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MR3 FIORELLA CAJÁN

• Método analítico por el que se mide la emisión de múltiples fluorescencias


y la dispersión de luz de células o partículas microscópicas, alineadas
mediante una corriente líquida laminar, cuando son presentadas de una en
una y a gran velocidad frente a una o múltiples fuentes de iluminación
• Rapidez
• Especificidad
• Elevada sensibilidad
• Análisis objetivo y reproducible
• INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE
• DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES
• ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS
• ANALISIS DE PARAMETROS FUNCIONALES
• Puede analizar un elevado número de partículas (1000 a más de 100.000
células) adquiridas en un corto período de tiempo (decenas de miles de
células por segundo)
• Realiza medidas cualitativas y cuantitativas de mas de 15 parámetros
simultáneamente y de cualquier célula o partícula suspendida desde 0,2
hasta 150 micras
• Con la citología convencional se obtienen valores medios de toda la
población celular.
• Con la CF se estudia por separado cada célula o partícula y se
obtiene información simultánea de varios parámetros así como de
la relación entre ellos.
• La utilización de triples y cuádruples marcajes antigénicos permite
un análisis multiparamétrico cualitativo y cuantitativo de
diferentes poblaciones celulares.
• Todo ello le confiere una alta sensibilidad y objetividad.
• Aporta criterios objetivos
• Apoya y perfecciona las clasificaciones morfológicas y define nuevas
entidades
• Es útil para:
• Identificar y definir células.
• La detección de anomalías genéticas debido al reconocimiento de fenotipos
aberrantes.
• El seguimiento de la enfermedad mínima residual (EMR) y el seguimiento de
los pacientes con terapias específicas
El punto de interrogación es
el núcleo del sistema. Allí es
donde el láser incide en la
muestra y el sistema óptico
recoge la luz difractada y la
fluorescencia.
Las células fluyen por un
conducto central que está
rodeado por otro conducto
de mayor diámetro que
transporta una disolución
salina a mayor velocidad.

En el punto de encuentro, el
fluido envolvente arrastra a
las células que van llegando
por el conducto interno, que
se hace más estrecho en su
extremo

El resultado final es que se


crea una hilera de células
que atravesarán el láser de
una en una.
La difracción frontal (o difracción de
Cuando el láser incide en la bajo ángulo) es la luz difractada hacia
célula, ésta difracta la luz en delante. Su intensidad es directamente
todas direcciones proporcional al tamaño de la célula.
Delante del detector hay una La luz difractada se cuantifica
barra que evita que la intensa luz mediante un detector que
del láser incida directamente convierte la intensidad en
sobre él. voltaje
La luz que llega al
detector se convierte en
un impulso de tensión

La magnitud del impulso es proporcional al tamaño de la célula.


La magnitud del impulso es proporcional al tamaño de la célula.
El histograma indica
el número de células
que presenta la
propiedad física
seleccionada o que
expresa el marcador
molecular de interés
Si no se aplica un umbral, la señal Aplicado un umbral, sólo se
mayoritaria corresponde a residuos detectan las señales que
celulares, bacterias o células pequeñas superan un valor determinado
La difracción lateral (o La difracción lateral es
difracción de ángulo elevado) provocada por los gránulos y
es la luz difractada hacia los depende de la complejidad
lados. interna de la célula.
La difracción lateral se mide en un detector colocado
perpendicularmente (a 90º) a la trayectoria del láser .
La difracción frontal (en función La difracción lateral (en función
del tamaño) parece indicar que de la complejidad) indica que hay
sólo hay una población de células. tres tipos de células.
Este histograma
refleja dos
parámetros. En el
eje X se representa
la difracción a bajo
ángulo y en el eje Y
la difracción a
ángulos elevados. El
número de células es
proporcional a la
densidad de puntos.
Emission
light
Mediante un sistema de filtros y
La fluorescencia se mide mediante
espejos se dirige la señal de
detectores colocados
fluorescencia hasta los detectores (se
perpendicularmente (a 90º) a la
pueden medir 3 ó 4 señales distintas en
trayectoria del láser
un mismo experimento)
Cuando la célula marcada atraviesa el láser,
se genera una señal de fluorescencia que llega
al detector y se convierte en un pulso de
tensión proporcional a la magnitud de la señal.
La excitación de los
dos fluoróforos se
lleva a cabo con láser
de una longitud de
onda de 480 nm

