Practicas de Biologia Molecular 2019

MANUAL DE PRACTICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR R.
NAVARRO
B. R. MESTAS
PRACTICA N° 1
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO, MANEJO

DE MICROPIPETAS
Para al buen desempeño en las prácticas de laboratorio es necesario conocer las

recomendaciones fundamentales sobre bioseguridad. De esta manera además de
proteger el material de trabajo, se evita la contaminación de quienes manipulan los
diferentes reactivos y sustancias; y también se garantiza la no-exposición a agentes
peligrosos y la obtención de resultados confiables.
En el Laboratorio de Biología Molecular se trabaja con DNA animal, vegetal y de

microorganismos y con reactivos químicos potencialmente peligrosos. La mayoría de las
siguientes recomendaciones son procedimientos de rutina para el trabajo en el
laboratorio.
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD
Algunos reactivos utilizados en los procedimientos descritos en este manual tienen
la característica de ser tóxicos, irritantes, corrosivos, cancerígenos, mutagénicos y
neurotóxicos, por lo tanto los estudiantes siempre deberá usar guantes, mascarillas,
lentes protectores y mandil para evitar un contacto directo o accidental con ellos.
La luz ultravioleta (UV) empleada para la visualización de DNA a 385 nm de

longitud de onda con 8W de potencia ocasiona graves daños oculares y epiteliales, por lo
tanto, los estudiantes deberán contar con una lámina de policarbonato transparente
ubicada entre la lámpara y el punto de observación. Además, deberá usar lentes de
protección contra rayos UV del mismo material.
El voltaje utilizado para la electroforesis puede generar quemaduras por descarga

eléctrica. Aunque la mayoría de cámaras de electroforesis han sido diseñadas para evitar
el contacto directo con la electricidad, el operador deberá asegurarse de mantener la
fuente poder apagada o desconectada al momento de manipular el equipo.
El proceso de ebullición de las proteínas en baño maría a 100ºC deberá realizarse

con extremo cuidado para evitar quemaduras. En este sentido, se recomienda utilizar
envases de vidrio resistentes a altas temperaturas (por ejemplo: Pyrex) y gradillas
flotantes de polipropileno para colocar los viales.
MANEJO DE MUESTRAS Y REACTIVOS EN BIOLOGÍA MOLECULAR

El estudiante deberá usar guantes de látex mientras se encuentre trabajando con
DNA y proteínas. Este paso ayudará a evitar la degradación de las biomoléculas por
acción de las nucleasas o proteasas presentes en la superficie de las manos. Asimismo,
el uso de guantes evitará que el estudiante se exponga ante algún posible riesgo de
intoxicación por material infeccioso.
1|
MANUAL DE PRACTICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR R. NAVARRO
B. R. MESTAS
El material biológico debe ser conservado a bajas temperaturas. El DNA genómico

y los productos de amplificación pueden ser almacenados a 4°C, mientras que el DNA
plasmídico a –20°C. Las proteínas deben ser conservadas a –80°C o en su defecto a –
20°C. Todas las muestras biológicas deben ser repartidas en alícuotas y en volúmenes
pequeños para evitar etapas de descongelamiento o congelamiento drásticos que
ocasionarían un eventual deterioro de las moléculas.
Debido a la importancia que tiene la medición de volúmenes en los procedimientos

de electroforesis, se sugiere que los insumos destinados para tal fin, las micropipetas y
puntas de 10, 20, 200 y 1000 ul, viales de 0,5 y 1,5, tubos de 15, 50 y 250 ml y los
equipos de laboratorio, cuenten con un certificado que acredite la calidad del producto
(Ej.: certificado ISO 9000, ISO 8655, DIN 12650).
Se recomienda que las puntas que se insertan en las micropipetas y que tienen
contacto directo con las moléculas de DNA sean nuevas y estériles, a fin de evitar una
posible contaminación de la muestra con nucleasas. Es importante señalar que es posible
trabajar con puntas previamente usadas, siempre y cuando estén libres de restos
orgánicos y hayan sido previamente esterilizadas en autoclave (121C a 1,5 psi). Con
respecto a la manipulación de las proteínas, no se exige el uso de puntas nuevas pero sí
se recomienda esterilizarlas previamente.
Se recomienda que los equipos empleados para los procedimientos descritos en

este manual cuenten con un certificado de calidad que garantice su precisión y calibración
(Ej. ISO9000, ISO 8655, DIN 12650).
Los reactivos a usarse durante los procesos de extracción y purificación de ácidos

nucleicos y proteínas deben tener grado "molecular" para asegurar el éxito del
procedimiento. El uso combinado de reactivos de diferente grado de pureza puede llevar a
un fracaso del experimento.
LISTA DE SUSTANCIAS PELIGROSAS

