PRACTICA Nº 9

ELECTROFORESIS

OBJETIVOS:

 Aprender los principios básicos de la electroforesis.

 Conocer sobre las leyes de migración sobre la placa electroforética,
 Conocer la utilidad de este método de análisis.

INTRODUCCIÓN:

La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de

estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual finalmente las
separa por tamaños moleculares y carga eléctrica, dependiendo de la técnica que se
use.

La técnica clásica utiliza una tira recubierta de una sustancia porosa impregnada de un
electrolito. Sus extremos se sumergen en dos depósitos independientes que contienen
ambos al electrolito y están unidos a los electrodos del generador de corriente. La
muestra se deposita en forma de un pequeño trazo transversal en la tira. La distancia
de migración se mide en relación un marcador interno. Las placas son reveladas con
sales de plata, azul de Coomassie, o reactivos en particular.

La electroforesis es la migración de solutos iónicos bajo la influencia de un campo

eléctrico; Estas partículas migran hacia el cátodo o ánodo (electrodos - y +), en
dependencia de una combinación de su carga, peso molecular y estructura
tridimensional. Es de destacar que a escala analítica, los métodos electroforéticos son
de alta sensibilidad, poder de resolución y versatilidad, y sirven como método de
separación de mezclas complejas de ácidos nucleicos, proteínas y otras biomoléculas,
donde aportan un potente criterio de pureza. Se pueden conocer también mediante
estas técnicas, las características ácido-básicas de las proteínas presentes en un
extracto crudo, lo que da la información necesaria si se pretende realizar una separación
cromatográfica basada en diferencias de carga. Es útil además para determinar otros
parámetros como peso molecular, punto isoeléctrico y número de cadenas polipeptídicas
de las proteínas.

La velocidad de migración (v) de la partícula es directamente proporcional al producto

de su carga efectiva (q) y el gradiente de potencial eléctrico (E) e inversamente
proporcional al coeficiente de fricción (f) relativo a la talla y forma de la molécula, o sea,
a la resistencia que le ofrece el medio.

V=qE/f

La movilidad electroforética (Me) es un caso particular de la velocidad de migración de

un ión, cuando se aplica un campo eléctrico de 1 V/cm. Su signo es igual al de la carga
de la partícula. La velocidad de migración electroforética depende de la densidad de
carga de la molécula (relación carga / peso), del voltaje aplicado y de la porosidad del
gel de electroforesis. El voltaje no se puede incrementar indiscriminadamente porque
 se genera un excesivo calor. En contraste, al aplicar bajo voltaje puede ocurrir una
pobre separación, por causa de la difusión por tiempo muy prolongado de la corrida
electroforética.

La mayoría de las biomacromoléculas (proteínas, ácidos nucleicos y polisacáridos)

poseen determinada carga eléctrica con grupos aniónicos y catiónicos capaces de
disociarse. La carga neta de la partícula está dada por el pH del medio y puede ser
modificada por la

interacción con pequeñas moléculas de iones u otras macromoléculas. De lo anterior se

deduce que el pH influye sobre la velocidad de migración de las moléculas. En el punto
isoeléctrico de la biomolécula, pH al cual su carga neta es 0, esta no migra. Por debajo
del punto isoeléctrico tiene carga neta positiva y migra hacia el cátodo, y por encima del
punto isoeléctrico tienen carga neta negativa y migra hacia el ánodo.

MARCO TEORICO:

Medios de soporte para realizar la electroforesis:

La muestra debe situarse en o sobre un medio soporte, principalmente para evitar

perturbaciones mecánicas y corrientes de convección durante la separación. En
algunos soportes (papel o similares) la muestra queda sobre la superficie y avanza a
lo largo de ella, con escasa fricción, por lo que el mecanismo principal de separación
es la magnitud de la carga de cada componente de la muestra. Otros medios de
soporte (“geles”, medios semisólidos o gelatinosos) están formados por polímeros que
forman una malla, matriz o red tridimensional a través de la cual deben avanzar las
moléculas de la muestra, que queda embebida en el medio de soporte electroforético.
Como consecuencia, la fricción es notable y los factores de forma y tamaño adquieren
una alta relevancia en la separación.

Papel: sencillo, pero con elevada adsorción debido a los grupos hidroxilo de la
celulosa.

Acetato de celulosa: los grupos –OH están acetilados, lo que reduce la adsorción;
baja tinción de fondo; es posible transparentarla o disolverla para detectar y recuperar,
respectivamente, los componentes separados.

Almidón: pasta de almidón cuyos granos se han disgregado en un tampón caliente (se
hinchan). Actualmente se utiliza poco, ha sido sustituido por la poliacrilamida.

