ELECTROFORESIS

1. INTRODUCCIN
La electroforesis es la migracin de solutos inicos bajo la influencia de un campo
elctrico; estas partculas migran hacia el ctodo o nodo (electrodos - y +), en
dependencia de una combinacin de su carga, peso molecular y estructura
tridimensional.
Es de destacar que a escala analtica, los mtodos electroforticos son de alta
sensibilidad, poder de resolucin y versatilidad, y sirven como mtodo de separacin de
mezclas complejas de cidos nucleicos, protenas y otras biomolculas, donde aportan
un potente criterio de pureza. Se pueden conocer tambin mediante estas tcnicas, las
caractersticas cido-bsicas de las protenas presentes en un extracto crudo, lo que da la
informacin necesaria si se pretende realizar una separacin cromatogrfica basada en
diferencias de carga. Es til adems para determinar otros parmetros como peso
molecular, punto isoelctrico y nmero de cadenas polipeptdicas de las protenas.
La velocidad de migracin (v) de la partcula es directamente proporcional al producto
de su carga efectiva (q) y el gradiente de potencial elctrico (E) e inversamente
proporcional al coeficiente de friccin (f) relativo a la talla y forma de la molcula, o
sea, a la resistencia que le ofrece el medio.
V = q E / f

La movilidad electrofortica (Me) es un caso particular de la velocidad de migracin de
un in, cuando se aplica un campo elctrico de 1 V/cm. Su signo es igual al de la carga
de la partcula.
La velocidad de migracin electrofortica depende de la densidad de carga de la
molcula (relacin carga / peso), del voltaje aplicado y de la porosidad del gel de
electroforesis. El voltaje no se puede incrementar indiscriminadamente porque se genera
un excesivo calor. En contraste, al aplicar bajo voltaje puede ocurrir una pobre
separacin, por causa de la difusin por tiempo muy prolongado de la corrida
electrofortica.
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La mayora de las biomacromolculas (protenas, cidos nucleicos y polisacridos)
poseen determinada carga elctrica con grupos aninicos y catinicos capaces de
disociarse. La carga neta de la partcula est dada por el pH del medio y puede ser
modificada por la interaccin con pequeas molculas de iones u otras macromolculas.
De lo anterior se deduce que el pH influye sobre la velocidad de migracin de las
molculas.
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En el punto isoelctrico de la biomolcula, pH al cual su carga neta es 0,
esta no migra. Por debajo del punto isoelctrico tiene carga neta positiva y migra hacia
el ctodo, y por encima del punto isoelctrico tienen carga neta negativa y migra hacia
el nodo.


2. COMPONENTES

2.1 CAMPO ELCTRICO

Es un gradiente de potencial que posibilita que haya electroforesis. A su vez,
depende de diferentes parmetros:
Diferencia de potencial (V). Se mide en voltios y es lo que define el campo
elctrico. Cuanto mayor sea, mayor ser la velocidad de migracin. Las
electroforesis se consideran de bajo voltaje si se realizan entre 10-500 voltios (la
mayora) y de alto voltaje si se realizan entre 500-10.000 voltios.
Intensidad (I). Se mide en amperios y cuantifica el flujo de carga elctrica.
Est relacionada con la diferencia de potencial por la Ley de Ohm:
y para una diferencia de potencial dada, su valor (normalmente entre 5-50mA)
viene determinado por la resistencia del soporte, por lo que, en ltima
instancia, da cuenta de la distancia recorrida por las molculas.
Resistencia (R). Se mide en ohmios y cuanto mayor sea la resistencia del
soporte, menor ser la movilidad electrofortica (ya que la intensidad ha de ser
menor para que se cumpla la Ley de Ohm). Depende de la naturaleza del
soporte, sus dimensiones (anchura, longitud y seccin) y de la concentracin del
tampn de electroforesis.
Temperatura. Por el efecto Joule, el paso de una corriente elctrica produce
calor, y este efecto ser tanto mayor cuanto mayor sea la diferencia de potencial
y la resistencia del sistema. Debe controlarse de forma estricta, puesto que puede
afectar a la muestra (desnaturalizndola), al soporte e incluso al equipo
electrofortico. Todo esto justifica, por s solo, la necesidad de un sistema de
refrigeracin en las cubetas de electroforesis.
2.2 MUESTRA