1. Acetato de sodio. Ver ácido acético.
2. Ácido acético. Peligroso por inhalación, manejar con guantes y lentes de protección
en la campana.
3. Ácido bórico. Puede ser peligroso por inhalación, ingestión o absorción por la piel.
Utilizar guantes apropiados y lentes de protección y manipular en la campana de
extracción.
4. Ácido clorhídrico. Volátil y puede ser fatal en caso de inhalación, ingestión, o
absorción por la piel. Extremadamente destructivo para las mucosas, tracto
respiratorio, ojos y piel. Utilizar guantes apropiados y lentes de protección y manipular
con extrema precaución en la campana de extracción.
5. Acrilamida. Potente neurotóxico que se absorbe por la piel (con efecto acumulativo);
evitar inhalar el polvo, usar guantes y mascarilla de protección cuando se pesa y
preparar las soluciones en campana de extracción. En principio la poliacrilamida no
es tóxica pero debe manejarse con precaución, ya que puede contener restos de
acrilamida no polimerizada.
6. Ampicilina. Puede ser peligrosa por inhalación, ingestión o absorción por la piel.
extracción.
7. Azul de bromofenol. Puede ser peligroso por inhalación, ingestión, o absorción por
2|
B. R. MESTAS
8. la piel. Utilizar guantes apropiados y lentes de protección y manipular en la campana

de extracción.
9. Azul de Coomassie. Puede ser peligroso por inhalación, ingestión, o absorción por la
piel. Utilizar guantes apropiados y lentes de protección y manipular en la campana de
extracción.
10. Bis-acrilamida. Ver acrilamida.
11. Bromuro de etidio. Potente mutagénico y tóxico. Evitar respirar el polvo. Utilizar
guantes apropiados para pesarlo o trabajar con soluciones que contienen este
colorante.
12. Cloroformo. Altamente volátil e irritante para la piel, ojos, mucosas y tracto
respiratorio. Carcinógeno y puede dañar hígado y riñones. Evitar respirar sus
vapores. Puede ser peligroso por inhalación, ingestión, o absorción por la piel. Utilizar
guantes apropiados y lentes de protección y siempre manipular en la campana de
extracción.
13. Dimetilsulfóxido (DMSO). Puede ser peligroso por inhalación y absorción por la piel.
Utilizar guantes apropiados y lentes de protección y manipular en una campana de
extracción. El DMSO es combustible. Almacenar en un contenedor bien cerrado.
Apartar del calor, chispas y flamas.
14. Etanol. Puede ser peligroso por inhalación, ingestión, o absorción por la piel. Utilizar
guantes apropiados y lentes de protección y manipular en la campana de extracción.
15. Fenol. Extremadamente tóxico, altamente corrosivo y puede causar severas
quemaduras. Puede ser peligroso por inhalación, ingestión o absorción por la piel.
extracción. En caso de contacto con la piel, enjuagar con abundante agua y lavar con
jabón y agua pero nunca con etanol.
16. Hidróxido de sodio y soluciones que lo contienen. Altamente tóxico y cáustico.
Utilizar guantes apropiados, lentes de protección y mascarilla facial.
17. Isopropanol. Irritante y puede ser peligroso por inhalación, ingestión, o absorción por
la piel. Utilizar guantes apropiados y lentes de protección. No respirar el vapor. Alejar
del calor, chispas y flama.
18. Luz UV y radiación UV. Peligrosa y puede dañar la retina de los ojos. Es mutagénica
y carcinogénica. Utilizar pantalla protectora, mascarilla o lentes de protección.
19. N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamina (TEMED). Extremadamente destructivo para
tejidos, mucosas y tracto respiratorio superior, ojos y piel. Su inhalación puede ser
fatal. El contacto prolongado puede causar severa irritación y quemaduras. Utilizar
guantes apropiados y lentes de protección y manipular en campana de extracción.
Altamente inflamable, mantener lejos del calor, chispas y flamas.
20. Persulfato de amonio. Extremadamente destructivo para tejidos, mucosas y tracto
respiratorio superior, ojos y piel. Su inhalación puede ser fatal. El contacto prolongado
puede causar severa irritación y quemaduras. Utilizar guantes apropiados y lentes de
protección y manipular en campana de extracción.
21. Poliacrilamida. Ver acrilamida.
22. SYBR Green I. Se encuentra en solución concentrada 10,000X en DMSO, el cual es
una sustancia que transporta químicos a través de la piel y otros tejidos. Utilizar
guantes apropiados y lentes de protección.
23. Tris. Puede ser peligroso por inhalación y absorción por la piel. Utilizar guantes
apropiados y lentes de protección.
24. Xilen-cianol. Inflamable y narcótico a altas concentraciones. Puede ser peligroso por
inhalación y absorción por la piel. Utilizar guantes apropiados y lentes de protección y
manipular en una campana de extracción. Almacenar en un contenedor bien cerrado.
Apartar del calor, chispas y flamas.
3|
B. R. MESTAS
MANEJO DE MICROPIPETAS
En biología molecular, la habilidad para medir de manera exacta y reproducible y
transferir volúmenes pequeños de líquidos son críticos para obtener resultados útiles.
Para los volúmenes menores de 1 ml, el método más común para medir líquidos requiere
el uso de un dispositivo conocido como micropipeta.
TIPOS DE MICROPIPETAS
Los tipos: P1000, P200, y P20.
P1000 es útil para volúmenes de 200 hasta 1000 µL
P200 es útil para volúmenes de 20 hasta 200 µL.
P20 es útil para volúmenes de 0.5 hasta 20 µL.
MANEJO DE LA MICROPIPETA
1. Llenado de la pipeta
Colocar el pulgar sobre el mando o émbolo de pipeteado.
Oprimir el émbolo. Cuando el émbolo se presiona sentirá un punto de resistencia.
Éste es el primer “alto” o "tope". Si continúa presionando encontrará un punto donde
el émbolo ya no se mueve hacia abajo, este corresponde al segundo “alto” o "tope".
Oprimir el émbolo hasta el primer tope y colocar la punta dentro del líquido hasta una
profundidad de 2 a 3 mm. De una manera lenta y controlada, disminuya la presión del
émbolo para permitir que se desplace hacia arriba. No suelte el émbolo abruptamente, al
permitirlo causará que el líquido pueda salpicar dentro de la punta produciendo
volúmenes inexactos y generando contaminación de la pipeta. Una vez el émbolo se haya
desplazado hasta arriba mantenga la micropipeta en el líquido durante un segundo, esto
evita que se aspire aire en la parte final.
2. Expulsión de la muestra
Llevar la micropipeta al envase en el cuál quiere añadir el líquido. Se apoya la punta
en la pared del recipiente sin evitar la salida de la muestra. Oprima el émbolo hasta el
primer tope y luego hasta el segundo tope. Haga este procedimiento a una velocidad
moderada, hacerlo muy rápido hará que queden gotas de muestra en la punta. Si observa
cuidadosamente, entonces notará que al oprimir hasta el segundo alto se expele todo el
líquido de la punta.
Lo anterior es cierto para la mayoría de soluciones acuosas, excepto para las

