ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL

1.- Fundamento:

La electroforesis 2D (IEF+SDS-PAGE) es la herramienta más empleada para el análisis

global y la separación de los componentes del proteoma (conjunto de proteínas que se
expresan a partir de un genoma en un momento dado). Dicha técnica pasa por las
siguientes etapas:

1. Preparación de la muestra; En este paso se emplean agentes caotrópicos, surfactantes y

agentes reductores. Los agentes caotrópicos, como la urea, provocan la desnaturalización
de las proteínas por ruptura de puentes de hidrógeno, dejando expuestos los residuos
hidrofóbicos que son solubilizados por los agentes surfactantes. Los agentes reductores,
como el DTT (Dithiothreitol, aunque también se emplean otros reductores alternativos no
cargados), completan la desnaturalización proteica por ruptura de puentes disulfuro.

2. Separación en la 1ª dimensión (Isoelectroenfoque); Separación de la mezcla de

proteínas según sus puntos isoeléctricos.

3. Separación en la 2ª dimensión (SDS-PAGE); Las proteínas se separan en función de su

peso molecular.

4. Revelado; Los métodos más usados son la tinción con azul Coomassie , que se fija a las
proteínas pero no al gel, la tinción fluorescente con Sypro Ruby y la tinción con Plata. La
tinción de azul Coomassie clásica puede detectar normalmente bandas de proteína de 50
ng, mientras que la tinción con plata incrementa este límite de sensibilidad en unas 50
veces

La inmunoelectroforesis cruzada o bidimensional requiere inicialmente la separación

electroforética de una mezcla de antígeno en una dirección perpendicular al fenómeno
final de precipitación o de etapa “rocket”. Esta es capaz de resolver mezcla de antígenos
altamente complejas y cuantificar cada uno de ellos .

Una muestra proteica es separada en un gel de agarosa (primera dimensión, izquierda).

Posteriormente se corta la porción superior del gel (derecha, línea horizontal) y se agrega
otro gel de agarosa que contiene anticuerpos contra los antígenos de interés. En este
punto se aplica otra electroforesis (segunda dimensión) en un ángulo de 90° con respecto
a la primera, para que se formen distintos arcos de precipitación antígeno-anticuerpo.

Ejemplo , en la figura siguiente: En la primera dimensión (horizontal) se corrió 3 µl de

suero humano, desde el origen (o) hacia el ánodo. En la segunda dimensión (vertical) se
corrió las proteínas en un gel con suero anti-humano total (9 µl/cm2), a pH 8,6. Nótese el
gran número de componentes que precipitan (tinción con Coomassie G-250). Se puede
identificar la pre-albúmina (p) y la albúmina (a), entre algunos otros arcos conocidos:

2.- Requerimiento y preparación de la muestra:

En una primera fase de la técnica, se lleva a cabo una electroforesis en gel clásica tras la
cual la banda longitudinal del gel, que contiene las fracciones a ensayar, se corta y se
transfiere a otra placa. Esta nueva placa se somete a una segunda electroforesis, en un
ángulo de 90°respecto a la primera corrida electroforética, empleando un gel que contiene
una concentración de anticuerpos comparativamente menor con respecto a los antígenos
correspondientes. Para una concentración de anticuerpos y un espesor de gel
determinados, la relación entre la respuesta de cada uno delos picos de precipitación y la
cantidad del antígeno correspondiente es lineal.
3.- Reactivos.:

IgG 4-8ºC

Suero total 4-8ºC

Albúmina 4-8ºC

Anticuerpo para IgG 4-8ºC

Agarosa™ UltraSpec 4-8ºC

Tampón de electroforesis (concentrado 25x) 4-8ºC

Tubos Microtest

Pipetas de 10 ml

Papel de filtro Cortadores para pocillos (“well cutters”)

Placas de Petri (60 mm)

4.- Instrumental:

Aparato de electroforesis horizontal

Fuente de alimentación

Micropipetas automáticas y puntas (5-50 μl)

Baño de agua

Portaobjetos para microscopio (1" x3")

Agua destilada

Vaso de precipitación de 400 a 600 ml

Probeta graduada de 1000 ml

Quemador Bunsen, Placa calefactora o Microondas

Contenedor con tapa (lo suficientemente grande como para contener bandejas de
electroforesis)

Toallas de papel

Envoltura o lámina de plástico (film transparente)

Estufa de Incubación (37ºC)

5.- Interferencias analíticas.:

- Los sistema electroforéticos que no son de alta resolución, que no pueden detectar
pequeñas bandas monoclonales que puedan co-migrar con proteínas normales
particularmente en la zona beta globulinas.
-
-Pacientes que reciben terapias monoclonales

6.- Aplicación clínica e interpretación de resultados.

La aplicación principal es la proteómica de expresión; con esta técnica se puede comparar

de forma cualitativa y cuantitativa la expresión de proteínas de dos muestras. La aparición
y desaparición de manchas proporciona información sobre la expresión diferencial de
proteínas, mientras que la intensidad de las mismas permite conocer sus niveles de
expresión. Este método de trabajo, llamado DIGE (Difference gel electrophoresis), permite
la comparación de tejidos normales con tejidos enfermos; o la de células tratadas con
drogas o sometidas a diferentes estímulos. Para esto se procede al marcaje de muestras
con fluorocromos (como por ejemplo Cy3, Cy5, Cy2) antes del IEF, y finalizado el
experimento se realiza la visualización en escáner confocal y análisis automático.

Por ejemplo, se ha utilizado para estimar el grado de conversión de tercer componente del
complementario (C3) a la forma inactivada C3c.