Determinaciones Analíticas

en Leche
1. Introducción.
2. Determinación de la Acidez
3. Determinación del pH
4. Determinación de la Materia
Grasa
5. Prueba de Estabilidad
6. Prueba de la Fosfatasa
7. Detección de Inhibidores
Determinaciones analíticas en leche. / [López, A.L.; Barriga, D.; Jara, J.; Ruz, J.M.]]. –
Córdoba. Consejería de Agricultura y Pesca, Instituto de Investigación y Formación Agraria y
Pesquera, 2015. –1-26 p. Formato digital (e-book) - (Tecnología, Postcosecha e Industria
Agroalimentaria)

Leche - Quesos - Calidad – Acidez - pH – Materia grasa – Estabilidad – Inhibidores – Fosfatasa

- Sistema de Autocontrol – Análisis leche

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Determinaciones analíticas en leche.

© Edita JUNTA DE ANDALUCÍA. Instituto de Investigación y Formación Agraria y Pesquera.
Consejería de Agricultura y Pesca.
Córdoba, Noviembre de 2015.

Autoría:
Ángel Luis López Ruiz1
Diego Barriga Velo1
Jesús Jara Muñoz1
José María Ruz Luque1

1
IFAPA, Centro de Hinojosa del Duque
 El presente documento constituye el material didáctico para la realización de las
Determinaciones prácticas de laboratorio del Módulo 1: “Recepción y almacenamiento de la leche”,
analíticas en leche. correspondiente al Programa Formativo de “Especialista en Quesería”. En estas
prácticas se realiza in situ, el control de calidad de la materia prima principal para la
1. Introducción elaboración de productos lácteos.

La leche es considerada como uno de los alimentos más completos en la nutrición

humana. Debido a su variada composición (proteínas, grasas, hidratos de carbono,
vitaminas y sales minerales), de su alta digestibilidad y su capacidad de
aprovechamiento por el organismo humano, de su sabor y de sus posibilidades de
empleo en la elaboración de otros productos alimenticios, la leche líquida y los
productos lácteos son alimentos indispensables para atender a las necesidades
biológicas del ser humano en todas sus edades.

Figura 1. El transporte de la leche se
realiza mediante cisternas homologadas
Con este documento se pretende dar una visión global en cuanto a la necesidad de
partir de una calidad de leche excelente, independientemente de la especie animal
de origen. La calidad de la leche abarca aspectos tales como las condiciones
higiénico-sanitarias, composición físico-química, así como las características
organolépticas del producto. Analizar la calidad de la leche permite obtener la
información necesaria para interpretar la evolución de cada uno de los parámetros,
que posteriormente se precisan controlar.

Las determinaciones analíticas que se desarrollan a continuación vienen establecidas

en los controles obligatorios en el centro lácteo del Real Decreto 1728/2007, para
leche de vaca y el Real Decreto 752/2011, para leche de oveja y cabra y en el
Reglamento 853/2004 relativo a higiene de los alimentos de origen animal. Además,
se incluyen otras determinaciones de gran utilidad para el desarrollo del proceso
Figura 2. Toma de muestras en el centro
tecnológico.
lácteo

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Determinaciones
analíticas en leche.
2. Determinación de
la Acidez
Figura 3. Acidómetro Dornic
2.1. Fundamento
Se entiende por acidez en la leche natural, certificada, higienizada, pasterizada,
esterilizada y uperizada, al contenido aparente de ácido, expresado en gramos de
ácido láctico por 100 ml de leche (porcentaje %), grados SOXHLET-HENKEL (S-H) y
en Grados Dornic.
La acidez total de una leche se determina por volumetría o titulación. Lo que se
pretende es la saturación de las funciones ácidas de la leche mediante un producto
alcalino que, en presencia de un reactivo indicador (solución alcohólica al 2 % de
fenolftaleína) descubre mediante un cambio de color, la neutralización del ácido de la
leche por el álcali al final de la reacción.
La solución alcalina más empleada en la valoración de la acidez de la leche es el
hidróxido sódico (NaOH) 0,111 N (N/9).
2.2. Material y reactivos utilizados
• Acidómetro Dornic, que consta:
- Base de plástico y frasco de plástico
- Bureta graduada de enrase automático y tubo de goma
• Frasco cuentagotas para el indicador
• Pipeta graduada de 10 ml
• Vaso de precipitados de 100 ml
• Sosa Dornic N/9
• Solución de fenolftaleína al 2%
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 2.3. Procedimiento
Determinaciones
1) Homogeneizar la leche utilizando una varilla agitadora antes de tomar la
analíticas en leche.
muestra.

