Apuntes de Biología Celular y Molecular

Coloquios 1, 2, 3, 4 y 5. Primer Parcial 2021

Coloquio 1: Introducción a las técnicas de microscopía. Fluoróforos y Anticuerpos

(usos en Biología Celular). Cultivos celulares y técnicas de fraccionamiento celular.

Uno de los métodos más importantes que nos permiten estudiar las células es la
microscopía, que no solo nos permite visualizar la estructura celular, sino que también
nos permite evaluar los cambios morfológicos, el contexto celular y también algunos
procesos celulares mediante diferentes estrategias.

Existen dos grandes grupos de microscopios. Por un lado, los microscopios ópticos,
cuya formación de imagen depende de una serie de lentes y de la presencia de una
fuente de luz, las cuales actúan aumentando el tamaño del objeto en observación, y
por el otro los microscopios electrónicos que dependen de la formación de un haz de
electrones. Esto a través de una serie de lentes electromagnéticas que lo van
enfocando atravesando la muestra para generar una imagen sobre una pantalla
fluorescente o sobre una película fotográfica. Actualmente también se utilizan algunos
softwares de computadoras que nos permiten visualizar directamente la imagen en la
pantalla ya sea para los microscopios ópticos como para los electrónicos.

Características de los microscopios:

1. Magnificación: Es el tamaño máximo o la cantidad de aumentos que podemos

obtener ya sea por la combinación de lentes o por ese haz de electrones. En el
microscopio óptico este aumento puede ser de hasta 1000 veces.
2. Resolución: Es lo que nos permite visualizar dos puntos de manera separada.
Es decir, la distancia mínima que puede resolver un microscopio entre dos
puntos y que nosotros lo visualicemos como separados. Esta resolución es
muchísimo mayor en los microscopios electrónicos.
3. Contraste: Es una serie de modificaciones que se hace a la fuente originaria de
luz que se utiliza para generar algunos cambios en la iluminación que producen
contrastes en la estructura celular y nos permite una mejor visualización.

La resolución de los microscopios es importante que lo tengamos en cuenta a la hora

de saber qué es lo que queremos visualizar.

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La base teórica de los microscopios ópticos tiene que ver en como la luz impacta
sobre una muestra. SI tenemos una fuente de luz blanca y una lámina de células, esta
luz va a incidir sobre el objeto y en algunas regiones donde la densidad sea mayor esta
luz va a cambiar un poco su intensidad y eso nos va a permitir visualizar las células.
Una estrategia que se utiliza (porque las células son muy traslucidas) es utilizar
tinciones; entonces generamos una especie de contraste, donde la luz puede
atravesarla y darnos una coloración en la muestra que tenemos y así poder visualizar
algunas estructuras celulares. Para poder realizar la tinción de la célula por lo general
se tiene que trabajar con tejido fijado con lo cual las células ya no estarían vivas. Otra
de las desventajas que tienen las tinciones es que generalmente hay que romper las
células porque los colorantes no atraviesan las membranas. Entonces la tinción en
general es una técnica destructiva.

Tipos de microscopios ópticos que podemos encontrar en un laboratorio y que nos

permiten visualizar de diferentes maneras las células son:

Microscopio Óptico de Campo claro: Es el microscopio más común que utilizamos en

cualquier laboratorio en el cual podemos ver células frescas o sin teñir y células
teñidas las cuales podemos ver sobre un fondo blanco.

Microscopio Óptico de Campo oscuro: Incrementa el contraste sin utilizar tinciones,

generando una imagen clara sobre un fondo oscuro. Especialmente utilizado para la
visualización de células vivas. Ese campo oscuro se produce por una modificación que
se genera en la fuente de luz del microscopio que lo que hace es separar la luz y
generar este contraste en el fondo.

Microscopio Óptico de Contraste de fase: Utiliza la refacción e interferencia provocada

por las estructuras de la célula para crear imágenes de alta resolución de las
estructuras celulares sin utilizar tinciones. Como bien sabemos las células
interiormente tienen diferentes estructuras que generan la dispersión de la luz de
manera diferencial (índice de refracción), con lo cual dispersan la luz de maneras
particulares y el microscopio aprovecha la interferencia que se genera cuando la luz
quiere atravesar una estructura mas densa generando modificaciones en esta luz. Las
imágenes que se generan por microscopio óptico de contraste de fase son de bastante
resolución y se pueden visualizar algunas estructuras celulares sin recurrir a tinciones.