soluciones de alta viscosidad. Para solventes orgánicos o para soluciones conteniendo
grandes cantidades de proteína (plasma y suero), es difícil sacar todo el líquido de la
punta. En estos casos, es mejor pipetear una vez la solución expeliéndola y luego
llevando hacia arriba el líquido a medir en un segundo tiempo. Para soluciones de alta
viscosidad el llenado y la expulsión deben ser más lentas.
Si es usada inadecuadamente, la micropipeta transferirá volúmenes inexactos.
La micropipeta puede perder su calibración. Comprobar la calibración de la pipeta es

un procedimiento simple que puede ahorrar tiempo considerable, energía, y reactivos.
4|
B. R. MESTAS
Recuerde que el volumen y color que tiene cada una de las micropipetas en su embolo,
este le dirá el tipo de punta que debe utilizar, así:
a. Micropipetas azules: rango de volumen 100-1000uL, tipo de punta azul
b. Micropipetas amarillas: rango de volumen 20-200uL, tipo de punta amarilla
c. Micropipetas amarillas: rango de volumen 10-100uL, tipo de punta amarilla
d. Micropipetas amarillas: rango de volumen 2-20uL, tipo de punta amarilla
e. Micropipetas gris: rango de volumen 1-10uL, tipo de punta transparente
f. Micropipetas gris: rango de volumen 0,1-2uL, tipo de punta transparente
5|
B. R. MESTAS
PRACTICA N° 2
EL DNA COMO MATERIAL GENÉTICO

Durante más de 50 años muchos investigadores estuvieron interesados en explicar
que sustancia era la encargada de transmitir la información genética. Esta sustancia debe
ser la responsable del pasaje de los rasgos de padres a hijos. Para que una sustancia
cumpla con esta función debe ser: a) lo suficiente estable para almacenar información por
largos periodos, b) Capaz de replicarse en forma precisa y c) capaz de cambiar para
permitir la evolución.
Los últimos 5 a 10 años marcan el inicio del conocimiento público de la biología

molecular. Sin embargo, el punto real de inicio ocurrió hace medio siglo cuando James D.
Watson y Francis Crick propusieron una estructura para la sal del ácido
desoxirribonucleico (DNA). La historia del descubrimiento del DNA –desde su aislamiento
como “nucleína” a partir de vendajes manchados, hasta la elucidación de la estructura de
doble hélice en 1953- es una historia interesante (Fig. 1).
6|
B. R. MESTAS
Figura 1. Tres líneas de investigación condujeron a descubrir que el DNA es el material

