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INFORME LAB. N.

3 GENETICA ELECTROFORESIS

MONICA ALEJANDRA MONTOYA OVIEDO JULY ALEXADNRA HERNANDEZ LOPEZ HEIDY JULIETH CALDERON HERRADA

UNIVERSIDAD DEL TOLIMA LIC. EN EDUCACION BSICA CON ENF. EN CIENCIAS NATURALES Y EDU. AMBIENTAL GENETICA Y BIOLOGIA MOLECULAR IBAGUE 2009

INFORME LAB. N. 3 GENETICA ELECTROFORESIS

MONICA ALEJANDRA MONTOYA OVIEDO COD: 050950022005 JULY ALEXADNRA HERNANDEZ LOPEZ COD: 050950252005 HEIDY JULIETH CALDERON HERRADA COD: 050950542005

Presentado a: MARIBEB CASTRO GONZALEZ

UNIVERSIDAD DEL TOLIMA LIC. EN EDUCACION BSICA CON ENF. EN CIENCIAS NATURALES Y EDU. AMBIENTAL GENETICA Y BIOLOGIA MOLECULAR IBAGUE 2009

OBJETIVOS

Realizar la separacin de macromolculas de DNA utilizando la tcnica analtica de Electroforesis. Observar la diferente movilidad que presentan las molculas cargadas de DNA de clulas de epitelio bucal y clulas vegetales, cuando son sometidas a la influencia de un campo elctrico.

INTRODUCCIN

En el presente informe se describe lo ocurrido en la prctica de laboratorio donde se llev a cabo un proceso metodolgico en el cual se aplica una tcnica para la separacin de molculas de DNA segn la movilidad de estas en un campo elctrico a travs de una matriz porosa, la cual finalmente las separa por tamaos moleculares y carga elctrica. Los cidos nucleicos en nuestro caso el DNA de clulas del epitelio bucal, y de clulas vegetales de una cebolla cabezona, ya disponen de una carga elctrica negativa, que los dirigir al polo positivo. El mtodo utilizado es el de electroforesis en gel, un grupo de tcnicas empleadas por los cientficos para separar molculas basndose en propiedades como el tamao, la forma o el punto isoelctrico. El gel de agarosa se refiere a la matriz usada en nuestra prctica de laboratorio para separar las molculas, ya que para separar cidos nucleicos grandes (ms de unos centenares de bases), la matriz empleada es agarosa purificada. La primera parte del nombre, electroforesis, se refiere a la fuerza electromotriz que es empleada para desplazar las molculas a travs del gel. Al situar las molculas en el gel y aplicar una diferencia de potencial elctrico, las molculas se mueven a diferentes velocidades, hacia el ctodo, si estn cargadas positivamente, y hacia el nodo, si estn cargadas negativamente. En los cidos nucleicos qu es el caso de nuestro anlisis, la direccin de migracin es del electrodo negativo al positivo, y esto es debido a la carga negativa presente en el esqueleto azcar-fosfato. Cuando esto ha finalizado continuamos con la revelacin de lo ocurrido, haciendo uso de un colorante especfico que las hizo visibles, el bromuro de etidio, y puesto que era un reactivo fluorescente se pudo realizar la observacin en la cmara de luz UV.

MARCO TERICO

La electroforesis es una tcnica de separacin que consiste en el transporte de iones a travs de una disolucin por la accin de un campo elctrico. Se aplica una diferencia de potencial elctrico entre dos electrodos con cargas elctricas opuestas y los iones presentes en la disolucin se mueven hacia uno u otro electrodo segn su propia carga: Los cationes (iones con una carga elctrica positiva) se mueven hacia el ctodo (iones con una carga elctrica negativa). Los aniones (iones con una carga elctrica negativa) se mueven hacia el nodo (electrodo con una carga elctrica positiva).