La movilidad electrofortica de una molcula es tanto mayor cuanto mayor sea
su carga y disminuye segn aumenta su tamao, ya que mayor es la friccin de
la molcula con el medio y menor es su carga por unidad de superficie. Por esta
razn, las molculas globulares se mueven con mayor facilidad que las
elongadas, ya que la esfera presenta la mnima superficie a igualdad de volumen.
As, molculas del mismo tamao y carga, pero de diferente forma, pueden tener
una movilidad electrofortica diferente y ser, por tanto, separables mediante una
electroforesis.

2.3 TAMPN

Durante una electroforesis, se produce una electrolisis del agua por accin del
campo elctrico, lo cual genera protones en la proximidad del nodo e iones
hidroxilo en el ctodo. El tampn es, por esta razn, esencial durante la
electroforesis para evitar que el nodo se acidifique y el ctodo se haga ms
bsico, pero no debe afectar a las molculas a separar.
Adems, la fuerza inica condiciona la movilidad electrofortica de las
substancias a separar, ya que influye en su esfera de solvatacin y en la
conductividad de todo el sistema, por lo tanto, es necesaria una fuerza inica
suficiente para mantener el pH y la conductividad durante todo el proceso, pero
no muy elevada, ya que llegara a interferir en el sistema.
Normalmente, se emplean tampones con fuerzas inicas moderadas (0.05-
0.10M), siendo el pH la caracterstica que debe ser ms controlada, puesto que
determina la carga de la muestra.

Conviene sealar tambin que atendiendo a la distribucin del tampn, los
sistemas se clasifican en continuos cuando se emplea un nico tampn en el
proceso, y discontinuos cuando se emplean, al menos, dos tampones de pH y
composicin diferentes.

2.4 SOPORTE


La simple presencia del soporte en una electroforesis hace que se presenten
una serie de fenmenos de elevada trascendencia para el resultado del
proceso:
Adsorcin. Es una retencin inespecfica de las molculas de la muestra
sobre el soporte, por lo que afecta negativamente a la resolucin,
ensanchando las bandas de migracin.
Electroendsmosis (EEO). Es un fenmeno que se da en algunos soportes
(sobre todo en los no restrictivos de tipo I), en los que aparecen cargas
negativas, debidas a grupos carboxilo o sulfato, al estar en contacto con una
disolucin inica.
Al aplicar el campo elctrico, los iones y las molculas se desplazan segn
su carga, pero en su migracin se encuentran con un flujo de cationes
desplazndose sobre la superficie del soporte y otro de aniones hacindolo
por el centro de los poros. Este flujo orientado se llama flujo
electroendosmtico. El EEO va en contra de la resolucin de una
electroforesis, ya que las bandas de la muestra se ensanchan y se
distorsionan; sin embargo, la EEO contribuir a una mejor resolucin en las
inmunoelectroforesis y en la electroforesis
Tamizado molecular. Es un efecto debido al mayor o menor reticulado de los
soportes; cuanto ms tupida sea la red de fibras, menores sern los poros. El
movimiento de las molculas a travs del soporte es ms o menos fcil en
funcin de su tamao respecto al de los poros; aquellas molculas cuyo
tamao se aproxime al del poro, ver impedido su avance respecto a aquellas
cuyo tamao sea muy inferior. Por esta razn, el soporte acta como un
cedazo que separa o tamiza las molculas en funcin de su tamao.
EJEMPLOS:
Papel: sencillo, pero con elevada adsorcin debido a los grupos hidroxilo de
la celulosa.
Acetato de celulosa: los grupos OH estn acetilados, lo que reduce la
adsorcin; baja tincin de fondo; es posible transparentarla o disolverla para
detectar y recuperar los componentes separados.
Almidn: pasta de almidn cuyos granos se han disgregado en un tampn
caliente (se hinchan). Actualmente se utiliza poco, ha sido sustituido por la
poliacrilamida.
Agarosa: polisacrido, producto purificado de algas (composicin similar al
agar-agar). Se disuelve en caliente (50-60C) y al enfriar solidifica formando
un gel, de alta porosidad.
Poliacrilamida: el gel es el resultado de la polimerizacin qumica de una
mezcla de acrilamida y bisacrilamida. Regulando la concentracin de ambas y
su proporcin se consiguen distintas porosidades, siempre menores que la de
los geles de agarosa.
2.5 COLORANTES PAR LA DETECCIN
Se pueden emplear sustancias coloreadas o fluorescentes que se unan a las
protenas o los cidos nucleicos.
En el primer caso suelen ser colorantes orgnicos que interaccionan con las
protenas de forma poco selectiva, principalmente electrosttica. Ejemplos:
azul brillante de Coomassie, negro amido, rojo Ponceau.
Para los cidos nucleicos se usa el azul de metileno o, ms frecuentemente,
compuestos fluorescentes e intercalantes, como el bromuro de etidio (vase
figura). Un compuesto intercalante es aqul que se introduce entre los pares
de bases apilados del DNA.
Tras la electroforesis, el gel se sumerge en un recipiente con una disolucin
del colorante y se espera a que aqul se impregne y as el colorante se una a
las molculas separadas en el gel. Tras lavar el gel para eliminar el exceso de
tincin no unida especficamente, se observa, fotografa o cuantifica
mediantedensitometra.