Microscopio Óptico de Fluorescencia: Utiliza tinciones fluorescentes que permiten la

distinción entre células vivas y muertas, localizar moléculas o proteínas dentro de la
célula. Esta microscopia es de las que mas se utiliza actualmente en biología celular.
Permite un estudio de la estructura general de una organela.

Microscopio Óptico Confocal: Utiliza un láser para escanear múltiples planos de

manera secuencial, generando una gran cantidad de imágenes bidimensionales que
pueden ser utilizadas para recrear una imagen tridimensional de la célula.
Generalmente se utiliza con tinciones fluorescentes. ¿Cuál es la ventaja? Cuando
nosotros utilizamos un microscopio convencional nosotros vemos un solo plano de la
muestra que estamos visualizando, entonces generalmente lo que hay que hacer es
aplastar esa muestra para generar el plano lo más finito posible para que la
visualización sea correcta. Con la microscopia confocal esto no es necesario porque
nos permite con este laser barrer una imagen de un plano focal. Se ve a la celula y sus
organelas escaneadas en 3 dimensiones.

Microcopía electrónica

Tiene la ventaja que Es sumamente resolutiva. Las estructuras que se pueden

visualizar son extremadamente detalladas. Se usan haces de electrones en vez de luz.
Tienen una longitud de onda de 0.01 nm lo que da una resolución de 1-2 nm (TEM –
microscopio electrónico de transferencia) o 10-20 nm (SEM – microscopio electrónico
de barrido). Se usan electromagnetos para enforcar los electrones.

Preparación de la muestra – TEM.

¿Cuál es la dificultad que tiene tanto la microscopia de transferencia como la de

barrido? Es la preparación de las muestras. Es un trabajo muy laborioso. Las muestras
deben ser fijadas en packs de resinas, se cortan en secciones extremadamente
delgadas de -70nm para que cuando se proceda a realizar la observación estos
electrones logren atravesar las regiones que deben atravesar. Para generar contraste,
las muestras se tratan con metales pesados, estos metales pesados se depositan en
las láminas, en las regiones donde hay organelas. (osmio, uranio). Los electrones
atraviesan donde no están depositados los metales, y donde hay mas cantidad de
metales los electrones “rebotan” y no son detectados por la película fotográfica. De
esta manera se genera la imagen en la microscopia electrónica.

Entonces por el poder de resolución que tiene la microscopía electrónica podemos

visualizar estructuras muy detalladamente de las células. Por ejemplo, podemos ver
retículos endoplasmáticas peroxisomas mitocondrias ribosomas detalles de las
crestas de la vesícula de Golgi analizar la estructura de la membrana celular etc.

Preparación de la muestra – SEM

La microscopia electrónica de barrido es diferente en el sentido de que su resolución

es un poco menor 20 nm de resolución) y la lógica del barrido es distintas, porque en la
transmisión los que se detecta son los electrones que atraviesan la muestra y en el
barrido se detectan los electrones que rebotan en la muerta. Entonces mediante la
microscopia electrónica de barrido lo que podemos ver son esos electrones reflejados
por la superficie de una célula entonces nos permite visualizar toda la estructura
externa de una manera bastante detallada. Este microscopio tiene un detector que
esta por encima de la muestra y detecta esos electrones reflejados por la muestra. La
microscopia electrónica de barrido se utiliza principalmente para visualizar superficies.

La muestra se fija y se cubre la superficie con una capa de metal electrodenso. Los
electrones son reflejados por la superficie y captados por un detector.

Fluoróforos y Anticuerpos: usos en Biología Celular.

Como generar fluorescencia. Como podemos utilizar la fluorescencia para visualizar

estructuras celulares o localización de moléculas utilizando un microscopio de
fluorescencia común o utilizando un microscopio de fluorescencia del tipo confocal.

La fluorescencia es algo que se genera utilizando unas moléculas especiales

denominadas Fluoróforos o fluorocromos.

¿Qué es un flouróforo?