2. Determinación de 2) Depositar en un vaso de precipitado 10 ml de la leche problema.

la Acidez
3) Añadir 4-5 gotas de fenolftaleína.

4) Enrasar la bureta con sosa N/9, presionando el frasco de plástico.

5) Dejar caer gota a gota la sosa N/9 sobre la leche, agitando el vaso de
precipitado al mismo tiempo.

6) La valoración concluye cuando aparece una coloración rosa débil, que debe
persistir al menos durante unos segundos.

7) Lectura en la bureta de los ml de sosa N/9 gastados.

2.4. Resultados
Los resultados los expresamos en grados Dornic o en gramos de ácido láctico por
100 ml de leche.

1º Dornic = 0,1 ml de Sosa N/9 = 0,1 g de ácido láctico

Figura 4. La prueba de la acidez nos
permite conocer el estado de la leche

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Figura 5. Esquema de la determinación de acidez

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 Supongamos que para determinar la acidez de una leche necesitamos 1,6 ml de sosa

Determinaciones Dornic; esa leche tiene entonces una acidez de 16º Dornic o 1,6 g de ácido láctico /

analíticas en leche. 100 ml de leche.

La leche tiene una acidez natural como consecuencia de la presencia de ácido cítrico,
2. Determinación de anhídrido carbónico, caseína, lactoalbúmina, fosfatos y cloruros.
la Acidez Esta acidez natural está en la leche de vaca en torno a los 14-18º Dornic, siendo
muy similar en la leche de cabra. En la leche de oveja, la acidez normal alcanza los
18-25º Dornic.

Una acidez en cabra y vaca inferior a 14º Dornic puede indicar procedencia de
animales enfermos (mamitis), leches calostrales o alteradas (aguadas). La acidez por
encima de 18º Dornic, nos indican leche procedente de ordeños poco higiénicos o
que han pasado más de 10 horas sin refrigeración.

Según el Real Decreto 1728/2007 (para leche de vaca) y el Real Decreto 752/2011
(para leche de cabra y oveja), en los que se establece la normativa básica de control
que deben cumplir los operadores del sector lácteo, se debe determinar la acidez o la
estabilidad al alcohol de la leche en el centro lácteo.

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 3.1. Fundamento
Determinaciones
analíticas en leche. El pH es una medida de la concentración de protones o iones hidrógeno, es decir, de
la acidez o basicidad de un medio.

3. Determinación En numerosos alimentos el pH es un factor importante para su estabilidad, ya que es

del pH determinante en el crecimiento de grupos de microorganismos específicos.

El valor de un pH neutro es de 7; por debajo de este valor, el pH se considera ácido

y por encima del mismo el pH es básico. Los resultados se expresan en unidades de
pH a 20ºC.

La determinación del pH de una leche se realiza directamente sobre la misma con

ayuda de un pH-metro. La precisión entre los resultados de dos determinaciones
consecutivas debe ser de 0,10 pH.

El pH de una leche es inversamente proporcional a la acidez Dornic; es decir, a

mayor acidez menor pH.

El pH normal de la leche se encuentra entre 6,6 y 6,8.

3.2. Material y reactivos utilizados

 pH-metro con electrodo de vidrio (sensibilidad 0,05 pH)

 Vasos de precipitado

 Varilla agitadora de vidrio

 Soluciones tampón de referencia, pH 7 y pH 4,01

 Agua destilada
Figura 6. Escala de pH

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 3.3. Procedimiento
Determinaciones
1) Calibrar el pH-metro con las soluciones tampón de referencia, empezando
analíticas en leche.
siempre por la de pH 7.

3. Determinación Entre mediciones lavar siempre el electrodo con agua destilada.

del pH
2) Llevar la muestra hasta los 20ºC, y agitar hasta conseguir una perfecta
homogeneización.

3) Sumergir el electrodo del pH-metro en la muestra de leche y leer el valor en el

visor.

3.4. Resultados
Las mediciones se expresan en unidades de pH a 20ºC, con dos cifras decimales.
Figura 7. pH-metro con sonda para
líquido Si el valor de pH es diferente, puede deberse a:

• Un deficiente estado sanitario de la glándula mamaria incrementa el pH de la

leche.

• El desarrollo de microorganismos que degradan la lactosa en ácido láctico

hace disminuir el pH de la leche.