Agarosa: polisacárido, producto purificado de algas (composición similar al agar-agar).

Se disuelve en caliente (50-60°C) y al enfriar solidifica formando un gel, de alta
porosidad.

Poliacrilamida: el gel es el resultado de la polimerización química de una mezcla de

acrilamida y bisacrilamida. Regulando la concentración de ambas y su proporción se
consiguen distintas porosidades, siempre menores que la de los geles de agarosa.
La electroforesis en gel de agarosa se utiliza comúnmente para separar moléculas en
función de su carga, tamaño
y forma. Se trata de un medio de separación especialmente efi caz para las
biomoléculas cargadas como el ADN, el ARN y las proteínas.
A pesar de que la electroforesis en gel de agarosa sea una técnica simple y fácil,
posee dotes de separación eficaces. El gel se fabrica disolviendo polvo de agarosa en
una solución tampón hirviente. A continuación, se deja enfriar la solución a 55°C y se
vierte en un soporte, donde se solidifi ca. Se sumerge después el soporte en un
equipo
de electroforesis de electrodos que contiene solución tampón.
Para preparar las muestras para la electroforesis, éstas se mezclan con componentes
que les agregan densidad,
como el glicerol o la sacarosa. Estos proporcionan a las muestras más densidad que
la del tampón de electroforesis.
Las muestras pueden entonces colocarse por medio de una micropipeta o pipeta de
transferencia en las rendijas
visibles en el gel con la ayuda de una plantilla. Por su densidad, las muestras se
sumergen en la solución tampón y
permanecen en los pocillos.
El equipo de electroforesis se conecta a una fuente de corriente continua directa y se
somete a tensión. Las
moléculas cargadas contenidas en las muestras penetran en los capilares del gel. Las
moléculas de carga neta negativa migran hacia el electrodo positivo del aparato de
electroforesis (ánodo), mientras que las moléculas de carga
neta positiva migran hacia el electrodo negativo (cátodo). Dentro de ciertos márgenes,
cuanto más fuerte sea el
campo eléctrico, mas rápido migran las moléculas. El tampón sirve a la vez para
conducir la electricidad y para controlar el pH. Efectivamente, el pH tiene una infl
uencia sobre la carga y la estabilidad de las moléculas biológicas.
La agarosa es un polisacárido derivado del agar. En este experimento utilizamos
Ultra-Spec AgaroseTM. Este
componente se constituye de una mezcla de agarosa y de hidrocoloides que hacen
que el gel sea transparente y
resistente. El gel contiene capilares microscópicos que actúan como "tamices"
moleculares. Las propiedades del gel
determinan la velocidad de migración de las moléculas: las pequeñas moléculas
migran más rápidamente que las
grandes. Además, las moléculas de misma masa y carga pueden tener formas
distintas: las de forma más compacta (las formas redondeadas son más compactas
que las formas alargadas) migran más rápidamente.
Factores como la carga, el tamaño y la forma de las moléculas, así como las
características del tampón de electroforesis, la concentración del gel y la potencia
eléctrica, tienen un impacto sobre la movilidad de las moléculas en el
gel. Entre las moléculas de masa y forma molecular semejante, las más cargadas
migrarán con mayor rapidez. Por
otra parte, distintas moléculas interactúan en medida distinta con la agarosa. Cuanto
menos simple sea la interacción, más lenta es la migración de las moléculas.
En este experimento, someteremos diversas muestras a la electroforesis mediante gel
de agarosa y observaremos
la velocidad y la dirección de su migración. Los colorantes A, B, C y D tienen cargas
negativas y pH neutro. Sin embargo, estas moléculas difi eren por su estructura,
composición química y carga. El colorante F tiene una carga neta
positiva y migrará por tanto en dirección opuesta a la de los demás colorantes.
Además, se colocará una combinación de colorantes en un mismo pocillo en el
transcurso de este experimento. Esto mostrará el poder de separación de mezclas
complejas de colorantes en componentes individuales de la electroforesis en gel de
agarosa.

MATERIALES:

 Material bibliográfico
 Equipo multimedia
 Material de escritorio

PROCEDIMIENTO:

Leer el material que proporcione el docente y responda las preguntas del cuestionario.

CONCLUSIONES:

La electroforesis en gel de agarosa es una de las técnicas más adecuadas para

lavisualización del ADN ya que además de ser de fácil preparación, los colorantes
como el BROMURO DE ETIDIO son peligrosos y cancerigenos y tenemos que
tener conocimiento de ello y proteccion adecuada para no sufrir accidentes o
enfermedades, tambien permiten su observación al someterse a luz fluorescente.

