TEMA: ELECTROFORESIS

FUNDAMENTOS DE LA TÉCNICA
• Electroforesis consiste en la migración de partículas cargadas sometidas a la influencia de un
campo eléctrico, de tal forma que las moléculas con carga positiva migran al cátodo (electrodo
con carga negativa) y las moléculas con negativa, migran al ánodo (electrodo con carga
positiva).

• Biomoléculas tiene rasgos diferenciales como la carga que presentan y que pueden cambiar en
función del pH del medio en que se encuentren.

• Velocidad de migración influenciada por las características de las biomoléculas que migra
(carga que transporta), la intensidad del campo eléctrico y las características del medio en la
que tiene lugar la migración

COMPONENTES DE UN SISTEMA ELECTROFORÉTICO

1. Fuente electroforética

 Proporciona corriente eléctrica continua estabilizada

 Generación de un campo eléctrico
 Existen diferentes tipos de fuentes, pero generalmente
proporcionan corriente eléctrica de 0 a 150 mA y de 0
a 50 voltios

2. Dispositivo donde tiene lugar la electroforesis

 Consta de un recipiente o cubeta en el que se introduce el medio de soporte

 Tampón, ayuda a mantener constante el ph del medio, y debe encontrarse en contacto con los
electrodos.

Naturaleza de los La carga transportada por cada molécula (positiva o negativa) determina el
compuestos a sentido de la migración.
separar
La magnitud de la molécula determina la velocidad relativa de la migración de
la molécula.

pH del medio es mayor (más básico) que el punto isoeléctrico (pI) de la

molécula, dicha molécula transportara carga neta negativa por lo que migrara
hacia el ánodo.
pH del medio es menor (más ácido) que el punto isoeléctrico (pI) de la
molécula, dicha molécula transportara carga neta positiva por lo que migrara
hacia el cátodo.
Las moléculas grandes migran a menor velocidad debido al incremento de
fuerzas electrostáticas y de fricción ejercidas por su interacción con el medio.

NATURALEZA DE LAS PROTEÍNAS

 La carga de una proteína será más negativa cuanto más básico

sea el pH del tampón y más positiva cuanto más acido sea éste.

 Las moléculas de tamaño similar, pero con diferentes formas,

tales como proteínas de tamaño parecido pero que sean de tipo
fibroso o globulares, exhiben distintas características
migratorias a causa de las fuerzas de fricción y electrostáticas
que se establecen, dependiendo también de la forma.

CAMPO ELÉCTRICO

 La movilidad electroforética de una molécula es directamente proporcional a la carga que

presenta e inversamente proporcional a su tamaño y a la viscosidad del medio en que
transcurre la electroforesis.

TAMPÓN

 Establece el pH del medio en el que tiene lugar la separación.

 Mayor concentración del tampón disminuye la velocidad de migración de la muestra.
 Disminuir la concentración del tampón puede mejorar la resolución electroforética, sin
embrago es importante no reducir demasiado, porque esto puede afectar la resolución.
SOPORTES

 Relativamente inertes, sin embargo, pueden

ejercer efectos como adsorción,
electroendósmosis y cribado molecular.
 Adsorción: Algunos soportes pueden adsorber las
moléculas que se separan por electroforesis,
produciendo formación de colas y reduciendo la
velocidad de migración. Ejemplo: Papel
 Electroendósmosis: Algunos, soportes
electroforéticos presentan cargas negativas, estos
grupos se rodean de cargas positivas, provocando
redistribución de las cargas de la solución. Ejemplo: Geles de agarosa
 Cribado molecular: Algunos soportes son geles, los compuestos migran a través de los poros
del gel, y algunas moléculas son mas grandes que los poros por lo que tienen mayor dificultad
para migrar.

TIPOS DE ELECTROFORESIS
Se suele hablar de 3 tipos de electroforesis:

1. De frente móvil: los componentes de la muestra están presentes en toda la disolución y se

determina ópticamente la posición del frente de avance o frontera con el disolvente.
2. Zonal: la muestra se aplica como una mancha o banda y sus componentes migran a través
de un disolvente, utilizando además un medio que da soporte a éste. En este caso no se
determina la movilidad, sino que el único objetivo de la técnica es separar los componentes
de la muestra.
3. Continua: la muestra se aplica también en una zona, pero se suministra continuamente a
lo largo del proceso

Medios de soporte para realizar la electroforesis

La muestra debe situarse en o sobre un medio soporte, principalmente para evitar perturbaciones
mecánicas y corrientes de convección durante la separación. En algunos soportes (papel o
similares) la muestra queda sobre la superficie y avanza a lo largo de ella, con escasa fricción, por
lo que el mecanismo principal de separación es la magnitud de la carga de cada componente de la
muestra.
  Papel: sencillo, pero con elevada adsorción debido a los grupos hidroxilo de la celulosa.
 Acetato de celulosa: los grupos –OH están acetilados, lo que reduce la adsorción; baja
tinción de fondo; es posible transparentarla o disolverla para detectar y recuperar,
respectivamente, los componentes separados.
 Almidón: pasta de almidón cuyos granos se han disgregado en un tampón caliente (se
hinchan). Actualmente se utiliza poco, ha sido sustituido por la poliacrilamida.
 Agarosa: polisacárido, producto purificado de algas (composición similar al agar-agar). Se
disuelve en caliente (50-60°C) y al enfriar solidifica formando un gel, de alta porosidad.