• Desarrollo de microorganismos alcalinizantes que hacen aumentar el pH de la

leche
Figura 8. Soluciones tampón para la
calibración del pH-metro

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Figura 9. Esquema de la determinación del pH

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 4.1. Fundamento
Determinaciones
analíticas en leche. Para la determinación de la materia grasa de la leche debemos medir la grasa una
vez separada del resto de componentes de la leche, después de destruir su estado
globular o bien extraerla mediante un disolvente.
4. Determinación
de la materia grasa La grasa al formar una emulsión muy frágil, puede destruirse mediante la utilización
de ácidos concentrados y calientes, que además destruyen la membrana globular y
disuelven totalmente la caseína, por lo que hay una excelente separación en dos
fases.

Para la determinación de la materia grasa liberada se utiliza el Método de Gerber

(volumétrico).

El MÉTODO GERBER es una técnica volumétrico de rutina, rápida y precisa que se

basa en medir el volumen de la fase grasa, separada de la acuosa por centrifugación
en aparatos especialmente graduados.

Consiste en la liberación total de la grasa de la leche por disolución de las sustancias

proteicas, separación de la grasa por centrifugación y posterior medida volumétrica
de esta.

La leche se deposita en un butirómetro y se añade ácido sulfúrico, el cual disuelve

las proteínas y alcohol isoamílico que facilita la separación de la grasa.

Mediante centrifugación, conseguimos la separación total de la grasa procediendo a

su lectura gracias a la escala graduada del butirómetro.

Figura 10. Glóbulos de grasa de leche de Se expresa el contenido de grasa de la leche en porcentaje por 100 ml. de leche.
vaca al microscopio

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 4.2. Material y reactivos utilizados
Determinaciones
analíticas en leche. • Pipetas aforadas de 11 ml.

• Butirómetro original Gerber, que pueden ser:

4. Determinación
de la materia grasa - Escala de 0-5%, con divisiones de 0,1 ml, para leche de vaca.

- Escala de 0-9%, con divisiones de 0,1 ml, para leche de cabra.

- Escala de 0-14%, con divisiones de 0,1 ml, para leche de oveja.

• Tapones cónicos de butirómetros y vástago para tapones.

• Centrífuga Gerber con calefacción (1000-1200 rpm)

• Pipeta Kipp (medidor automático) para ácido sulfúrico, de 10 ml.

• Pipeta Kipp para alcohol isoamílico de 1 ml.

• Gradilla

• Baño María con termostato regulable, en caso de que la centrífuga no disponga

de calefacción.

Figura 11. Butirómetro Gerber (con

escala 0 - 9 %)

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 4.3. Procedimiento
Determinaciones
analíticas en leche. 1) Homogenizar la leche evitando la formación de espuma. Depositar en el
butirómetro 10 ml de ácido sulfúrico 90-91 % según Gerber, con cuidado de
no manchar el cuello del butirómetro.
4. Determinación
de la materia grasa 2) Tomar 11 ml de la leche problema y depositarlos en el butirómetro, dejándola
caer por las paredes del mismo. La posición correcta de la pipeta y el cuello del
butirómetro sería formando un ángulo de 45º.

3) Añadir 1 ml de alcohol isoamílico, procurando no manchar el cuello del

butirómetro.

4) Cerrar el butirómetro ayudándonos con el empujador.

5) Agitar con cuidado el butirómetro hasta conseguir la total disolución de las

fases. Colocar los butirómetros en la centrífuga en posiciones opuestas y con los
tapones hacia abajo. Centrifugar durante 5-7 minutos entre 1000-1200 rpm y
60-65 ºC.

6) La lectura debe realizarse a una temperatura de 60-65 ºC, y siempre

manteniendo el butirómetro en posición vertical. Si la centrífuga no tiene
calefacción, debemos mantener los butirómetros antes y después de la
centrifugación, durante 5 minutos en el baño maría programado a 65 ºC.

La lectura se lleva a cabo, haciendo coincidir uno de los extremos de la columna

de grasa con una unidad entera de la escala del butirómetro, y posteriormente
contando el número de grados.
Figura 12. El método Gerber es un
método rápido de determinación de la
grasa

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Figura 13. Esquema de la determinación de la materia grasa

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 4.4. Resultados
Determinaciones
analíticas en leche. La lectura obtenida en el butirómetro Gerber, expresa el contenido en materia grasa
de la leche en porcentaje en volumen, es decir, % de materia grasa en 100 ml de

4. Determinación leche.

de la materia grasa La cantidad de materia grasa presente en cualquier leche varía en función de:

- La alimentación del animal.

- La estación del año.

- El estado de lactación del animal y el número de partos.

- La raza y la genética.

- Manejo y estado sanitario del animal.

No obstante, a continuación se exponen valores porcentuales medios de la materia

grasa de la leche de vaca, cabra y oveja.