CUESTIONARIO:

 Defina lo que es electroforesis:

La mayoría de las biomoléculas poseen una carga eléctrica, cuya magnitud

depende del pH del medio en el que se encuentran. Como consecuencia, se
desplazan cuando se ven sometidas a un campo eléctrico.

Se denomina electroforesis a la técnica mediante la cual se separan las

biomoléculas en disolución cuando se ven sometidas a un campo eléctrico. Se
trata de una técnica fundamentalmente analítica, aunque también se puede
realizar con fines preparativos.

Cada molécula se desplaza por efecto del campo, alcanzando rápidamente una
velocidad constante al equilibrarse la fuerza impulsora (fuerza del campo
eléctrico) con la resistencia al avance (fuerza de fricción o rozamiento) impuesta
por el medio en el que se desplaza.

 ¿Cuáles sustancias pueden medirse por electroforesis?

La electroforesis se usa en una gran mayoría en la materia del ADN

recombinante ya que nos permite saber la carga que poseen los polipéptidos, y
separar los diferentes polipéptidos resultantes de las variaciones del experimento
del ADN recombinante. La variante de uso más común para el análisis de
mezclas de proteínas o de ácidos nucleicos utiliza como soporte un gel,
habitualmente de agarosa o de poliacrilamida. Los ácidos nucleicos ya disponen
de una carga eléctrica negativa, que los dirigirá al polo positivo, mientras que las
proteínas se cargan al unirse con sustancias como el SDS (detergente) que
incorpora cargas negativas de una manera dependiente de la masa molecular de
la proteína. Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas
se moverán y deberán ir pasando por la malla del gel (una red tridimensional de
fibras cruzadas), por lo que las pequeñas se moverán mejor, más rápidamente.
Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca del
lugar de partida.

 ¿Qué reactivos peligrosos son los que se utilizan en electroforesis? ¿cuáles son
sus peligros?

TRIS:

Es el nombre común de tris(hidroximetil) aminometano. Se trata de un

compuesto muy utilizado en el laboratorio para preparar disoluciones tampón; el
grupo ácido-base que ejerce el tamponamiento es el amino. Se comercializa en
sus formas básica ("Tris base") y ácida ("Tris hidrocloruro"), aunque la primera
es la de uso más común.

En la electroforesis, es el agente tamponante que mantiene el pH. Se incluye

tanto en el gel como en el tampón de cubeta.

EDTA:

Acrónimo de EthyleneDiamine TetraAcetic acid, ácido etilendiamino tetraacético

(a veces AEDT en español). En sus formas desprotonadas (2− y 4−), es un
conocido agente quelante de cationes divalentes, en especial Ca2+ y Mg2+.

Dado que el Mg2+ es un cofactor requerido por la mayoría de nucleasas, su

secuestro por el EDTA evita la degradación del DNA durante la preparación y la
electroforesis.

BROMURO DE ETIDIO:

Se trata de un compuesto intercalante, es decir, que tiene afinidad para unirse

al DNA, pues se introduce entre sus bases apiladas. Esto se debe a su
geometría plana y su estructura aromática, que interacciona favorablemente con
el interior hidrófobo de la doble hélice. En menor medida, interacciona también
con DNA monocatenario.

Su utilidad deriva asimismo de su fluorescencia, exaltada al encontrarse en un

entorno hidrófobo, es decir, al estar unido al DNA. Se excita con luz ultravioleta
de onda corta, 254 nm, y emite su fluorescencia como luz visible, de color
rosado-anaranjado.

En la electroforesis, se utiliza para "teñir" el DNA, para revelar su posición en el

gel. Se puede bañar el gel tras la electroforesis en una disolución de bromuro
de etidio, o bien incorporar éste a la disolución de agarosa con la que se
prepara el gel.

Precaución: el etidio es cancerígeno, debido a su capacidad para intercalarse y

así dificultar la replicación y transcripción correctas. Debe manejarse con
precaución, especialmente el polvo sólido y las disoluciones concentradas.

GelRed™:

En la electroforesis, se utiliza para "teñir" el DNA, para revelar su posición en el

gel. Se puede bañar el gel tras la electroforesis en una disolución de GelRed™,
o bien incorporar éste a la disolución de agarosa con la que se prepara el gel.