Los colorantes fluorescentes o fluoróforos absorben luz de un color específico. La

absorción excita los electrones de esta molécula a un nivel de energía más alto y
cuando estos electrones vuelven a su estado de energía normal emiten luz de una
mayor longitud de onda. Las propiedades químicas del colorante determinan su
excitación y emisión. Y hay una amplia gama de Fluoróforos. Están los que emiten en
verde, azul, amarillo, rojo, etc. La elección de los Fluoróforos va a ser dependiendo de
los filtros que nosotros tengamos porque los microscopios de fluorescencia necesitan
filtros para dejar pasar solo la longitud de onda de luz que excita a estos fluoróforos,
entonces es necesario contar con el filtro adecuado para que la emisión sea la
correcta.

Fluoróforos para detección de organelas.

DAPI (azul) – para DNA

Emite una luz fluorescente de color azul. Nos sirve mas que nada para evidencia el
núcleo que es donde está la concentración más alta de DNA.

Mito-tracker (rojo) – potencial de la membrana

El potencial de membrana está presente en las mitocondrias, por lo tanto, nos indica
en qué lugar están las mitocondrias.

Lyso-Tracker (verde) – reacciona en ambientes ácidos. Por los tantos nos indica donde
están localizados los lisosomas.

Para obtener una imagen completa (con varias longitudes de onda) lo que se hace es
sacar una foto por cada filtro que se utilice y luego se las une a todas las fotos en una
sola para poder evidenciar la localización de las organelas que están siendo
coloreadas por cada fluoróforo.

Otra de las técnicas es la inmunofluorescencia.

Para entender esto primero debemos saber que son los anticuerpos. Los anticuerpos
son moléculas que reconocen específicamente proteínas dentro de la célula. Si
nosotros a estos anticuerpos les incorporamos una marca fluorescente esos
anticuerpos nos van a decir en qué lugar está determinada proteína (que es la que
reconoce ese anticuerpo en específico)

¿Como se generan los anticuerpos? Cuando nosotros estamos sometidos a una

infección puede ser una infección viral hay una serie de células en el cuerpo que
fagocitan esas partículas virales que se llaman macrófagos. Cuando las fagocitan las
rompen en un montón de pedacitos y cada uno de esos pedacitos es presentado por
un sistema de proteína. Se los presenta a un linfocito b que no esta diferenciado. Los
linfocitos b son los productores de anticuerpos, pero no siempre producen
anticuerpos. Solamente empiezan a producir anticuerpos cuando son expuestos a una
porción de esa proteína del virus que fue obtenida luego de la ruptura por parte del
macrófago. Cada linfocito B se diferencia por la exposición a un solo pedacito de ese
virus. Entonces cada linfocito b es productor de un gran numero de anticuerpos pero
que reconoce solo una porción de esa partícula extraña que ingreso en nuestro cuerpo.
Los anticuerpos tienen como característica que tienen una región que es conservada
para todos los anticuerpos y una región variable que es la que va a permitir el
reconocimiento de diferentes porciones de la partícula del cuerpo extraño a la que fue
expuesta.

En laboratorio nosotros podemos producir anticuerpos de dos tipos.

Policlonales: Inmunizamos un ratón con la proteína de interés, esa proteína de interés

se va a romper en muchos fragmentos que van a dar origen a muchos tipos de
linfocitos b productores de un gran numero de anticuerpos que reconocen diferentes
porciones de esta proteína. Después de 15 a 20 dias al ratón que esta inmunizado se le
extrae la sangre, se separa y en el suero están contenidos los anticuerpos. ¿Cuáles
anticuerpos? Todos los anticuerpos, no solamente los que están dirigidos contra la
proteína de interés. ¿Entonces que tenemos que hacer? Purificarlos. Se utilizan unas
microesferas que están recubiertas con diferentes pedacitos de la proteína de interés,
entonces una vez que el suero pasa por esas esferas los anticuerpos que reconocen
esa proteína se unen a estas esferas, los que no la reconocen pasan de largo y una vez
que pasaron todos los anticuerpos que no son específicos contra esa proteína lo que
se hace es mediante el tratamiento con alguna solución acida-iónica, se liberan esas
uniones y se obtienen los anticuerpos que se denominan policlonales porque en
realidad no reconocen solo una porción de la proteína sino varias porciones de la
proteína. Actualmente se siguen utilizando los policlonales porque son relativamente
fáciles de obtener.

