Determinacin del peso molecular de protenas en electroforesis en condiciones

desnaturalizantes.
1. El gel de electroforesis est constituido por un gel de separacin (10%
acrilamida) y un gel de concentracin (4%). En un tubo de centrfuga preparar la
solucin del gel de separacin tal como se indica en la tabla 7.

Tabla 7. Preparacin de 2 geles de acrilamida de 1.5 mL de espesor, al 10 y 4% en

condiciones desnaturalizantes para la cmara de electroforesis de Biorad.
Soluciones

Gel de separacin 10%

Gel de concentracin

(mL)

4%
(mL)

Agua destilada

7.1

6.32

Tris 2 M pH 8.8

2.7

Tris 2 M pH 6.8

0.5

Acrilamida 30%/bisacrilamida 0.8%

1.06

SDS 10%

0.15

0.08

Persulfato de amonio10%

0.05

0.026

TEMED

0.01

0.01

Volumen final

15

2. Mezclar cuidadosamente y vaciar entre los vidrios de la cmara la solucin,

utilizando una micropipeta.

3. Colocar sobre la solucin una pequea capa de agua para favorecer la

polimerizacin por 30 min.
4. Preparar el gel de concentracin al 4% como se indica en la tabla 7.
5. Mezclar perfectamente la solucin. Retirar el volumen de agua que se coloc
para favorecer la polimerizacin, adsorbindola con un toalla de papel. Colocar la
solucin del gel de concentracin sobre el gel de separacin ya polimerizado.
Colocar el peine y esperar a que polimerice por 15-30 min a temperatura
ambiente.
6. Mientras el gel se polimeriza, preparar las muestras de protena de la siguiente
manera: Diluir 1:5 la muestra de protena en un microtubo de 600 mL, con el Buffer
5X Laemly. Calentar por 5 min en un bao mara en ebullicin.
7. Ensamblar la cmara de electroforesis. Adicionar el buffer 1X SDS de corrida
hasta que los electrodos estn completamente cubiertos.
8. Cargar 15 uL de muestra en cada pozo. Cargar 6 uL del marcador de peso
molecular. El Marcador de peso molecular preteido 26619, contiene bandas de
referencia preteidas que se pueden observar en la figura 2.
9. Migar las muestras a 10 mA hasta que el azul de bromofenol alcance la zona
del gel de separacin; incrementar la corriente a 15 mA.
10. Detener la electroforesis cuando el azul de bromofenol est a punto de salir del
gel de acrilamida.
12. Para recuperar el gel, se debe cortar el gel concentrador y colocarlo en el sitio
de residuos. El gel en donde se llev a cabo la separacin de las muestras, debe
ser colocado dentro de un recipiente con 50 mL de la solucin de Coomassie para
teir por 15 min.
13. Desteir el gel en 50 mL de solucin desteidora durante una hora. Repetir el
procedimiento dos o tres veces ms hasta que aparezcan las bandas teidas de
azul y el fondo casi transparente.

250 kDa

260 kDa
140 kDa

130 kDa
95 kDa
72 kDa
55 kDa

100 kDa
70 kDa
50 kDa
40 kDa
35 kDa

Thermo Scientific
Plus Prestained Protein Ladder #SM1841
Thermo Scientific PageRuler Plus Prestained
ProteinPageRuler
Ladder #26619

Figura 2. Patrn de migracin de marcadores de peso molecular preteidos,

usados en geles de acrilamida al 10%.

14. Determinar el Rf de las muestras problemas, tal como se indica en la figura 4.

Calcular el peso molecular en kDa de las muestras problemas. Vaciar los datos
obtenidos en la tabla 14.