Movilidad electrofortica En un sistema electrofortico actan dos fuerzas opuestas sobre cada molcula con carga elctrica: La fuerza debida al campo elctrico, F = Q.E Donde: Q = carga elctrica del in (positiva o negativa); E = Intensidad del campo elctrico. La fuerza debida a la resistencia de la disolucin que viene dada por la ley de Stock, F = 6 . Donde: Constante r = radio del in t = viscosidad de la solucin v = velocidad del in El resultado de ambas fuerzas es el movimiento del in a travs de la disolucin a una velocidad constante. Esta velocidad dividida por la intensidad del campo elctrico se conoce como movilidad electrofortica. La movilidad electrofortica es directamente proporcional a su tamao y a la viscosidad de la disolucin en la que discurre la electroforesis. La electroforesis en gel es una tcnica empleada para separar molculas o fragmentos de molculas de cidos nucleicos. Los materiales ms comunes para separar las molculas de los cidos nucleicos son polmeros como la poliacrilamida o la agarosa. Estos geles se colocan en la cubeta de . r . t .v

electroforesis, sumergidos en un tampn de pH alrededor de 8. De esta forma, las molculas de DNA o RNA sometidas a electroforesis se desplazarn al polo positivo ya que a pH superiores a 5 poseen carga negativa. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar molculas cargadas en funcin de su tamao y forma. As, molculas de DNA de diferente tamao, van a emigrar de forma distinta en un gel de electroforesis. La distancia recorrida por cada fragmento de DNA va a ser inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. Es importante la utilizacin de marcadores de tamao conocido porque nos permitirn calcular los pesos moleculares de las muestras de DNA problema. En los geles de agarosa se debe aadir bromuro de etidio, sustancia que se intercala entre las bases del DNA y es fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta. Tras la electroforesis, se visualiza el gel con una lmpara de luz UV, y se vern las bandas correspondientes a las muestras de DNA aplicado y los marcadores de peso molecular.

METODOLOGIA ELECTROFORESIS MATERIALES Gel Agarosa 0.9% Buffer de Tris-borato EDTA (0,45m TRIS 0,45 M) cido brico, 10mM EDTA pH 8,0

Procedimiento

1. Prepare un gel de agarosa 0.9%. sumerja la placa de gel de agarosa en buffer TBE depositado en la cmara horizontal de Electroforesis. 2. Sirva 10l de las muestras respectivas ms 1l de buffer carga en la gel de agarosa. 3. Corra una electroforesis a 110 V. 1 hora. 4. Sumergir el gel de agarosa donde corri el ADN en Bromuro de Etidio durante 15-20 minutos. 5. Lavar con buffer. 6. Visualice ADN bajo la luz UV.

RESULTADOS Y ANALISIS DE RESULTADOS

Preparacin de gel agarosa al 0.9%

Placa de Gel donde se colocaran las muestras

Preparacin de la cmara horizontal con buffer de TBE.

Muestras respectivas de ADN de clulas epiteliales y clulas vegetales.

Placa de Gel agarosa lista para meter en la cmara horizontal de Electroforesis.

Buffer de carga de azul de fromofenol. 10l de Buffer y muestra servidos.

Se distribuyen las muestras con el buffer de carga en la gel de agarosa para correr la electroforesis.

Electroforesis a 110V durante 1 hora.

Parte de la placa del gel de agarosa luego de la electroforesis. Bromuro de Etilo para depositar la gel.

Se saca luego de 15 minutos de sumergida. Se lava con Buffer de TBE.

Placa de gel de agarosa vista en la luz UV.

ANLISIS DE RESULTADOS Se aadi una muestra de ADN vegetal (cebolla) y ADN animal (tejido epitelial) en un extremo del gel de agarosa, aplicamos carga elctrica y los fragmentos de ADN se empezaron a desplazar a travs de los poros de la gel hacia el polo positivo ya que el ADN tiene carga negativa, lo que significa que el fragmento ms pequeo migrar ms hacia el polo positivo, utilizamos un buffer de carga que permita ver mejor el desplazamiento de la muestra, por ltimo para poder observan en la luz UV se sumergi en Bromuro de Etidio con las medidas de seguridad necesario ya que se trataba de una sustancia altamente cancergena. ste ltimo con el fin de hacer la revelacin de la existencia de los fragmentos de ADN puesto que es el colorante fluorescente que se inserta entre estos para permitir evidenciar la existencia de los mismos bajo la luz UV. Podemos ver que la placa observada indica que tres de las muestras presentan ms fluorescencia que las otras dos. Sin embargo tambin sucede que las dos muestras que presentan menor fluorescencia para su deteccin genera un desplazamiento mayor a lo largo de la placa indicando que su desplazamiento hacia el polo positivo fue ms rpido ya que poseen diferente peso molecular, las muestras que corrieron ms debieron presentar menor tamao y peso.