Monoclonales: para el caso de los monoclonales el proceso de inmunización de los

ratones es lo mismo. Se aíslan los linfocitos b y aquí es donde esta la diferencia: los
linfocitos B una vez que están diferenciados no se dividen, entonces se genera un
cultivo celular, una célula mieloide que se fusiona con este linfocito B. ¿Por qué una
célula mieloide? Ese tipo de células son células inmortales, están todo el tiempo
dividiéndose. Entonces al fusionar esas dos células formamos una hibridoma que
adquiere la capacidad de dividirse porque viene de la célula mieloide y adquiere la
capacidad de producir anticuerpos que vienen del linfocito B. Cada una de ellas
produce un solo tipo de anticuerpo entonces se aíslan en unas placas y en cada una de
ellas se empieza a dividir ese linfocito y empieza a generar anticuerpos. Cada uno de
esos pocillos tiene una cantidad de anticuerpo que es única, el anticuerpo es único, no
hay otro anticuerpo y por eso es monoclonal. Una vez que se tienen todos los
anticuerpos se testean y se verifica cual es el que se une con mayor fuerza a la
proteína de interés.

Anticuerpos en inmunocitoquímica.

Una vez que producimos los anticuerpos, esos anticuerpos pueden ser utilizados en
inmunocitoquímica. ¿como? Primero inmovilizamos el antígeno. Incorporamos el
anticuerpo primario que es el que obtenemos por la vía policlonal o monoclonal. Se
une al antígeno en la célula y después incorporamos un anticuerpo secundario. Este
anticuerpo secundario tiene la característica que se une a la región constante del
anticuerpo primario. Por lo tanto, este anticuerpo secundario se une a cualquier
anticuerpo. Y el objetivo es que varios de estos anticuerpos secundarios se unan al
anticuerpo primario generando una expansión o una amplificación de la señal. Esos
son los que van a producir la fluorescencia. Entonces, el que está marcado es el
anticuerpo secundario que reconoce la región constante del anticuerpo primario y es el
anticuerpo primario el que reconoce la proteína de interés o antigeno.

Marcado de proteínas con GFP (proteína verde fluorescente) existe la roja y la amarilla
fluorescente pero la tradicional es la verde. ¿Cuál es la diferencia? La proteína verde
fluorescente generalmente se utiliza para marcar proteína, entonces lo que se genera
es una proteína de fusión. Una proteína de interés que esta fusionada a esta proteína
verde fluorescente. Esta proteína verde fluorescente es un fluoroforo. O sea tiene
moléculas que fluorecen entonces la complejidad viene en que hay que diseñar por
ingeniería genética un plasmido. Un plasmido es una secuencia de adn que viene de
bacterias, es circular. Lo que se hace es que en ese plasmido colocar la secuencia del
gen de interés de la proteína que queremos nosotros más la secuencia del gen de la
GFP. Con este plásmido se pueden transformar las células, es decir, estos plasmidos
se pueden incorporar a células. Nosotros los podemos hacer en células de cultivo o
podemos utilizarlas para transformar células embrionarias. Si nosotros las utilizamos
para transformar células embrionarias lo que vamos a obtener son animales
transgénicos que son portadores de la proteína de interés fusionada a la proteína GFP
y podemos ver las GFP en el animalito o en las plantas. Ahora… que es lo que sucede?
Que la proteína GFP a veces es muy chiquitita entonces cuando generamos esta
proteína desde fusión normalmente no afecta la actividad de la proteína de interés,
aunque existen casos en que si afecta la actividad normal de la proteína de interés.

Cultivos celulares y técnicas de fraccionamiento celular.

Siempre tenemos que tener en cuenta 3 cuestiones:

¿Qué vamos a estudiar? Para poder seleccionar el tipo celular apropiado por ejemplo si
queremos estudiar potenciales de membrana generalmente vamos a utilizar células
neuronales; si queremos estudiar fotosíntesis vamos a estudiar células de una hoja,
células vegetales; también si queremos estudiar por ejemplo la función mitocondrial
vamos a utilizar tejido muscular que es donde más concentraciones de mitocondrias
va a haber, y así sucesivamente.

¿Qué tipo celular es el más apropiado?

Vamos a seleccionar el tipo celular de acuerdo al objetivo que tengamos que cumplir

¿Cuál es la mejor estrategia para obtener la información que se busca? Es decir, si me

conviene trabajar con la célula completa si me conviene aislar mitocondrias o retículos
endoplasmáticos si me conviene estudiar la célula en un contexto de tipo de tejido sin
romperla, etc. Estas son las cosas que tenemos que tener en cuenta para los estudios
en biología celular.