hereditario. Hitos selectos en el estudio de la herencia y la naturaleza de los genes, estructura y
función del cromosoma, y estructura del DNA desde 384 antes de Cristo hasta 1953.
A inicios de la década de los 1900s, se demostró que los cromosomas eran los
transportadores de la información hereditaria. Pero también se sabía que las células
eucariotas están compuestas de DNA y de proteína, y la mayoría de científicos
inicialmente consideraron que las proteínas eran el material genético.
Tres experimentos fueron vitales para el establecimiento del DNA como la molécula
responsable de contener la información genética:
• El principio transformante de Griffith
• Caracterización bioquímica del principio transformante de Griffith realizado por
Avery, McCarthy y Mac Leod
• Prueba definitiva de que el DNA contiene información genética realizada por
Hershey y Chase
7|
B. R. MESTAS
Por lo tanto, los estudiantes deberán revisar los artículos originales correspondientes a
estos tres experimentos, los cuales se encuentran libres en la linea:
1. FRED. GRIFFITH (1928). The significance of pneumococcal types. Journ. of Hyg.
VOLUME XXVII.
2. OSWALD T. AVERY, COLIN M. MACLEOD AND MACLYN McCARTY (1943). Studies
on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal
types. Induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from
pneumococcus type III. The journal of experimental medicine Vol. 79.
3. A. D. HERSHEY AND MARTHA CHASE (1952). Independent functions of viral protein
and nucleic acid in growth of bacteriophage. The Journal of General Physiology
CUESTIONARIO
1. ¿En qué consistió el experimento realizado por Griffith?
2. ¿A qué denominó Griffith “principio transformante”.?
3. ¿En qué consistió el experimento de Avery y colaboradores para caracterizar el
principio transformante de Griffith?
4. ¿A qué conclusión llegaron Avery y colaboradores después de realizar su
experimento?
5. ¿En qué consistió el experimento realizado por Hershey y Chase para demostrar que
el DNA es el material genético?
6. Mencione algunas razones por las que Hershey y Chase utilizaron un bacteriófago
para llevar a cabo su experimento.
7. ¿De qué manera Hershey y Chase comprobaron que las proteínas del fago T2 no
pasan a la progenie?
8. Después de haber analizado los artículos originales relacionados con los tres
experimentos más importantes en la dilucidación del material genético, ¿usted podría
concluir que el DNA es la única molécula que funciona como material genético en los
organismos vivos?. ¿Si o no?. Explique porque si o porqué no.
8|
B. R. MESTAS
PRACTICA N° 3
RECUENTO DE CELULAS
OBJETIVOS
 Determinar el número levaduras a través de conteo celular, haciendo uso de un
hemocitómetro de Neubauer.
INTRODUCCION
Los métodos de determinación de la masa o del número de células que hay en una
población, son fundamentales: (a) para cualquier estudio cuantitativo de la cinética de
crecimiento de poblaciones celulares, (b) para la estimación precisa de los cambios físicos
y químicos de las células y, (c) para la determinación de la cantidad de DNA en cada
célula. Existen varias técnicas para lograr esto. Entre las de mas fácil uso están las
estimaciones de la masa celular basadas en el peso fresco total (es decir, el peso
húmedo) o el peso seco de la muestra y la estimación del número de células a partir de la
medición de la turbidez relativa de una suspensión celular. Sin embargo, estos métodos
carecen de la precisión requerida para los estudios cuantitativos. Con mayor frecuencia, el
número preciso de células presentes en la muestra se determina mediante la observación
óptica directa de una alícuota de la suspensión celular obtenida del cultivo mediante
“conteo” utilizando la cámara Neubauer o por “citometría de flujo”. Aunque estos dos
últimos métodos son mucho mas precisos que lo métodos de determinación del peso o de
la turbidez, requieren que todas las células se encuentren separadas y por lo tanto, no
pueden aplicarse directamente a los tejidos.
En Biología Molecular, el recuento de células es muy importante pues permite

determinar el número de células de una muestra de trabajo. La técnica es un conteo
celular que se hace en el microscopio y es basada en la técnica en fresco. Para ello, se
utiliza la cámara Neubauer (hemocitómetro) (Figura 1).
Figura 1. Cámara de Neubauer
9|
B. R. MESTAS
El hemocitómetro es un portaobjetos especializado en el cual una retícula es