CONCLUSINES La electroforesis en gel de agarosa es de las ms empleadas para analizar y caracterizar cidos nucleicos de distintas procedencias. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar molculas cargadas en funcin de su tamao y forma. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar molculas cargadas en funcin de su tamao y forma. As, molculas de DNA de diferente tamao, van a emigrar de forma distinta en un gel de electroforesis. La distancia recorrida por cada fragmento de DNA va a ser inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. La rapidez con que migren las molculas puede ser regulada por la concentracin de agarosa disuelta en buffer que usemos: a mayor concentracin, mayor compactacin de la red y por tanto menor velocidad de migracin. La concentracin que elijamos depender de lo que se quiera separar en cada corrida. La electroforesis en general permite la separacin de molculas como consecuencia de su diferente movilidad en un campo elctrico.

BIBLIOGRAFA

1. Fuentes X; Castieiras M; Queralt J. 1997. Bioqumica clnica y Patologa molecular. Vol I. Editorial Revert S.A. Barcelona. Pg: 169 2. A.A. 2008. Protocolos y mtodos de laboratorio de Biologa Molecular, Facultad de Medicina UASLP. Preparacin de Buffer TBE. 3. Schmidt A; Fuchs. M; Fuenmayor F. 2007. La Electroforesis de Isoenzimas: principios y aplicaciones en el cultivo de la yuca. ISSN: 16904117. Venezuela. 4. Padilla C; Diez J; Martnez E; Brcena J; Garca C. 2005. Electroforesis de cidos nucleicos en geles de agarosa. Aislamiento y caracterizacin electrofortica de DNA plasmdico. Departamento de Bioquimica y biologa Molecular. Campo Universaitario de Rabanales. Argentina. 5. Garca H. 2000. Electroforesis en geles de poliacrilamida: fundamentos, actualidad e importancia. Laboratorio Beter. Cuba.

CUESTIONARIO

1. Qu es la electroforesis y cul es su fundamento? R/: El trmino electroforesis fue creado por Michaelis en el 1909, para describir la migracin de los iones por la influencia de un campo elctrico, ya que se cumple con un principio simple las molculas con carga negativa migran para el polo positivo, y las de carga positiva al polo negativo. La electroforesis es una tcnica relativamente simple, rpida y de alto valor informativo. Su aplicacin en la identificacin de protenas ha sido aplicada en estudios de taxonoma, fisiologa y gentica de plantas, animales y microorganismos. La electroforesis tambin puede ser empleada en la determinacin de pesos moleculares de protenas y en la caracterizacin de molculas como los cidos nucleicos DNA y RNA. Fundamentos de la Electroforesis:

Alta sensibilidad, resolucin y versatilidad. Mtodo de separacin de: Acidos nucleicos, protenas y otras biomolculas. Alto criterio de pureza. Separa mezclas complejas. Permite determinar: peso molecular de una protena, punto isoelctrico, nmero de cadenas polipptidas de una protena. Migracion de solutos en un campo elctrico. Se mueven las partculas en base a: su carga neta, peso molecular y estructura tridimensional.

2. Qu tipo de sustratos se utilizan para realizar una electroforesis, cual es la aplicacin de cada uno de ellos? R/: Electroforesis en gel de poliacrilamida: Los geles de poliacrilamida constituyen un excelente medio de soporte para separaciones electroforticas, dado que renen una serie de propiedades idneas: transparencia, elasticidad, porosidad controlable y compatibilidad con una gran variedad de compuestos qumicos. La poliacrilamida se forma por copolimerizacin de dos compuestos, la acrilamida y la bisacrilamida (N,N'-metiln-bis-acrilamida), en una reaccin iniciada por la tetrametiletilndiamina (TEMED) y el persulfato de amonio. El radical persulfato activa al TEMED, el cual a su vez activa al monmero de acrilamida para que polimerice. Las cadenas de poliacrilamida son entrecruzadas al azar por la bisacrilamida, formndose as una red de