Para estudiar las células podemos partir de dos estrategias:

Por un lado, podemos trabajar con tejidos intactos ósea hacer un aislamiento de tejido.
Ese tejido obviamente esta unido en una matriz extracelular la que le da la forma y lo
mantiene todo trabajando al unísono, entonces para poder obtener esa célula lo que
tengo que hacer es romper esa matriz extracelular o también si quiero hacer
microscopia sin romper la estructura del tejido puedo usar cortes celulares, entonces
así determinar la estructura del tejido.

Y otra estrategia que podemos utilizar es usar cultivos celulares. Los cultivos celulares
nos permiten trabajar de manera más apropiada cuando queremos estudiar procesos
celulares. Son células que están en suspensión. Se pueden mantener en laboratorios,
no requieren el sacrificio permanente de animales o romper permanentemente plantas.
Los cultivos celulares pueden ser cultivos primarios o pueden ser líneas celulares
transformadas.

¿Cuál es la diferencia entre los cultivos primarios y las líneas celulares?

Cultivos primarios: las células en cultivo están e suspensión y requieren un medio de

cultivo especifico con una cierta cantidad de componentes, factores de crecimientos
azucares, algunos metabolitos para mantener un crecimiento normal. El pasaje de una
sola vez es lo que nos va a determinar la duración de esta célula que no va más allá de
los 10 días.

Líneas celulares: el problema es que estas células son aneuploides lo que significa que
las células tienen problemas en la constitución cromosómica. Son células que
mantienen su eje de diferenciación. Se pueden hacer varios pasajes, es decir las puedo
ir manteniendo en cultivo todo el tiempo solamente haciendo el cambio de medio de
cultivo porque obviamente después de cierta cantidad de tiempo se agotan los
nutrientes y esas células hay que pasarlas porque o si no se mueren.

Purificación de organelas

Podemos hacer una ruptura celular y separar diferentes fracciones de organelas de la

célula. Para hacer la ruptura celular si es un tejido obviamente necesitamos primero
romper la matriz, y una vez que se obtienen las células en suspensión hay que romper
las células. Esta ruptura no tiene que ser brusca ni tiene que ser muy violenta porque
sino rompemos todas las membranas de la célula y finalmente no vamos a lograr
aislar ninguna organela. Recuerden que las organelas están formadas por membranas
y si el proceso de ruptura es muy brusco podemos romper todas las membranas en la
célula y perder las estructuras de las organelas.

Los tipos de rupturas celular son diferentes. Podemos utilizar la ruptura por sonicación
que es un aparato que produce un ultrasonido y esa vibración provoca que la
membrana externa se rompa. Hay todos unos protocolos que nos indican cual es la
frecuencia y el tiempo que hay que aplicar ese ultrasonido para que se rompa la
membrana.

Después tenemos la homogeneización que es la ruptura mecánica; puede ser

mediante el uso de un mortero o un homogeneizador. Mediante el uso de nitrógeno
liquido o de algunos componentes que permitan la ruptura celular mecánica.
Algunas células pueden romperse mediante el uso de soluciones hipotónicas. En una
solución hipotónica la célula se hincha porque empieza a ingresar agua y
eventualmente se rompe.

Entonces de esa manera liberaríamos el contenido celular incluyendo las organelas.

Y para separar las organelas podemos utilizar dos estrategias de acuerdo al objetivo
que tengamos que son la centrifugación diferencial y la centrifugación en gradiente de
densidad.