Medios de baja fricción Medios de elevada fricción

papel gel de almidón
acetato de celulosa gel de agarosa
gel de poliacrilamida
gel de agarosa+poliacrilamida
separación principalmente por carga separación por carga, tamaño y forma
 Poliacrilamida: el gel es el resultado de la polimerización química de una mezcla de
acrilamida y bisacrilamida. Regulando la concentración de ambas y su proporción se
consiguen distintas porosidades, siempre menores que la de los geles de agarosa.

Modos de disposición del soporte

 Horizontal: En papel, para aminoácidos u otras moléculas pequeñas; en soportes similares

(especialmente, acetato de celulosa), para proteínas.

En gel de almidón o de agarosa, para proteínas y especialmente para ácidos nucleicos. Casi siempre
el tampón cubre el gel (para evitar que se seque debido al calentamiento sufrido al pasar la
corriente), denominándose por ello “electroforesis submarina”.Se aplica la muestra depositándola
(con pipeta o un aplicador específico) como una gota sobre el soporte (papel, acetato de celulosa)
o dentro de un “pocillo” creado en el gel.
  Vertical:

Se usa casi exclusivamente con gel de

poliacrilamida (más resistente físicamente, no se
desliza), para proteínas o para ácidos nucleicos de
pequeño tamaño. El gel puede rellenar tubos de
vidrio (este formato ya apenas se usa) o estar
contenido entre 2 placas rectangulares.

Contacto eléctrico y disolvente gracias al tampón

que embebe el gel y llena las cubetas o
compartimentos del ánodo y cátodo.

La muestra se deposita con micropipeta llenando un

“pocillo” creado al polimerizar el gel. En cuanto a la composición del gel hay dos variantes:
electroforesis continua (un solo tipo de gel) y electroforesis discontinua (2 tramos de gel de
composición ligeramente diferente).

EJEMPLO APLICADO
Cálculo del punto isoeléctrico en ovoalbúmina
Necesario
Aparato para electroforesis de alta tensión
Varias tiras de papel (5 x 35cm y 5 x 2,5cm).
Electrodo de bloque de platino.
Vasos de precipitación
Cubeta.
Vasos de precipitación.
Pipeta de glucemia.
Disolución de ovoalbúmina en agua (1gr/L).
Tampón de pH 1,9 - 4,6 - 9,2.

Ensayo
Se ilustrará el cálculo del punto isoeléctrico de una proteína tomando como ejemplo la
ovoalbúmina

Procedimiento
Las tiras se empapan en disolución tampón y se libera el líquido en exceso. A continuación
se coloca las tiras más largas una distancia de 1cm.Arriba y abajo se colocan las tiras de
2,5 x5cm que no deben tocar a sus vecinas, sobre estas tiras se coloca los electrodos de
bloque de platino en la mitad de una tira se coloca la disolución de ovoalbúmina. La
electroforesis dura de 2 a 3 horas bajo 1000-2000V. Después de 15 min se coloca las tiras
en disolución de negro de amido. Se coloca 5-10min en metanol/ácido acético glacial y
ácido acético hasta que este Blanco se puede dejar durante más tiempo en la disolución
decolorante eventualmente toda la noche.

Resultados
Se calcula a partir de los tampones con los que ha sido tratado el papel y en el que la
ovoalbúmina avanza despacio teóricamente es de 4,6. La ovoalbúmina avanza sobre el
papel en parte a causa de la electroósmosis de esta forma se puede calcular el punto
isoeléctrico de otras proteínas, para l determinación exacta trabajar con mayor número de
tampones
 Para determinación más exacta se trabaja con más tampones.

Focalización Isoeléctrica

Electroforesis en que se establece un gradiente de pH en un medio de gel y las proteínas

migran hasta que alcanzan el sitio (o foco) en el cual el pH es igual a su punto isoeléctrico

Resultados
En el caso de la clara del huevo se ven dos bandas intensas en la proximidad de ánodo, de
intensidad media cerca del cátodo y aumentado hacia adentro, más allá por lo menos 3
intensidad débil a media cerca de ánodo, una en el centro por lo menos 2 cerca del cátodo.
De esta forma por lo menos se puede diferenciar 6 bandas más que en la separación
mediante electroforesis en papel

Observación
Cuando el punto isoeléctrico de las proteínas se encuentra fuera de la zona de pH elegida
no tiene lugar ninguna separación. Entonces se debe utilizar otra mezcla de anfolito
soporte. Para ensayos previos resulta apropiada una de este tipo con, a poder ser, un rango
mayor de pH, por ej. pH 3,5 – 10.

Bibliografía:

Roca,P., Jordi, O. & Rodrígiez,A. (2003). Bioquimica técnicas y análisis.

Yamul, D. (2008). Manual de procedimientos de electroforesis para proteínas y

ADN. Obtenido de:

http://sedici.unlp.edu.ar/bitstream/handle/10915/48974/Documento_competo.pdf-
PDFA.pdf?sequence=3