Universidad Católica Nuestra Señora de la Asunción

Facultad de Ciencias de la Salud

Cátedra de Biología Celular y Genética Humana

“Técnica del cometa como bioindicador de daño celular”

Integrantes:

 Rojas Jacquet, Miguel Angel

 Román Gamarra, Eliane Beatríz

Tutora: MSc. Cathia Coronel

Sección: M1

2023
 Introducción

La técnica del cometa o ensayo cometa consiste en una prueba de laboratorio que estudia el daño
del material genético en seres vivos afectados por diferentes agentes químicos, físicos y biológicos.
Es un procedimiento realizado para la detección y evaluación de la capacidad regenerativa en el
ADN, lo cual se puede visualizar al teñir con materiales fluorescentes las células procesadas por el
ensayo cometa. El material genético expuesto se adhiera al colorante, permitiendo de esta manera
analizar los resultados del experimento mediante un microscopio con cámara integrada.
 Desarrollo

La técnica del cometa, también conocido como electroforesis alcalina de células individuales (del
inglés: Single Cell Gel Electrophoresis Assay), es una prueba que evalúa el daño del material
genético causado por diferentes agentes químicos y físicos.

Esta técnica es aplicada para determinar el grado de toxicidad de determinadas sustancias que
causan daño al ADN ya que brinda información del mecanismo de daño, para lo cual se utilizan
endonucleasas específicas que reconocen varios tipos de bases dañadas. Debido a su alto grado de
confianza y efectividad en los resultados del ensayo cometa, múltiples áreas han optado por
implementar el método en sus estudios; desde ensayos de genotoxicidad y ecotoxicología, hasta
estudios de biomonitoreo en humanos; además, el ensayo cometa ha tenido un gran impacto en
áreas como la biomédica y la genómica, actuando como biomarcador en el análisis y estudio de
enfermedades degenerativas, tales como el cáncer, diabetes, osteoporosis, enfermedad de
Alzheimer, entre otros. Como resultado del ensayo cometa, existen dos partes fundamentales que se
podrían presentar en la estructura de las células de ADN procesadas: un núcleo, denominado cabeza
del cometa, que contiene todo el material genético que resistió al daño inducido durante la prueba; y
una cola, denominada cola del cometa, que representa la porción desplazada del núcleo por no
poseer la suficiente estabilidad genómica.

El análisis de los resultados obtenidos es posible mediante un sistema integrado de software y

hardware para procesar, segmentar y clasificar, de forma automática, imágenes de células del
ensayo cometa basando su análisis en técnicas de morfología matemática.

El primer acercamiento a esta técnica ocurrió en 1970 cuando Piter Cook desarrolló una técnica
para investigar la estructura nuclear basado en la lisis de las células con detergente no iónicos y
cloruro de sodio a alta molaridad. Luego, en 1978 Rydberg y Johanson introdujeron el uso de la
electroforesis, utilizando células de hámster embebidas en agarosas, las cuales después de ser
lisadas en un medio alcalino, las cadenas de ADN eran visualizadas con naranja de acridina. Este
método fue modificado por Östling y Johanson en 1984, quienes fueron los primeros en desarrollar
una técnica de electroforesis en microgeles para detectar el daño al ADN a nivel de células
individuales.

En el año 1990, Olive introdujo otra versión alcalina de este ensayo, con esta variante se detectan
SLA convertidos en RSC. En la actualidad existen dos versiones del ensayo Cometa: una,
introducida por Sing y otra desarrollada por Olive. Las dos versiones son similares, pero la
diferencia está dada en los valores de pH de la electroforesis. El método de Sing, (electroforesis
alcalina) emplea pH > 13, mientras que el método de Olive, emplea electroforesis con pH de 8,3
(electroforesis neutra). Ambos métodos son capaces de detectar ruptura de las simple y doble
cadenas de ADN, pero el método alcalino detecta, además, sitios alcalinos lábiles. Por esta razón el
ensayo en condiciones alcalinas es el más usado.

Pasos básicos en el ensayo alcalino:

 Obtención de las muestras a ser estudiadas; luego son dispensadas sobre láminas portaobjeto,
previamente cubiertas con una fina capa de agarosa normal 1%
 Lisis de las células (liberación de ADN): se retiran las laminillas cubreobjetos y se sumergen en
el buffer de lisis cuya composición básica incluye NaCl 2.5 M, Tris 10 Mm, tritón X-100, 1 %,
todo en solución a pH 10.
 Electroforesis: La electroforesis se realiza en una cámara horizontal con un volumen de buffer
pH>13.
 Neutralización y Tinción del ADN: se realizan lavados en buffer Tris 0.4 M pH 7.5 – 8.0, para
neutralizar el efecto de la alcalinidad del proceso anterior. Finalmente, se tiñen las láminas con
tinciones fluorescentes, ya que mejoran la sensibilidad y calidad de imágenes. Entre los más
usados destacan; naranja de acridina, bromuro de etídio, DAPI, YOYO, Sybr Green, Sybr Gold
 Visualización de los cometas y cuantificación de daño: Se cuantifica la longitud de la migración
del ADN (longitud de la cola) y así establecer el grado de daño.

El ensayo Cometa se distingue por sus múltiples ventajas entre las que se destacan:

 Alta sensibilidad para detectar bajos niveles de daño al ADN.

 Puede aplicarse en estudios tanto in vitro como in vivo

 Rápida realización (resultados en pocos días).

 Análisis de los datos a nivel de células individuales.

 Requiere un pequeño tamaño de muestra (pocas células).

 Flexibilidad y bajo costo.

 Aplicable a cualquier población de células eucariotas.

Utilización de la técnica de cometa en el Paraguay

El ensayo cometa se realiza únicamente en el laboratorio de Genética Toxicológica de la Facultad

de Ciencias de la Salud de la Universidad Católica Nuestra Señora de la Asunción.
 Conclusión

El ensayo cometa es un proceso de laboratorio rápido y flexible que permite detectar el daño a nivel
molecular de los organismos a través del análisis de sus células individuales. Su implicación en las
diversas áreas de la biomédica y la genómica ha desencadenado una extensiva investigación para el
desarrollo de algoritmos y técnicas que faciliten la detección de los cometas en imágenes del ensayo
cometa y la extracción de sus parámetros.
 Bibliografía

 Rodrigo A, Urrego, Pareja, Andrés, Vásquez, Neil A, & Márquez, María E. (2005). El Ensayo
Cometa: una técnica para evaluar genotoxicidad en el ADN de oocitos bovinos. Revista
Colombiana de Ciencias Pecuarias, 18(3), 222-227. Retrieved September 19, 2023, from
http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0120-
06902005000300003&lng=en&tlng=es.

 Rodríguez-Rey, Alexis, Noris-García, Elena, & Fundora Torres, María Teresa. (2016).
Principios y relevancia del ensayo cometa. Revista Cubana de Investigaciones
Biomédicas, 35(2), 184-194. Recuperado en 19 de septiembre de 2023, de
http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0864-
03002016000200007&lng=es&tlng=es.

 Lenin, T. Correlación de los parámetros del Ensayo Cometa y dosis de radiación ionizante en
células mononucleares sanguíneas humanas expuestas in vitro en la evaluación del daño al
ADN (UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS).
https://docplayer.es/79724546-Universidad-nacional-mayor-de-san-marcos-facultad-de-
medicina-e-a-p-de-tecnologia-medica.html