La centrifugación diferencial se basa en las propiedades que tienen, una vez que
rompemos las células y liberamos el contenido celular, cada uno de estos
componentes celulares. Estos van a precipitar producto de una fuerza centrifuga a
diferentes velocidades y a diferentes tiempos. Entonces una vez que tengo un extracto
celular si yo aplico una fuerza centrifuga relativamente baja y con un tiempo no muy
prolongado puedo obtener los núcleos que van a precipitar por su propia constitución y
su propio peso. A continuación, puedo aplicar aún más fuerza centrífuga y tiempo y
puedo obtener mitocondrias, cloroplastos, lisosomas, peroxisomas. Para poder
precipitar o poder obtener una fracción que contenga fragmentos del retículo
endoplasmático, polirribosomas o fragmentos de membrana voy a tener que aplicar
una fuerza centrífuga mucho más alta y un tiempo de centrifugación mayor. A partir de
este punto lo que se utiliza no son las centrifugas convencionales que hay un cualquier
laboratorio, sino que se utilizan unos equipos que se llaman ultra centrifugas que
trabajan en vacío con temperatura baja. Uds. imagínense cuando empieza a girar el
rotor si no se mantiene una temperatura baja se puede producir una explosión
literalmente, entonces es necesario contar con estos equipos que mantienen una
temperatura fría y esto lo logran gracias al sistema de vacío que tienen. Y así
sucesivamente cuanta más fuerza centrífuga y mas tiempo apliquemos menor van a
ser los tamaños de los componentes que logramos aislar hasta que finalmente
logremos obtener subunidades de ribosomas o polirribosomas. Entonces con esta
técnica podemos separar diferentes componentes celulares de acuerdo a su peso en
solución.

Otra forma de aislar organelas es a través de la centrifugación en gradiente de

densidad. Hay dos tipos de centrifugaciones en gradiente de densidad. En el primero
que es en el zonal antes de empezar a hacer nada tenemos que preparar el gradiente
de densidad. Hay moléculas como la sacarosa que a distintas concentraciones tienen
distinta densidad, se prepara un gradiente de densidad con distintas concentraciones
de sacarosa, que obviamente le van a otorgar diferentes puntos de densidad y acá las
organelas se van a ubicar en el punto de gradiente de densidad que es equivalente a su
propia densidad. Acá no vamos al tamaño o al peso de la organela sino a su densidad
relativa entonces generamos el gradiente de densidad zonal con diferentes zonas de
concentración de sacarosa. Cada una de estas zonas tiene una densidad especifica.
cargamos ese gradiente con la fracción de las organelas, aplicamos una fuerza
centrífuga y las organelas o fracciones celulares se van a ubicar en las zonas de
gradiente que es equivalente a su propia densidad. Para poder extraerlos hay que tener
un pulso super fuerte porque con una pipeta hay que ir extrayendo las diferentes
fracciones de diferentes densidades y en cada una de ellos van a estar las fracciones
de organelas que es de nuestro interés. Eventualmente no se obtienen puras y hay que
hacer observaciones en el microscopio para determinar el grado de pureza y hay que
realizar alguna reacción química para determinar la pureza de esa fracción celular.

El otro tipo de centrifugación en gradiente de densidad es la isopinica. Acá la

estrategia es distinta. E utiliza una solución de un componente que generalmente es
cloruro de cesio, esa es una solución de una concentración estable que cuando el
cloruro de cesio es sometido a una fuerza centrífuga genera perse dentro del tubo
diferentes rangos de densidad entonces no necesito preparar el gradiente de densidad
antes, sino que el gradiente de densidad se genera al mismo tiempo que se van
aislando las fracciones celulares. Y acá es exactamente lo mismo que en al anterior la
organela o la fracción celular se va a ubicar en el punto de densidad que es equivalente
a su propia densidad. Se va a generar una zona de equilibrio de densidades donde se
posiciona la organela y lo mismo que en el caso anterior para verificar la pureza de esa
fracción en el caso de organelas grandes como puede ser las mitocondrias o los
cloroplastos o los lisosomas o los peroxisomas. Tengo que observar al microscopio a
ver que no haya restos de otras fracciones celulares y además de ser posible realizar
alguna prueba bioquímica que verifique que mayoritariamente tengo esa organela en
esa fracción. Entonces de esta manera podemos por un lado como obtenemos células
para trabajar y por otro lado como de esas células podemos utilizar para fraccionar los
diferentes componentes celulares para realizar otros tipos de estudios.

Coloquio 2: Proteómica.

En este coloquio vamos a hablar un poco sobre proteínas y como estudiarlas.

Las proteínas son los ejecutores de las actividades en la célula. Además de tener
funciones estructurales, obviamente las funciones que llevan a cabo las proteínas son
las que permiten mantener la fisiología y la función así que es de suma importancia
entender cómo se pueden estudiar.

A la hora de estudiar proteínas podemos tener varios objetivos:

Podemos estudiar células individuales si conocemos sus características su estructura

su secuencia…

Y si no las conocemos y queremos hacer un estudio mas amplio podemos tener un

enfoque sistemático haciendo un estudio global de la expresión de las proteínas
identificando todas las proteínas en un estado determinado. Esto sería la analogía de
sacar una foto de las proteínas en un momento determinado.