grabada con láser. Su construcción permite conocer el volumen de cualquier líquido
colocado sobre él y por debajo de su cubreobjetos. La retícula se encuentra compuesta
por nueve cuadros de 1 mm2 cada uno (cuadro azul en la figura inferior). Los cuatro
cuadros de 1 mm2 localizados en cada esquina poseen a su vez 16 cuadros de 0.0625
mm2. El cuadro central (también de 1 mm2) se encuentra compuesto por 25 cuadros de
0.04 mm2 (en verde). Estos cuadros a su vez se encuentran compuestos por cuadros
menores de tan solo 0.0025 mm2 (en negro). Dada la profundidad de la cámara de tan
solo 0.1 mm, cada una de estas unidades corresponde a volúmenes fijos conocidos,
según se ilustra en la figura 2.
Figura 2. Cuadrícula, dimensión y volumen de la cámara de Neubauer
MATERIAL Y REACTIVOS
 Suspensión de células de levadura
 Cámara de Neubauer
 Micropipetas
 Puntas para micropipeta
 Pipetas Pasteur
 Minicentrífuga
 Buffer fosfato de pH 7.4
 Hielo
PROCEDIMIENTO
1. En un tubo eppendorf, disolver 50 l de suspensión concentrada de células de
levadura (Saccharomyces cerevisiae) con 800 l de buffer fosfato. Mezclar,
pipeteando 5 veces.
2. Centrifugar por 5 minutos a 5,000 r.p.m.
3. Decantar el sobrenadante por inversión del tubo
4. Resuspender las levaduras en 100 l de buffer fosfato de pH 7.4
5. Mezclar la suspensión, a través de pipeteo suave (por 10 veces), para lograr una
completa separación de las células.
6. Coloque el objetivo 20x en el trayecto óptico del microscopio en campo iluminado.
7. Coloque 10 µl de la suspensión celular en cada cámara del hemocitómetro (Figura 3)
8. Coloque el hemocitómetro en el microscopio y localice la retícula grabada (Figura 4).
9. Deje que las células se asienten durante 1-2 minutos y proceda al conteo.
10 |
B. R. MESTAS
10. La cuenta celular para cada cuadrante externo (cuadros 4x4, figura 4A; uno de los
cuales es ampliado en la figura 4B). deberá oscilar entre 20-50 células, teniendo un
total de células para los cuatro cuadrantes 4x4 de 80-200 células. Las células
localizadas en los márgenes externos de cada esquina (marcados en rojo) NO
deberán ser incluidas en las cuentas.
11. Cuando existe una densidad celular mayor a 50 células por cuadrante 4x4, se
procederá al conteo el cuadrante central. Pueden contarse las células de todos los
cuadros secundarios, o si se prefiere, los 4 cuados secundarios de las esquinas y el
central.
CÁLCULO
Para calcular la concentración celular presente en la suspensión celular original
(aquella de la cual se tomó la alícuota cuando se han utilizado los cuatro cuadros de 4x4
(azules) del hemocitómetro:
Concentración = N° de célula contadas ÷ 4 × factor de dilución × 10,000
Para calcular la concentración celular presente en la suspensión celular original

(aquella de la cual se tomó la alícuota cuando se han utilizado el cuadro central de 5x5
(verde) del hemocitómetro (Nota: normalmente empleado cuando la cuenta total lograda
por el método anterior es superior a 200):
Concentración = N° de célula contadas ÷ 100 × factor de dilución × 10,000.
Para calcular el total de células presentes en la suspensión original de la cual se

tomó la alícuota:
Células totales = concentración celular × volumen total de muestra original
CUESTIONARIO
1. Calcule el número de células de levadura que hay en 10 ml de una suspensión, si en el
recuento encontramos 50 células por mm2.
11 |
B. R. MESTAS
2. En base a los resultados obtenidos en la práctica realice los cálculos para preparar 500
l de una suspensión que contenga 1000 células por ml.
3. Además de la cámara de Neubauer para el recuento de células, diga que otros
métodos se pueden utilizar para determinar el número de células de una muestra
problema.
4. Describa el procedimiento del método de la citometría de flujo para el conteo de
células.
BIBLIOGRAFÍA
Standard Operating Procedures (SOPs). Conteo celular y evaluación de viabilidad.
Laboratorio de Genómica Viral y Humana. Facultad de Medicina UASLP. 2013.
12 |
B. R. MESTAS
PRACTICA N° 4
VIABILIDAD CELULAR
INTRODUCCIÓN
La determinación de la viabilidad celular es importante en los ensayos de
citotoxicidad.
Los ensayos de citotoxicidad son técnicas de cultivo celular. La toxicidad en tejidos

y células se define como una alteración de las funciones celulares básicas por efectos
tóxicos de drogas y compuestos químicos. A través de estímulos las células pierden su
equilibrio homeostático, que puede causar su adaptación o sufrir un proceso regresivo o
morir (Figura 1). En los últimos años se están empezando a conocer los factores
determinantes de la toxicidad en tejidos y células.
Figura 1. Esquema de la supervivencia celular. La célula recibe estímulos nocivos que de ser
controlados se adapta, llevando a cabo diversos mecanismos metabólicos o tróficos que le pueden
permitir regresar a su condición basal en un proceso homeostático
La supervivencia celular es dependiente de la capacidad del organismo en sustituir

las células lesionadas o muertas o reparar los tejidos. A partir de un estímulo o lesión se
ejercen respuestas celulares, que son adaptación, degeneración o muerte celular. La
adaptación puede tener un carácter fisiológico si el estímulo agresor es moderado. Las
adaptaciones patológicas pueden tener mecanismos adaptativos propiciando que la célula
module su medio ambiente y se adapte, escapando de las agresiones siendo definido
como un cambio morfológico resultante de una lesión no mortal de la célula.
Entre las pruebas de citotoxicidad in vitro, se puede analizar el comportamiento de

