T
cooperadores y citotóxicos se evalúan con anticuerpos
monoclonales anti-CD4 y anti CD-8, respectivamente.
• Para determinar los linfocitos B: se utiliza un anticuerpo
monoclonal anti-CD19.

Esquema del procedimiento de

Inmunofenotipado de células humanas

5.2 FENOTIPAJE DE LEUCEMIAS Y LINFOMAS

La citometría de flujo debido a su sensibilidad (0,001 %, detecta 1

célula entre 100000) es muy útil en la detección de enfermedad mínima
residual en las leucemias agudas en remisión para el diagnóstico precoz de
recaídas.
Tiene gran importancia en el estudio de síndromes linfoproliferati-
vos:
Permite un diagnóstico diferencial rápido entre una linfocitosis
reactiva y un proceso monoclonal.
El inmunofenotipo permite clasificar los síndromes linfopro-
liferativos en neoplasias de origen B, T y NK.
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Otro parámetro que se puede estudiar por citometría de flujo

es la expresión de las inmunoglobulinas citoplasmáticas (IgCit) de ca-
denas ligeras (κ y λ) o pesadas (IgA, IgD, IgG e IgM).
El estudio de las inmunoglobulinas citoplasmáticas puede ayu-
dar a establecer la ratio de células plasmáticas patológicas/sanas.

5.3 FENOTIPAJE DE OTRAS POBLACIONES CELULARES

Se puede realizar el inmunofenotipaje de superficie de cualquier

célula, marcando antígenos de su membrana con anticuerpos
monoclonales o policlonales conjugados con flourocromos.
La preparación de la muestra es mínima, en algunos casos se puede
necesitar, concentración celular, dispersión, disgregación o estimulación
celular.
Otras aplicaciones del inmunofenotipado de superficie:
• Detección de leucocitos activados en sangre periférica o en
preparaciones celulares estimuladas.
• Detección de aloanticuerpos y autoanticuerpos circulantes o
unidos a células.
• Diagnóstico de deficiencias en moléculas de adhesión.
• Identificación de basófilos circulantes y detección de degranula-
ción provocada por alérgenos.

5.4 CUANTIFICACIÓN DE MOLÉCULAS

Cuantificación de proteínas:
Se emplean microesferas con distintas intensidades de fluores-
cencia para detectar y cuantificar proteínas solubles.
Cada microesfera está recubierta de anticuerpos para
una proteína específica.
Permite detectar varias proteínas simultáneamente.
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Esquema de la técnica de cuantificación de moléculas

con microesferas recubiertas de anticuerpos

Los pasos de la técnica son:

1. Preparar las microesferas recubiertas de los anticuerpos
específicos de las proteínas que se quiere determinar en la muestra
problema.
2. Incubar las muestras problema y los controles para realizar la curva
patrón.
3. Incubar la mezcla de Ac de detección marcados con ficoeritrina.
4. Adquirir las muestras en el citómetro.
5. Analizar los archivos con el programa informático adecuado.

Cuantificación de anticuerpos:
Se pueden detectar anticuerpos frente a un patógeno determi-
nado.
Se pueden detectar diferentes anticuerpos (frente a diferentes
patógenos) simultáneamente.

Esquema de detección de anticuerpos utilizando microesferas

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El esquema básico para la realización de la técnica:
1. Preparar las microesferas recubiertas de los antígenos específicos.
2. Incubar las muestras problema y los controles para realizar la curva
patrón.
3. Incubar las muestras de sueros a la dilución adecuada con las micro-
esferas. Si hay anticuerpos específicos, se fijarán a los antígenos que
se encuentran tapizando las microesferas.
4. Lavar las microesferas.
5. Añadir el reactivo de detección conjugado con ficoeritrina.
6. Lavar las microesferas.
7. Adquirir las muestras en el citómetro.
8. Analizar los archivos en el programa informático adecuado.

6. OTRAS TÉCNICAS DE SEPARACIÓN

Es necesario tener en cuenta las propiedades de las células implicadas

(densidad, tamaño, estimulación frente a antígenos,…) para elegir la
técnica de separación adecuada.

6.1 PANNING PARA LINFOCITOS

Es un método sencillo que permite separar los linfocitos T de los B.

Se utilizan placas sensibilizadas con anticuerpos específicos de los
marcadores de superficie de las subpoblaciones que se quiere separar (por
ejemplo, anti-CD4 y anti-CD8).
Las células de interés podrán unirse a lo anticuerpos mientras que la
otra población podrá eliminarse mediante lavados.

Esquema de panning
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6.2 SEPARACIÓN CELULAR INMUNOMAGNÉTICA

Esta técnica permite:

Selección positiva: la población deseada es marcada magnética-
mente y aislada en la fracción celular retenida.
Selección negativa: eliminación de las células no deseadas mediante
marcado magnético y elución de la fracción que contiene la población
deseada no marcada.
Permite la separación manual o automatizada.
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6.3 SEPARACIÓN CON MICROESFERAS DE PLÁSTICO NO MÁGNÉTICAS

Se incuba la muestra en presencia de las microesferas adecuadas para

el tipo celular deseado. Las células deseadas se unen a las microesferas.
Se filtra la mezcla con un filtro que retiene solo las células unidas a las
microesferas.
Mediante un tampón, se liberan las células de las microesferas. Las
microesferas quedarán en el filtro y las células se recogerán en un tubo.

6.4 TÉCNICAS DE INMUNOTOXICIDAD

Se utiliza la capacidad lítica del complemento para eliminar las célu-

las no deseadas.
Se marcan las células no deseadas con anticuerpos monoclonales es-
pecíficos de marcadores de membrana.
Se añade complemento de conejo, que activará la vía alternativa (for-
mación del complejo antígeno-anticuerpo en la célula diana).
La depleción por complemento es una técnica rápida, barata y elimina
el 95-100 % de la población diana.
Las aplicaciones de esta técnica son:
La purificación celular y el enriquecimiento de poblaciones celulares.