Cada fluoróforo emite


fluorescencia con
una longitud de onda
distinta: Alexa emite a
520 nm y la
Ficoeritrina emite a
580 nm
La gota se carga según el tipo de
La gota que contiene una célula fluorescencia que tenga la célula. La
se aproxima al punto de carga (positiva, negativa o nula)
interrogación determina a qué tubo se dirige la célula.
1.- Cada célula es analizada por el láser

2.- La boquilla vibradora crea gotas al final


del tubo. En cada gota hay una sola célula.

3.- A cada gota se le asigna un tipo de


carga, en función de la fluorescencia de la
célula que contiene.

4.- Las placas deflectoras atraen o


repelen a las células, que son recogidas
en distintos tubos según su carga
(positiva o negativa, mayor o menor).

5.- Se analizan las células recogidas para


comprobar que la selección ha sido
correcta.

6.- Las células recogidas se pueden


cultivar para obtener un mayor número de
ellas.
• Comprende 3 etapas:
• Fase precitometríca: diseño de protocolos, preparación de la
muestra, tinción con reactivos fluorescents.
• Fase de adquisición de la muestra y la recolección de los datos
• Fase de análisis de los datos recolectados
• Muestra: sangre total o médula ósea con anticoagulante (EDTA o
heparina) o suspensión celular de ganglio.
• Al adquirir la muestra se puede elegir la población total o seleccionar en
gráfico FSC/SSC una población específica.
• Se consideran los porcentajes de células positivas y la intensidad de
expresión.
• Se considera un marcador positivo cuando el porcentaje de células
positivas es superior al 20% referido al total de la población, por
ejemplo de linfocitos B (CD19+) o linfocitos T (CD3+)
• Se usa para detectar Ag en la superficie de las células utilizando AcMo
marcados con un fluorocromo.
• Para ello las células se marcan con Ac Mo conjugados con fluorocromos,
posteriormente se lisa la serie roja.
• Poner en un tubo un volumen de muestra (100-400ul)
• Añadir el AcMo (la cantidad dependerá del laboratorio)
• Mezclar e incubar durante 10-15 min a temperatura ambiente en oscuridad.
• Añadir 2 ml de solución lisante
• Agitar e incubar durante 10 min. a temperatura ambiente y en oscuridad
• Centrifugar a 300g. durante 5 minutos a temperatura ambiente, decantar el
sobrenadante.
• Resuspender el botón celular, Añadir 5 ml de PBS.
• Centrifugar a 300g. durante 5 minutos a temperatura ambiente
• Decantar el sobrenadante, resuspender el botón celular.
• Añadir 0.5-1 ml de PBS
• Leer en el citómetro
• El análisis se realiza en tres etapas:
• Identificación y selección de los parámetros a medir
• Identificación de subpoblaciones
• Caracterización de cada uno de los subgrupos identificados
• Existen programas informáticos con métodos de selección e
identificación basados en «ventanas de análisis
• Se colocan ventanas rodeando poblaciones
• Podemos comenzar por un gráfico por ejemplo: FSC frente SSC
• Se dibuja una ventana o región (A) rodeando la población de linfocitos.
• En los otros gráficos con otros parámetros aparecerán con los datos de
la gate de la región A
• Los gráficos posteriores pueden seleccionar esta población excluyendo el
resto de las poblaciónes
-Identificación de poblaciones de células

-Recuento de células

-Caracterización de poblaciones celulares

-Apoyo diagnóstico de leucemias y linfomas…y otras


patologías hematología/inmunología
-Identificación y cuantificación de la expresión de proteínas
mediante Ac-FL
-Proteínas de superficie y citoplasmáticas
-Multiparamétrico (>8 prot./célula)
-Rápido (103-104 células/segundo)
-Sensible: permite análisis de muchísimas células y muchas
moléculas a la vez
1. MARCADORES DE IDENTIFICACIÓN DE LINAJE
(EN TODOS LOS ESTADIOS MADURATIVOS).
2. MARCADORES que definan “ESTADIOS ADULTOS”
(COMPETENCIA FUNCIONAL).
3. MARCADORES ASOCIADOS A FUNCIONES ESPECÍFICAS
(reconocimiento antigénico; activación celular etc).