las células en un ambiente controlado, siendo posible evaluar: la inhibición del crecimiento
celular; la permeabilidad de membrana, la replicación y la transcripción del ácido
13 |
B. R. MESTAS
ribonucleico, la síntesis de proteínas, hormonas y enzimas, el metabolismo energético, la

transformación celular, la mutagénesis y la carcinogénesis, entre otros.
La citotoxicidad puede ser definida como la capacidad que poseen ciertos

compuestos de producir una alteración de las funciones celulares básicas que conlleva a
un daño que puede ser detectado. Para la cuantificación de la citotoxicidad es necesaria
la implementación de diferentes tipos de ensayos que se encuentran descritos empleando
diversos métodos y estrategias para realizarlos. Entre los métodos para cuantificar la
citotoxicidad de un compuesto se cuenta con los que miden actividad metabólica celular
y por los que se basan en el principio de exclusión celular.
Ensayos que miden la actividad metabólica utilizan enzimas

Estos métodos para determinar la citotoxicidad de un compuesto incluyen: a)
contacto de células vivas en medio de cultivo y expuestas a cantidades conocidas de los
compuestos a ser analizados; b) incubación de las células en diferentes intervalos de
tiempos; c) un colorante que tenga un estado oxidado, un agente transferidor de
electrones, un sustrato para la enzima citoplasmática, un cofactor para la enzima
citoplasmática; d) la enzima citoplasmática liberada de las células muertas a través de la
cual se determina la citotoxicidad del compuesto a analizar.
Un buen ejemplo es la enzima lactato deshidrogenasa la cual es empleada en un

ensayo de citotoxicidad de amplio espectro. Esta enzima está presente normalmente en el
citoplasma de las células vivas y se libera en el medio de cultivo celular al permeabilizarse
la membrana de las células muertas o en vías de hacerlo, que se han visto afectadas por
un agente tóxico. Otro método que se basa en la reducción metabólica es a través del uso
del bromuro de 3-(4,5-dimetiltizol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT) realizada por la enzima
mitocondrial succinato-deshidrogenasa. Es un compuesto coloreado de color azul
conocido como formazán, permitiendo determinar la funcionalidad mitocondrial de las
células tratadas. Este método ha sido muy utilizado para medir supervivencia y
proliferación celular. La cantidad de células vivas es proporcional a la cantidad de
formazán producido útil en ensayos de proliferación y citotoxicidad de células eucariotas.
Ensayos basados en el principio de exclusión celular

Estos utilizan sustancias capaces de atravesar la membrana plasmática y teñir las
células. Durante el conteo celular se pueden distinguir las células vivas de aquellas que
no lo están, de manera que las células vivas presentan la capacidad de excluir el
colorante activamente de sus citoplasmas. Existen descritos en la literatura varios
reactivos como por ejemplo Rojo Neutro, Violeta de Genciana, Azul de Metileno y Azul de
Tripano. En el caso del rojo neutro es captado por las células, muy específicamente por
los lisosomas y endosomas, y en la medida que la célula pierda viabilidad por la acción
del compuesto que se analiza se libera al medio el colorante, solamente las células
viables son capaces de retener el colorante en su interior. Se mide seguidamente la
cantidad de rojo neutro que permanece dentro de la célula.
La exclusión del azul de tripán es la prueba más común para la viabilidad celular
pero puede ser inadecuada en la identificación de las células muertas. Las células deben
ser contadas dentro de 3 – 10 minutos debido a que el número de células teñidas de azul
incrementa con el tiempo después de la adición del colorante. El azul de tripán es
ampliamente usado para teñir células muertas. En este método, la viabilidad celular debe
ser determinada contando las células no teñidas con un microscopio u otros instrumentos.
14 |
B. R. MESTAS
Sin embargo, la tinción con azul de tripán no puede ser usada para distinguir entre las
células sanas y las células que están vivas pero que han perdido sus funciones celulares.
PARTE EXPERIMENTAL
EXPERIMENTO Nº 1. CONTEO DE CÉLULAS Y DETERMINACIÓN DE LA VIABILIDAD