O podemos tener un enfoque más comparativo, pragmático donde podemos comparar

dos situaciones fisiológicas diferentes y determinar como varían las constituciones
proteicas de esas dos situaciones haciendo lo que se denominan mapas
bidimensionales.
Tenemos que saber que cuando trabajamos con proteínas a partir de un tejido o un
cultivo celular trabajamos con una mezcla de proteínas. Entonces tenemos que tener
una serie de técnicas que nos permitan separarlas. Obviamente el primer paso siempre
es preparar la muestra y las técnicas clásicas de separación son la electroforesis tanto
en una dimensión como en dos dimensiones y las cromatografías. En ese punto
vamos a poder identificar las proteínas, pero sin darles la identidad exactas. Entonces
para identificarlas exactamente deberíamos poder medir alguna propiedad intrínseca.
Dentro de esas proteínas intrínsecas esta la actividad especifica de la proteína.
Muchas proteínas tienen actividades que tienen relación con la ruptura de determinada
molécula o la síntesis de determinadas moléculas que cumplen funciones dentro de la
célula. Las funciones de las proteínas tienen que ver con la síntesis o la degradación o
alguna modificación de otras proteínas entre otras actividades. Además, podemos por
ejemplo ver determinada masa y la secuencia de esas proteínas a través de la técnica
de espectrometría de masas. La espectrometría de masas lo que nos da es una
visualización de ciertas características de esa proteína una vez que nosotros la
logramos separar y purificar a través de cromatografía y esa marca puede ser
analizada a través de comparación con base de datos y podemos lograr una
identificación de la secuencia de la proteína que es una característica que nos permite
después establecer algunas otras características que tienen que ver con la estructura y
el modelado de esa proteína.

Electroforesis en una dimensión (SDE-PAGE)

Una de las técnicas que más se utilizan para el análisis de proteínas es la

electroforesis en una sola dimensión también denominada SDS-PAGE.

SDS es el nombre de un detergente que lo que hace es desnaturalizar las proteínas y

desplegarlas. Este tipo de electroforesis se denomina también desnaturalizante. Para
hacer la preparación de la proteína, la base para todas las técnicas es la misma, se
parte de un tejido o de un cultivo celular. Si es un tejido tenemos que tener en
consideración que ese tejido tiene una matriz extracelular que hay que digerirla para
que las células se puedan romper más fácilmente y se puedan liberar el contenido de
proteína intracelulares. Esto es valido tanto para tejidos animales como vegetales. Si
estamos trabajando con un cultivo no hay necesidad de digerir matrices extracelulares
porque los tejidos son células en suspensión. Una vez que obtenemos la muestra hay
que proceder a la homogeneización. La homogeneización es la ruptura celular que
puede ser a través de alguna técnica mecánica puede ser a través de sonicación. lo
que hacemos es romper esas células y liberar el contenido de proteínas internos de la
misma. Pero siempre quedan restos celulares de gran tamaño porque la ruptura no es
100 % efectiva. no podemos deshacer toda la célula. Entonces hay que realizar una
centrifugación. cuando hacemos la centrifugación esos restos de tamaño grande se
depositan en el fondo y lo que queda en suspensión son las proteínas. Que es una
mezcla de proteínas. Entonces a través de la electroforesis y utilizando un gel de
poliacrilamida. Los geles de poliacrilamida es un polímero que forma una especie de
red o malla que tiene diferencias en tamaño de poro entonces las proteínas que fueron
desplegadas y que están desnaturalizadas mediante el uso del SDS migran cuando se
aplica una corriente eléctrica desde el polo negativo hacia el polo positivo y se van
separando de acuerdo a su tamaño. Cuando nosotros se realiza la siembra de
proteínas se pone lo que se denomina un marcador, que es un colorante que va a
marcar por donde irían las proteínas, pero las proteínas no van a estar coloreadas.
Para eso una vez que se termina la corrida electroforética las proteínas se revelan con
un colorante que se denomina cumasiblue que se una de manera inespecífica a las
proteínas. Esto es: se una a todas las proteínas que están unidas a ese gel y nosotros
vamos a ver un patrón de bandas. Estas son todas las proteínas presentes en las
muestras que nosotros colocamos y que hicimos la corrida electroforética.