EXISTE UNA JERARQUÍA QUE DEFINE LOS DISTINTOS GRADOS DE DIFERENCIACIÓN


CELULAR
• Línea granulocítica: CD11b, CD13, CD15, CD16, CD33, CD65, CD117, MPOc
• Línea monocítica: CD11b, CD11c, CD14, CD36, LISOZIMAc
• Línea eritroide: glicoforina A, CD71
• Línea megacariocítica: CD41, CD42, CD61
• Línea B: CD10, CD19, CD22, CD79a
• Línea T: CD2, CD3c, CD4, CD7
• Línea NK: CD16, CD56
• Antígenos no específicos de línea: CD34, CD45, HLA-DR
• El gráfico CD45 vs SSC identifica de la mayoría de poblaciones normales en la médula ósea.
• Las células con CD45 fuerte, SSC bajo son linfocitos,
• Las con CD45 moderado, SSC alto son granulocitos y las que tienen más CD45 que los granulocitos, pero SSC más alta que
linfocitos son monocitos.
• Los monocitos también tienen más alta expresión de CD33 que los granulocitos
• Los glóbulos rojos nucleados tienen SSC bajo y débil a negativo CD45. Lo mismo ocurre con los debrís y los hematies no
lisados pero los glóbulos rojos nucleados tienen un CD71 más fuerte
• La población de granulocitos es heterogénea con respecto a la expresión CD45. Esta variación en el CD45 se asocia a la
maduración mieloide. Los elementos más inmaduros tiene un CD45 más bajo
• A medida que avanza la maduración mieloide, hay una pérdida de CD71, y también una ligera pérdida de CD33.
• La región de SSC bajo y CD45 intermedio (al nivel de los granulocitos) contiene grupos dispersos, que se corresponden, en su
mayor parte, a blastos. Este "agujero" es donde en la mayoría de las leucemias agudas se encuentran los blastos
• El precursor en MO emigra al timo donde madura y se genera el receptor TCR
• Las células T inmaduras (timocitos) se dividen en tres estadios:
• Timocitos precoces (estadio I), expresan CD2 y CD5, además de CD7, CD38 y CD71(marcadores
de protimocito)
• Timocitos comunes (estadía II) adquieren CD 1a, CD3cit y coexpresión de CD4+CD8
• Timocito maduro, expresan CD3 y CD4. Pueden ser lincitos T colaboradores/inductores (CD4+) o
citotóxicos/supresores (CD8+), según tengan con restricción HLA de clase I o clase II.
• Menos del 1% sobreviven y pasan a la circulación. Al pasar de timocito a célula T periférica pierden
CD38
• Los linfocitos T activados adquieren el IL-2 (receptor interleucina), HLA- DR y CD71(receptor de
transferrina)
• Se originan a partir de un precursor en la médula ósea desde donde
pasan a la circulación. Su proceso de diferenciación no se conoce bien
• Tienen capacidad de destruir células infectadas por virus y ciertas
células tumorales, sin sensibilización previa (actividad natural)
• Las NK carecen de marcadores de células T o B específicos
• La mayoría expresan CD2 y CD7, expresan también las moléculas CD11a-
c y CD 18 asociadas a la función linfocitaria
• Los CD 16, CD56 y CD57 reconocen células con actividad NK, definen las
células NK (en ausencia de CD3/TCR)
• Se originan en la médula ósea
• Se dividen en tres estadios: células B precursoras (no tienen Igs), B maduras (con Igs),y células plasmáticas.
• Los precursores expresan sólo HLA-DR y el CD34.
• Secuencialmente aparecen CD 19, CD 10 y CD20, cadenas pesadas mu citoplasmáticas y finalmente Ig de
superficie. Cuando estas aparecen se pierde CD10
• Las células B maduras expresan IgM de superficie y/o IgD, antígenos de clase II, C3, receptores Fc de IgG
y los antígenos pan de células B.
• La mayoría expresan CD24 y CD21. Una pequeña fracción expresan CD5.
• La diferenciación posterior a la MO no se conoce muy bien, no es posible definir estadios discretos por la
expresión de Ag particulares
• Las células plasmáticas carecen de antígeno de clase II , de CD45 y de la mayoría de los antígenos pan B
• Antígenos específicos de los linfocitos B son CD19, CD20 y CD22.
• El CD19 se expresa muy precozmente y continua hasta justo antes
de la diferenciación a célula plasmática
• El CD20 se expresa más tardíamente y parece estar bien
relacionado con la expresión de las cadenas pesadas
citoplasmáticas.
• El CD22 es específico de los linfocitos B y se pierde durante su
transición a células plasmáticas.
CD20
CD45

CD10
CD34 CD19
CD21
TdT
CD22

sIg
CD24
cy CD23 CD38
CD53
CD9
CD37 CD5 CD81
I II III IV
• Los precursores mieloides expresan CD34, CDl3, CD33.
• Al diferenciarse adquieren mieloperoxidasa citoplasmática (Ag específico
mieloide)
• Dentro de las células CD34+ se detectan pequeñas poblaciones que
expresan antígenos se serie granulocítica (CD15), megacariocítica (CD61
y menos CD41) y eritroide (CD71+++)
• En la diferenciación, las células de las distintas líneas mieloides van
adquiriendo y perdiendo marcadores hasta llegar al fenotipo maduro
• ORIGEN: CD34+:
• Auto-renovación (stem cell totipotencial)
• HLADR+débil/CD117+débil
• CD45+dim
• CD34+++hom/CD38-/+débil
• CD13+débil/CD33+débil.

•Diferenciación: hacia el resto de líneas:


• NO CPA:
• G.Neutrófilo: MPO+ CD15+ CD64++ CD13++ CD33++
• G.Eosinófilo: Peo+ PBMEo+ CD15+ CD13++
• G.Basófilo: CD123+++ CD203c+ CD13++ CD33++
HLADR- • G.Mastocito: CD117++++ CD203c+d IgE
• GLÓBULOS ROJOS (Eritrocitos) CD36++ CD71++ CD105+ CD235a
• PLAQUETAS (Trombocitos) CD41a++ CD42b++ CD36+++
• CPA:
• Monocitos: CD64+++ CD15+ MPO+ CD13++ CD33+++
HLADR+ • Células Dendríticas:HLADR+++
• LINFOS B: CD117- CD10+++

• MADURACIÓN CD34-: CD117+/- CD45+dim/CD45++


CD45+dim/CD45-
BAND/
MYELOBLAST PROMYELOCYTE MYELOCYTE METAMYELOCYT
NEUTROPHIL
CD15
CD13
CD64 MPO
CD13
103
CD33 CD65

CD35
CD11b
102

CD16 CD10
101

CD34

CD117 CD54
HLA-DR
• La serie eritroide posee un considerable número de etapas en su maduración. La característica
principal es la perdida del CD45 (pan leucocitario) durante la etapa del normoblasto basófilo. La
serie presenta los siguientes estadios en su maduración:
• CFU-E
• Proeritroblasto
• Normoblasto basófilo
• Normoblasto policromático
• Normoblasto ortocromático
• Reticulocitos
• Gr maduros
• La serie megacariocítica presenta características particulares,
expresando un gran numero de Ag en su etapa madura (CD36,
CD41a, CD42b, CD61). La serie presenta los siguientes estadios
en su maduración.
• CFU-EM
• Megacarioblasto
• Micromegacariocito
• Megacariocito
• plaquetas
INMUNOFENOTIPO.
VALOR DIAGNÓSTICO EN HEMATOLOGÍA: Leucemias agudas:
diagnóstico diferencial de línea