porosidad bastante uniforme, que puede ser regulada variando las condiciones de la reaccin y las concentraciones de los monmeros. Entre las diversas tcnicas de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE, por sus siglas en ingls "polyacrylamide gel electrophoresis"), probablemente la ms utilizada es la modalidad que se lleva a cabo en presencia del detergente duodecilsulfato de sodio (SDSPAGE), tanto para analizar mezclas de protenas, como para ser combinada con tcnicas de inmunoelectrotransferencia. Electroforesis en geles de agarosa: La agarosa es un polisacrido extrado de algas marinas que tiene la propiedad de mantenerse en estado slido a temperatura ambiente pero que a altas temperaturas se torna lquida. Esta caracterstica permite una fcil preparacin de una matriz porosa para ser usada en electroforesis. Este gel esta constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras polimricas embebida en gran cantidad de medio lquido, que retarda el paso de las molculas, se usa usualmente para separar molculas grandes de alrededor 20.000 nucletidos. Electroforesis en geles de gradiente: es una tcnica de huella, rastreo o trazado molecular (vulgarmente conocida en Ingls como molecular fingerprinting) usada en diversas disciplinas de la biologa y la qumica, que consiste en la separacin de cadenas de ADN de doble cadena dependiendo de su punto de desnaturalizacin, siendo dicha desnaturalizacin definida en ste caso como la separacin de cadenas complementarias de ADN. El uso de geles de poliacrilamida que tienen un gradiente creciente de concentracin de acrilamida+bisacrilamida, y en consecuencia un gradiente decreciente en el tamao de poro, pueden tener ventajas sobre los geles de concentraciones uniformes de acrilamida. Generalmente los gradientes se establecen entre el 3 y el 30% de acrilamida en gradientes lineales o cncavos. El rango a emplear depender del tamao de las protenas a separar. En un gel en gradiente la protena migra hasta que alcanza una zona donde el tamao de poro impide cualquier avance. Una vez se alcanza el lmite de poro no se produce una migracin apreciable aunque no se detiene completamente. Los geles en gradiente se preparan mezclando las soluciones de acrilamida de las concentraciones extremas en un formador de gradientes. Se suele adoptar la inclusin en la solucin de polimerizacin de glicerol o sacarosa para aumentar la densidad de las soluciones y evitar las mezclas en el proceso de preparacin del gradiente.

MATERIALES USADOS EN EL PROCESO DE ELECTROFORESIS Bromuro de Etidio es empleado para la visualizacin de los cidos nucleicos utilizado como colorante fluorescente. Este colorante tiene la propiedad de intercalarse entre las bases nitrogenadas del ADN y el ARN. Debido a esta propiedad es un agente mutagnico y debe manipularse con cuidado. El bromuro de etidio generalmente se incorpora a la agarosa antes de chorrear el gel, o puede incorporarse luego de la corrida electrofortica. Buffer de tris-borato-EDTA (TBE) Posee alta fuerza inica, alta capacidad para tamponar (no requiere re-circulacin), se emplea para electroforesis de fragmentos pequeos y se emplea para geles analticos. La movilidad electrofortica del ADN se ve afectada por la composicin y la fuerza inica del tampn de electroforesis. En ausencia de iones, la conductancia elctrica es mnima y el ADN migra lentamente o ni siquiera se desplaza. En un tampn de elevada fuerza inica la conductancia elctrica es muy elevada y se genera una importante cantidad de calor. Buffer de Siembra (Azul de Bromofenol) es un colorante que permite ver la corrida (corre como si tuviera 500 pb de peso, es decir, est en el frente de la corrida), durante la electroforesis, controla a la muestra para que esta no cambie de orientacin o se pase del lugar donde se encuentra dicho gel. 3. Qu observaciones se hicieron, durante la prctica?Qu diferencia encontr entre las muestras analizadas? a que se deben las diferencias? R/:

En la prctica se trabajo con dos muestras diferentes una clula animal (tejido epitelial) y clula vegetal (cebolla). A la hora se someter estas muestras a electroforesis en gel de agarosa se observo que la vegetal corra mas rpido debido a que el ADN es ms liviano en comparacin al recorrido que realizo la muestra de tejido epitelial que lo hizo ms lento ya que el ADN es ms pesado. Y como sabemos el gel de agarosa permite un buen desplazamiento pero este se ve afectado por el tamao del ADN analizar al igual que el tamao del poro de dicha gel.