MEDIANTE LA PRUEBA DE EXCLUSIÓN DEL AZUL DE
TRIPÁN
OBJETIVO
 Determinar la concentración de células (células/ml), el porcentaje de células vivas
y de células muertas, y el número total de células en una suspensión celular.
FUNDAMENTO
La prueba de exclusión del colorante se usa para determinar el número de células
viables presentes en una suspensión celular. Se basa en el principio de que las células
vivas poseen membranas celulares intactas que excluye ciertos colorantes, tales como
azul de tripán, Eosina, o bromuro de propidio, mientras que las células muertas no. En
esta práctica, simplemente se mezcla una suspensión celular con el colorante y luego se
examina visualmente para determinar si las células toman o excluyen el colorante. Según
este protocolo, una célula viable tendrá un citoplasma claro mientras que una célula no
viable tendrá un citoplasma azul.
El azul de tripán es un colorante vital. La reactividad del azul de tripán se basa en

el hecho de que el cromóforo está cargado negativamente y no interacciona con la célula
a menos que la membrana esté dañada. Por ello, todas las células que excluyen el
colorante son viables.
Debido a que el hemocitómetro tiene un volumen exacto por debajo del cubre-
objetos, se puede determinar la concentración (células/ ml) de células vivas y muertas en
la cámara. La concentración de la suspensión original de células será la misma que la de
la cámara –excepto si se realiza alguna dilución.
Las células muertas absorben el colorante, azul de tripán, y aparecen azules bajo
el microscopio. Las células vivas excluyen el azul de tripán, y aparecen incoloras. De este
modo, se puede calcular el porcentaje de células viables.
MATERIALES
Microscopio
Micropipeta de 1-20 µl
Hemocitómetro
Guantes quirúrgicos
Placas estériles de 96 pozos
Puntas para pipetas, 10-200 µl
Colorante azul de tripán al 0.4% en PBS
PROCEDIMIENTO
1. Prepare un hemocitómetro limpio con su cubre-objetos.
2. Anote el volumen de la suspensión celular en mililitros.
15 |
B. R. MESTAS
3. Mezcle la suspensión celular completamente con una pipeta serológica.

4. Transfiera 100 µl de la suspensión celular en el pozo de una placa de 96 pozos.
5. Añada 100 µl de azul de Tripán al 0.4% (w/v) a la muestra de células.
6. Mezcle, completamente, las células y la solución de azul de Tripán usando una
micropipeta, calibrada para 100 l, absorbiendo y eliminando el contenido por cinco
veces. Esta es una dilución de 1:2 de las células.
7. Transfiera 20 µl de la mezcla celular a una o a ambas cámaras del hemocitómetro
usando una micropipeta. Permita el llenado de la cámara por acción capilar. No llene
más ni menos de lo que requiere la cámara.
8. Usando el objetivo de 10X, enfoque sobre las rejillas de la cámara. Cuente las células
viables (no azules) y las células no viables (azules) en los cuatro cuadrados de las
esquinas de una cámara. Las células que caen sobre las líneas solo serán contadas
si están sobre la línea superior y sobre la línea de la mano izquierda de cada
cuadrado de las esquinas (Figura 2). Si el número de células en uno de los cuadrados
es mucho mayor de 50, tome una nueva muestra de 0.1 ml de la suspensión celular y
añada 0.9 ml de azul de tripán. Esta es una dilución de 1:10 de las células. Si el
número de células por cuadrado es muy bajo (menor de 5) entonces, la suspensión
original deberá ser re-suspendida en un volumen más pequeño.
Figura 2. Diagrama que indica los cuadrantes (A, B, C y D) de la cámara del hemocitómetro en
donde se debe contar las células. Diagrama que indica las células que deben ser contadas
9. Determine la densidad de células viables de la mezcla original de acuerdo a la

siguiente fórmula:
16 |
B. R. MESTAS
*Cuando se añade un volumen igual de azul de tripán, siempre se hace una dilución de 2.
Diluciones adicionales se realizan cuando el número de células en uno de los cuadrados es mucho
mayor de 50.
Ejemplo
Célula N° de células en cada cuadrado Total
Viable 28 30 26 29 113
No viable 1 3 2 0 6
Determinar:
28 x 2 x 10,000 = 560,000 = 5.6x105 cells/ml

↑
Dilución hecha en azul de tripán
Células totales = 5.6 x 105 cells/ml x 5 ml = 2.8 x106 cells/ml
Nota: células en total de los 5 ml cuando fueron contadas
EXPERIMENTO Nº 2. CONTEO DE CÉLULAS Y DETERMINACIÓN DE LA VIABILIDAD