Los ensayos realizados por el fabricante indican que este compuesto no es

cancerígeno como el etidio, lo cual se atribuye a que su estructura y, en
particular, su carga impiden que atraviese las membranas celulares.
 ¿Qué protección se debería llevar al llevar a cabo la electroforesis en gel

Utilización de equipos de protección individual

Cuando el resultado de la evaluación de riesgos muestre que, a pesar de la
aplicación de las medidas de control, no se garantiza el control de los riesgos,
será necesario el uso de los equipos de protección individual (EPI).
El empresario, basándose en los resultados de la evaluación de los riesgos,
deberá proporcionar al trabajador los EPI adecuados a su tarea, además de la
ropa de trabajo (bata de laboratorio, calzado cerrado, preferiblemente lavable)
que proceda. Los EPI deben disponer de marcado CE con los pictogramas que
indiquen la protección ofrecida y el folleto informativo, al menos en castellano.
El trabajador deberá utilizar los EPI según lo indicado en los procedimientos de
trabajo establecidos.

Para esta tarea los EPI preceptivos son:

Guantes de protección frente a productos químicos. Materiales como nitrilo

pueden ser adecuados. No se deben utilizar guantes de látex porque son muy
permeables al bromuro de etidio. En cualquier caso se debe consultar el folleto
informativo y las recomendaciones de la ficha de datos de seguridad. Los
guantes se pondrán sobre las manos limpias y, después de usarlos, se lavarán y
secarán las manos.
Protectores oculares: gafas de montura integral con ocular panorámico y
adaptables al rostro con protección frente a salpicaduras (campo de uso 3,
líquidos) y frente a polvo fino (campo de uso 5, gas y partículas de polvo fino). En
caso de potencial exposición a radiación UV, es recomendable que los oculares
sean de protección frente a este tipo de radiación.
Además, como se indicó anteriormente, en operaciones puntuales o
excepcionales, como en caso de derrames accidentales en los que se pueda
liberar polvo de bromuro de etidio al ambiente, se deben utilizar mascarillas
autofiltrantes tipo FFP3 de protección respiratoria.

Los EPI deben guardarse en un lugar limpio, seco y alejado de focos de calor.

Dispositivos de lavado
En las proximidades de las áreas de uso, y perfectamente accesibles, se
dispondrá de duchas y fuente lavaojos con suministro de agua preferentemente
templada, para el lavado inmediato de los ojos y la piel en caso de salpicaduras o
proyecciones, o bien, soluciones de lavado polivalentes.
Se debe realizar un mantenimiento periódico de los mismos.

Protección de las trabajadoras embarazadas y en período de lactancia natural

Dada la clasificación del bromuro de etidio como mutágeno de categoría 2, se
recomienda la suspensión del trabajo con este producto durante todo el período
de gestación.

 Describa algunos tipos de variantes de electroforesis.

En cuanto a la composición del gel hay dos variantes:

 -Electroforesis continua (un solo tipo de gel)

-Electroforesis discontinua (2 tramos de gel de composición ligeramente

diferente).

 ¿Qué voltaje y de qué tipo se usa en electroforesis?

Electroforesis en gel:

Una técnica que se usa para separar fragmentos de ADN y otras

macromoléculas por tamaño y carga.

El voltaje típico para correr un gel de agarosa para ADN estaría en el intervalo de
808080 - 120 \text{ V}120 V120, start text, space, V, end text. Un voltaje más alto
hará que el gel corra más rápido, pero también puede derretir el gel si corre por
un largo periodo de tiempo. Un voltaje más bajo hará que el gel corra más
lentamente (lo que puede ser conveniente si quieres que termine en un momento
determinado, digamos, después de regresar de comer).

Puntos más importantes:

La electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar fragmentos de ADN
según su tamaño.
Las muestras de ADN se cargan en pozos (ranuras) en un extremo de un gel y
se aplica una corriente eléctrica para arrastrarlas a través del gel.
Los fragmentos tienen carga negativa, por lo que se mueven hacia el electrodo
positivo. Puesto que todos los fragmentos de ADN tienen la misma cantidad de
carga por masa, los fragmentos pequeños atraviesan el gel más rápido que los
grandes.
Cuando un gel se tiñe con un pigmento que se une al ADN, los fragmentos de
ADN pueden verse como bandas, las cuales representan un grupo de fragmentos
de ADN del mismo tamaño.

BIBLIOGRAFÍA:

 Bishop Michael (2007) QUÍMICA CLÍNICA PRINCIPIOS PROCEDIMIENTOS Y

CORRELACIONES. Editorial Mc Graw Hill. 4ª edición.
 D’Ocon Carmen (2005) FUNDAMENTOS Y TÉCNICAS DE ANÁLISIS
BIOQUÍMICO.
Editorial Thomson – Paraninfo. España.
 Flores Moreno Patricia (2016) MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUÍMICA. Ed
Manual Moderno. 5º edición. México.
 Plummer David (1981) INTRODUCCIÓN A LA BIOQUÍMICA PRÁCTICA. Ed Mc
Graw
Hill. Colombia.