Esta forma de separar las proteínas tiene la dificultad que solo separamos por tamaño.
Hay proteínas que tienen tamaños similares y entonces no estaríamos logrando
separarlas si estamos utilizando la técnica en una sola dimensión.

Electroforesis de proteínas bidimensional (2-DE)

Como una alternativa a la primera podemos usar este tipo de electroforesis en dos
dimensiones. En donde en una primera dimensión, las proteínas se separan de acuerdo
a su punto isoeléctrico en un gradiente de pH. El punto isoeléctrico el punto en el cual
todas las cargas de la proteína se vuelven neutras y esto tiene que ver con el pH que
hay en la corrida, entonces las proteínas se van a ubicar en ese gradiente de acuerdo a
su punto isoeléctrico y a continuación se hace una segunda dimensión que es
justamente la misma que en el método anterior que es la separación en un gel de
poliacrilamida por tamaño.

Entonces primero se separan por punto isoeléctrico y después por tamaño. Dos
proteínas con el mismo punto isoeléctrico pueden ser separadas porque pueden llegar
a tener diferente tamaño y entonces así aumentamos la resolución de esa corrida
electroforética.

La visualización se hace tiñéndolas con el colorante kumasiblue y lo que se ven son

una serie de puntos con un poco de unas estelas que son producto de la segunda
dimensión. Podemos llegar a saber, por el punto isoeléctrico y por el tamaño, la
identidad de las proteínas, si previamente ya tenemos conocimiento sobre eso.

También se pueden hacer análisis comparativos con la misma especie o el mismo

tejido de otro autor (de otro experimento) y también podemos comparar dos estados
fisiológicos diferentes y analizar si esas proteínas varían en su concentración.

Lo que podemos hacer si nosotros no conocemos quien es esa proteína cual es esa
proteína es recortar directamente esa porción del gel. A continuación, en un tubo se
elimina esa matriz de poliacrilamida y se repurifica la proteína. En ese caso vamos a
tener solamente la proteína que está presente en ese tubo.

Si nosotros quisiéramos identificar esa proteína lo que tendríamos que hacer es lo que
se denomina espectrometría de masas. Acá nosotros tenemos el mismo
procedimiento. Hay un gel en una sola dimensión, pero es válido para dos
dimensiones. En dos dimensiones es mejor porque resuelve dos características como
el punto isoeléctrico y el tamaño. Entonces la separación es más efectiva. Y una vez
que purificamos y eliminamos esa matriz de poliacrilamida y obtenemos la proteína,
esa proteína se digiere en presencia de generalmente tripsina. Se digiere de manera tal
que se obtienen pequeños fragmentos. Esos pequeños fragmentos pasan una etapa
de separación en cromatografía liquida y se van ordenando de acuerdo a su tamaño y
través de un spray se van ionizando, es decir que esos péptidos adquieren una carga
positiva.

El espectrómetro de masas lo que hace es analizar esa carga y el tamaño de ese

péptido. Y establece una relación que es la relación entre la masa y la carga; y la
intensidad referido a la cantidad del péptido que hay en esa muestra que se esta
analizando.

Pero… ¿Como pasamos de esto a obtener la secuencia de la proteína?

Esto se hace mediante el análisis de los espectros de masa. Sus datos podemos
cargar en una base de datos y mediante evaluaciones comparativas de otros
espectros de masa se pueden identificar los péptidos porque la secuencia de este
péptido en particular y la carga y la relación entre la carga y la masa corresponde a una
secuencia especifica de aminoácidos. Entonces este pico tiene una secuencia típica
de aminoácidos. No hay otra posibilidad de que sea distinto. De esa manera el
programa nos permite analizar todos los picos y poder determinar la secuencia de esa
proteína. Con esta secuencia de péptidos y con la identificación de la proteína lo que
yo puedo hacer, esta secuencia lineal no sirve de mucho, pero podemos hacer un
modelado en 3 dimensiones. Y podemos determinar la estructura tridimensional y
compararla y ver si podemos tener algún indicio de su función. Además, con la
proteína purificada podemos hacer algo que es de suma utilidad que es la generación
de anticuerpos. Los anticuerpos se generan a través de fragmentos de proteínas
inyectándoselas en un ratón.

Coloquio 3:

Coloquio 4:

Coloquio 5: