Universidad Latina de Panamá

Facultad de Ciencias de la Salud Dr. William C. Gorgas

Facultad de Medicina

Laboratorio #16

CITOMETRÍA DE FLUJO

Elaborado por:

José Ng

Profesor:

Luis Lozano

Materia:

Inmunología médica

Fecha de entrega:

Período: 2017-3
 CONTENIDO

Guía de Laboratorio.- Presentación para práctica para este laboratorio:

1- Indique las ventajas y desventajas de utilizar una tecnología como esta

para sus diagnósticos.

Ventajas de la Citometría de flujo

-Análisis de un número estadísticamente significativo de células (1 000 a más

de 100 000 células).

-Múltiples marcajes de una sola célula.

-Análisis de alto número de partículas en corto tiempo (5 000 eventos/s).

-Alta sensibilidad y objetividad.

-Medidas separadas de cada célula (no solo el promedio).

-Medidas cuantitativas: discriminación de las células según la cantidad de

marcador.

-Múltiples parámetros: define subpoblaciones complejas.

-Miles de células por segundo.

Desventajas de la Citometría de flujo

-Poca información morfológica de la célula.

-No proporciona información de la localización celular en un tejido.

-Puede analizar solamente una cantidad limitada de material (diez millones

de células por hora).

-Necesita suspensión de células individuales.

-Costos de la tecnología.

-Método destructivo.
-Incapacidad de visualizar las células que se analizan.

2- Mencione las principales partes de un citómetro de flujo y cuál es el

principio que emplea esta técnica.

 Principales partes de un citómetro de flujo:

-Forward Scatter (FS): Es un dispersor de hacia el frente. La luz del láser es
desviada por la superficie de la partícula. El detector de la dispersión
convierte la luz a pulsaciones de voltaje, proporcional al tamaño de la
partícula.
-Side Scatter (SS): Es un dispersor de luz hacia un lado en ángulo de 90º. La
luz es desviada por las estructuras internas o gránulos dentro de la partícula.
Los tintes dentro o sobre la partícula, absorben la energía del Láser y emiten
fluorescencia de diferentes colores.
-Tubo Fotomultiplicador (PMT): Tubo que sirve para separar la luz de
diferentes Colores por filtros y están dirigidos a sensores que las amplifican.

Los citómetros de flujo modernos son capaces de analizar varios miles de

partículas por segundo, en tiempo real, y pueden separar y aislar activamente
partículas de acuerdo a propiedades específicas. Un citómetro de flujo es en
cierta forma similar a un microscopio, salvo que, en vez de producir imágenes
de las células, los citómetros de flujo ofrecen una cuantificación automática
de una serie de parámetros con altísima calidad. Para analizar tejidos sólidos
es posible preparar en primera instancia una suspensión de células.
Un citómetro de flujo tiene cinco componentes principales:

 La celda de flujo laminar, donde el líquido circulando en régimen de flujo

laminar acarrea y pone en línea a las células de modo que pasen a través
del rayo de luz de a una y en fila.
 Un sistema de medición, los más comúnmente utilizados son la medición
de la impedancia o conductividad (principio Coulter) y los sistemas
ópticos.
 Un sistema de iluminación formado ya sea por lámparas de alta
luminosidad (de mercurio, xenón) láseres de alta potencia refrigerados
por agua (de argón, de criptón, de tinturas), láseres de baja potencia
refrigerados por aire (de argón λ 488 nm), láser rojo de helio-neón (λ 633
 nm), verde de helio-neón, ultravioleta de helio-cadmio; láseres de diodo
de baja potencia (azul, verde, rojo, violeta).
 Un detector y un conversor de señales ADC (análogo a digital), los cuales
registran la señal producida (sea FSC, SSC, SFL) y la convierten en una
señal eléctrica que puede ser procesada por un computador.
 Un sistema de amplificación, lineal o logarítmico.
 Un ordenador para el análisis de las señales.

Principio de esta técnica

 Una suspensión de células, se aísla de la sangre u otros tejidos, se marca
con un fluorocromo (Fitc, PE, EB).
 Las células se introducen bajo presión en un chorro pulverizado de líquido
rodeado por una envoltura de agua o salina a través de una boquilla.
 La vibración en la punta del sistema del pulverizador hace que la corriente
se rompa en una serie de gotitas la cual se regula de modo que cada una
contenga exactamente una célula.
 Las gotitas se iluminan por el rayo láser monocromático y se vigila con un
monitor electrónico mediante detectores de fluorescencia.
 Las gotitas emiten señales fluorescentes apropiadas, se cargan
eléctricamente en un campo de alto voltaje entre las placas de deflexión y
luego se clasifican en tubos de recolección.
3- Indique las 3 partes que componen un citómetro de flujo.
Los citómetros de flujo están formados por complejos sistemas:

A) El sistema fluídico permite un enfoque hidrodinámico del flujo celular

hasta conseguir el alineamiento de las partículas o células, y en los
separadores celulares o “cell sorters”, se produce una rotura del flujo en
gotas de tamaño uniforme para conseguir la separación de células
individuales.

B) Los sistemas ópticos permiten el enfoque láser en un haz con un diámetro

reducido para impactar sobre el menor número de partículas posibles
simultáneamente.
Este sistema se compone de dos tipos de ópticas:

– La óptica de excitación, compuesta del láser y las lentes apra enfocar y

dirigir el haz de luz;

– La óptica de lectura, compuesta por las lentes de recolección de luz emitida

luego de la interacción entre el haz del láser y las partículas y el sistema de
espejos y filtros para direccionar longitudes de onda específicas hacia los
detectores correspondientes.

Los FILTROS ÓPTICOS son aquellos que seleccionan las longitudes de onda
que deja pasar hacia el detector. Estos pueden ser:

– DE INTERFERENCIA (Dicroicos que reflejan las longitudes de onda no

deseadas);

– DE ABSORCIÓN (absorben las longitudes de onda no deseadas). De éstos

hay tres tipos:

– Filtros Band Pass: Dejan pasar un rango de longitudes de onda (Por ej: 620
– 640 nm)

– Filtros Short Pass: Dejan pasar por debajo de una longitud de onda
determinada (Por ej: < 575 nm)

– Filtros Long Pass: Dejan pasar por encima de una longitud de onda
determinada (Por ej: > 520 nm)

C) El sistema electrónico se encarga de la cuantificación de los destellos de

fluorescencia y de la luz dispersada y, bajo el control del ordenador, se
consigue la carga electrónica de las gotas que contienen las células de interés
para poder someterlas a deflexión y recogerlas en tubos específicos para tal
fin, o sobre pocillos de cultivo de tejidos. El ordenador permite almacenar
datos de miles de células por cada muestra, y representar los resultados
gráficamente.
 INFOGRAFÍA

 http://gsdl.bvs.sld.cu/cgi-bin/library?e=d-00000-00---off-0prelicin--00-0---
-0-10-0---0---0direct-10---4-------0-0l--11-es-50---20-help---00-0-1-00-0-0-
11-1-0gbk-00&a=d&cl=CL1&d=HASH0177c0b33293a81c94025160.5.2.3.6
 https://es.wikipedia.org/wiki/Citometr%C3%ADa_de_flujo
 http://epidemiologiamolecular.com/citometria-flujo/