TIPO DE LECHE

Vaca Cabra Oveja

3,6 % 3,8 % 7,9 %

Figura 14. La grasa de la leche queda en

la parte superior del butirómetro

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 Antes de someter una leche cruda a un tratamiento térmico es preciso asegurarse de

Determinaciones su estabilidad al calentamiento que va a sufrir.

analíticas en leche. Los componentes de la leche se encuentran en estado de equilibrio, existiendo

numerosas causas o factores que pueden alterar este estado de equilibrio, haciendo
que la leche no sea estable y por tanto no resista los tratamientos térmicos. Estas
5. Prueba de
causas o factores pueden ser:
estabilidad al
alcohol - Exceso de ácido láctico (la más frecuente). Una leche ácida será inestable.

- Presencia de conservantes (agua oxigenada) y sustancias extrañas.

- Larga conservación de la leche. Las llamadas “leches viejas”, que han sido
conservadas en frío durante 4-5 días.

- Estado de los animales. Leches mamíticas o calostrales.

- Largo tiempo de transporte y excesiva agitación de la leche

Existen diversas pruebas que permiten determinar la estabilidad de la leche cruda y

seleccionarla para un determinado tratamiento térmico: Prueba del Alcohol,
Prueba de la Ebullición y Prueba del Fosfato

5.1. Fundamento
Al añadir una cierta cantidad de alcohol etílico a la leche se produce una parcial o
total deshidratación de ciertos coloides hidrófilos, lo que puede conducir a su
desnaturalización y a la pérdida del estado de equilibrio seguida de floculación.

Dicha desnaturalización sólo ocurre cuando se llega a un cierto grado de alcohol en la

Figura 15. Preparación de la graduación mezcla final, por debajo del cual las leches estables no floculan.
necesaria con alcoholímetro

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 5.2. Material y reactivos utilizados
Determinaciones
• Tubos de ensayo
analíticas en leche.
• Pipetas de 5 ml

5. Prueba de • Agua destilada

estabilidad al • Alcohol etílico o etanol de diferente graduación
alcohol
a) según el tratamiento térmico al que se vaya a someter la leche:

- Pasteurización: alcohol de 67-68 %

- Esterilización: Alcohol de 72-74%

- Uperización: Alcohol de 76%

b) según la especie de la que proviene la leche a analizar, así:

- vaca y oveja: alcohol de 67-68%

- cabra: alcohol de 56-57%

Figura 16. La estabilidad es una prueba

sencilla para ver el estado de la leche

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 5.3. Procedimiento
Determinaciones
1) Homogeneizar la leche agitándola con una varilla agitadora.
analíticas en leche.
2) En un tubo de ensayo, depositar 5 ml de la leche problema.

5. Prueba de 3) Añadir 5 ml de etanol con la gradación correspondiente.

estabilidad al
alcohol 4) Mezclar invirtiendo el tubo varias veces

5) examinar la mezcla.

5.4. Resultados
Si no se observan coágulos en las paredes del tubo de ensayo, se considera que la
leche es estable a la temperatura de tratamiento térmico ensayado, que corresponde
con la graduación del alcohol utilizado.

Si se percibe la formación de coágulos en las paredes del tubo, indica que la leche no
es estable para ese tratamiento térmico en concreto.

Según el Real Decreto 1728/2007 (para leche de vaca) y el Real Decreto 752/2011
(para leche de cabra y oveja), en los que se establece la normativa básica de control
que deben cumplir los operadores del sector lácteo, se debe determinar la estabilidad
al alcohol o la acidez de la leche en el centro lácteo.

Figura 17. Leche inestable (izquierda) y

estable (derecha)

18 /26
5. Prueba de
estabilidad al
alcohol

Figura 18. Esquema de la determinación de la materia grasa

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 6.1. Fundamento
Determinaciones
analíticas en leche. La determinación de la fosfatasa es una prueba que permite comprobar la correcta
pasteurización de una leche; es decir, comprobar que el tiempo y la temperatura de
tratamiento térmico de pasteurización se ha realizado correctamente.
6. Prueba de la
fosfatasa La fosfatasa es una enzima que se encuentra en la leche cruda y se desnaturaliza por
el calor, por lo cual al pasteurizar la leche se destruye.

Para comprobar la existencia (mala pasteurización) de fosfatasa se usa un “método

colorimétrico”. La fosfatasa tiene la propiedad de desdoblar el fenilfosfato disódico en
fenol y fosfato de sodio. También existen tiras indicadoras para esta prueba.