3. APLICACIONES

Determinacin de la Masa Molecular
Como se ha indicado, se puede obtener una estimacin de la masa molecular (en kDa)
de protenas empleando SDS-PAGE, y de fragmentos de DNA (en pb) empleando
electroforesis en agarosa. En ambos casos, en uno de los pocillos del gel se carga una
mezcla de molculas patrn de tamao conocido, con el fin de poder trazar la curva de
calibrado. Para las protenas, la validez del dato obtenido depende de que la
desnaturalizacin con SDS haya sido completa y de que se hayan separado las
subunidades gracias a la reduccin con mercaptoetanol; adems, la presencia de
oligosacridos en las glicoprotenas altera la movilidad, que ya no proporciona valores
de masa molecular fiables.
Determinacin del punto isoelctrico
Como se ha indicado, mediante isoelectroenfoque se obtiene una medida del punto
isoelctrico de las protenas (pH
I
o pI).
Isoenzimas
Las variantes de una enzima, con pequeas diferencias en su estructura y en su actividad
enzimtica, se analizan rutinariamente mediante electroforesis o, en especial, mediante
isoelectroenfoque. De hecho, los nombres de las isoenzimas derivan a veces de su
movilidad electrofortica. Se puede aplicar anlogamente a las isoformas de protenas
no enzimticas.
Mapas de restriccin
Una de las formas de estudiar la secuencia de los cidos nucleicos, en especial el DNA,
consiste en tratarlo con distintas enzimas de restriccin, analizar mediante electroforesis
en gel de agarosa los fragmentos resultantes e intentar reconstruir la secuencia de la
molcula original formando su mapa de restriccin, uno de los tipos de mapa fsico.
Secuenciacin de cidos nucleicos
La obtencin de la secuencia completa, nucletido a nucletido, tambin depende del
anlisis electrofortico de fragmentos de DNA, tanto en el mtodo qumico de Maxam y
Gilbert como en el mtodo enzimtico de Sanger. Se utilizan en este caso geles de
poliacrilamida, debido al tamao pequeo de los fragmentos, pudindose resolver
fragmentos que se diferencian en un solo nucletido.




PREPARACIN DEL GEL DE AGAROSA Y CARGA DE LA
MUESTRA