Este método pone de manifiesto la existencia de fenol mediante un indicador de color

que reacciona con él formando un compuesto de color azul (existe fenol y por tanto
fosfatasa por lo que no se ha pasterizado correctamente). Si no existe fosfatasa
(leche bien pasterizada), no existe fenol y se forma un compuesto de color marrón.
Figura 19. Leche cruda (izquierda) y
pasteurizada (derecha)
6.2. Material y reactivos utilizados
• Tubos de ensayo con tapón de rosca

• Pipetas graduadas de 10 y 1 ml

• Varillas agitadoras de vidrio

• Estufa de incubación a 37ºC o Baño María

• Pinzas y gradilla y agua destilada para análisis

Figura 20. Tiras indicadoras para
fosfatasa (método alternativo al • Reactivo I, II y III
descrito)

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 6.3. Procedimiento
Determinaciones
analíticas en leche.
1) En 2 tubos de ensayo se depositan 10 ml de agua destilada para análisis y se
llevan a la estufa para que se pongan tibios o se atemperan con la mano.

6. Prueba de la 2) Añadir a cada tubo una tableta de Reactivo I y disolver con ayuda de una varilla.

fosfatasa 3) Cuando esté bien disuelta, añadir una tableta de Reactivo II y disolver.

4) Depositar en cada tubo 1 ml de la leche problema. Mezclar.

5) Llevar los tubos de ensayo a la estufa de incubación a 37ºC durante 1 hora.

6) Tras la incubación, añadir a cada tubo una cucharadita de Reactivo III.

7) Mezclar y llevar a incubación durante 10-15 minutos.

6.4. Resultados

Observar el color de los tubos de ensayo:

 Color marrón indica que no hay fosfatasa: Leche bien pasterizada.

 Color verdoso, indica que hay una pequeña cantidad de fosfatasa: Leche sin
pasterizar correctamente.

 Color azul fuerte, indica que hay fosfatasa: Leche cruda.

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Figura 21. Esquema de la determinación de la materia grasa

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 7.1. Fundamento
Determinaciones
analíticas en leche. La detección de inhibidores es una prueba que nos permite conocer la presencia en la
leche de antibióticos tales como los β-lactámicos y las tetraciclinas, y por tanto su
inutilización para el consumo humano.
7. Detección de
inhibidores Se trata de un test competitivo que utiliza dos receptores en una misma reacción.
Cuando se mezcla el reactivo contenido en el microtubo con la muestra de leche,
ambos receptores pueden unirse a sus correspondientes analitos durante la primera
incubación. Cuando la muestra de leche no tiene antibióticos, se produce la
coloración de las líneas de captura presentes en la tira reactiva, indicando la
ausencia de moléculas de antibiótico en la muestra.

La presencia de antibióticos en la muestra se determina por la débil coloración de las

líneas de captura existentes en la tira reactiva.

Figura 22. Se debe respetar el Periodo 7.2. Material y reactivos utilizados

de Supresión de cada antibiótico
La detección de inhibidores es una prueba que nos permite conocer la presencia en la
leche de antibióticos

 Microtubos

 Tiras reactivas

 Gradilla
Figura 23. No se puede ordeñar un
animal durante un tratamiento con
 Estufa de incubación
antibióticos

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 7.3. Material y reactivos utilizados
Determinaciones
analíticas en leche.
1) Sacar del test de inhibidores un microtubo.

2) Colocar una punta en la pipeta “minipet” y añadir 200 μl de la muestra de leche

7. Detección de al microtubo. Disolver el producto mezclándolo con ayuda de la punta de la

inhibidores pipeta hasta obtener un color rosa homogéneo.

3) Colocar en la estufa a 40ºC durante 3 minutos.

4) Finalizada la incubación, colocar una tira reactiva en el interior del microtubo

sumergiendo la parte de debajo de la tira (parte más gruesa) y realizar una
segunda incubación de otros 3 minutos.

5) Al terminar la segunda incubación, se extrae la tira reactiva, en la cual

aparecerá una, dos o tres líneas impresas.

7.4. Resultados
La interpretación visual se realiza a través de una comparación entre la intensidad de
color de la línea TEST y la Control. Las líneas TEST se corresponden con la inferior
relativa a β-lactámicos y con la superior correspondiente a tetraciclinas.

Si las líneas TEST son más visibles que la de control, la muestra se considera
NEGATIVA.

Figura 24. Test rápido de detección de

Si las líneas TEST son igual de visibles que la control o menos visibles que ésta, la
inhibidores con necesidad de incubación muestra se considera POSITIVA.

En caso de duda, la muestra se considera POSITIVA.

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Figura 25. Interpretación de test de inhibidores

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Determinaciones Analíticas
en Leche

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