MEDIANTE LA PRUEBA DE EXCLUSIÓN DEL AZUL DE
METILENO
OBJETIVO
 Determinar la presencia de células vivas y muertas en levaduras a través de
conteo celular, utilizando una técnica ligeramente modificada.
17 |
B. R. MESTAS
FUNDAMENTO
La viabilidad es el porcentaje de células vivas que existe en relación al total de
células. Su importancia radica en que nos brinda una idea de la eficiencia de la levadura
para fermentar. La técnica es un conteo celular que se hace en el microscopio y es
basada en la técnica en fresco. Como se utiliza azul de metileno, se trata de una técnica
ligeramente modificada, es decir, se emplea colorante. En la industria, se pesa la
levadura, los milímetros a utilizar y así se puede brindar un dato porcentual de las células
vivas. Allí, este ensayo es una técnica operativa porque emite resultados al instante. Se
determina el número TOTAL de células presentes (VIABLES Y NO VIABLES).
Ocasionalmente se pueden utilizar colorantes que indiquen diferentes estados
metabólicos de las células. Por ejemplo en un recuento en cámara de un cultivo de
levaduras con azul de metileno, se pueden distinguir las células VIABLES (no absorben el
colorante, se verán transparentes) de las NO VIABLES (absorben el colorante y se verán
azules).
MATERIALES
Microscopio
Hemocitómetro
Guantes quirúrgicos
Placas estériles de 96 pozos
Puntas para pipetas, 10-200 µl
Colorante azul de metileno (Disolver 0.01g de azul de metileno en 10 ml de agua
destilada estéril. Agregar 2g de citrato de sodio dihidratado y agitar hasta disolución.
Filtrar con papel filtro y llevar el volumen filtrado a 100 ml con agua destilada estéril).
PROCEDIMIENTO
1. Transfiera 100 µl de la suspensión celular en el pozo de una placa de 96 pozos.
2. Añada 100 µl de azul de metileno a la muestra de células.
3. Mezcle usando una micropipeta, calibrada para 100 l, absorbiendo y eliminando el
contenido por cinco veces. Esta es una dilución de 1:2 de las células.
4. Transfiera 20 µl de la mezcla celular a una o a ambas cámaras del hemocitómetro
usando una micropipeta. Permita el llenado de la cámara por acción capilar. No llene
más ni menos de lo que requiere la cámara.
5. Usando el objetivo de 10X, enfoque sobre las rejillas de la cámara. Cuente las células
viables (no absorben el colorante, se verán transparentes) y las células no viables
(absorben el colorante y se verán azules) en los cuatro cuadrados de las esquinas de
una cámara (para el recuento seguir el diagrama del experimento 1).
6. Determine el % de viabilidad, número de células/ml y recuento total de células (para
realizar los cálculos proceda igual que el experimento anterior).
CUESTIONARIO
1. Cuál es el fundamento de la prueba de exclusión del azul de tripán?.
2. Qué problemas presenta el análisis de viabilidad celular utilizando la prueba de
exclusión del azul de tripán?
3. Investigue que otros métodos se pueden utilizar para determinar viabilidad celular.
18 |
B. R. MESTAS
BIBLIOGRAFÍA
Standard Operating Procedures (SOPs). Conteo celular y evaluación de viabilidad.
Laboratorio de Genómica Viral y Humana. Facultad de Medicina UASLP. 2013.
19 |
B. R. MESTAS
PRACTICA N° 5
REPLICACIÓN DEL DNA

OBJETIVOS:
1. Identificar algunas características del proceso de replicación del DNA en
procariotas
2. Conocer algunas técnicas empleadas para la identificación de tamaño de
fragmentos de DNA
3. Analizar y explicar algunas peculiaridades del proceso de replicación del DNA
INTRODUCCIÓN
El modelo de la doble hélice del DNA descrito por Watson y Crick en 1953, sugirió
los posibles modelos acerca del proceso de su replicación. Por ello, entre 1956 y 1960
diversos laboratorios del mundo trabajaron para dilucidar dicho proceso. Así, en 1957 se
informó que el proceso de replicación es de tipo semi-conservativo y en 1958, se
descubrió la DNA polimerasa de E. coli.
En 1972, Okazaki realizó diversos experimentos que le permitieron sugerir que la

replicación se lleva a cabo en forma discontinua. Hoy se sabe que una de las hebras del
molde se replica en forma discontinua y la otra en forma continua; es decir la replicación
del DNA es semi-discontinua (Fig. 1).
Figura 1. Esquema para la operación de las enzimas en una de las horquillas durante la replicación
bidireccional de un cromosoma de E. coli o de un plásmido (oriC) que utiliza el origen único del
cromosoma de dicha bacteria. La replicación es continua para una hebra (hebra guía) y discontinua
para la otra (hebra rezagada).
20 |
B. R. MESTAS
Los experimentos que se relatan a continuación permitieron comprobar la

sugerencia de Okazaki y deducir que se requiere de un primer de RNA para que se inicie
la síntesis de los llamados fragmentos de Okazaki, o que en los primeros momentos de la
síntesis del DNA de E. coli, los fragmentos de Okazaki tenían una porción de DNA y otra
de RNA.
Se trabajó con células de E. coli. Debido a que los fragmentos de Okazaki se

producen en los primeros momentos del proceso de replicación, era preciso trabajar en
tiempos muy cortos, al inicio del proceso. Además, se tuvo que marcar radiactivamente
dichos fragmentos para facilitar su identificación, para lo cual se utilizó Timidina-3H.
Hoy se sabe en forma precisa que, en una célula bien nutrida de E. coli, el DNA se
sintetiza a una velocidad de 850 nucleótidos por segundo a 37°C, lo cual variar muy
ligeramente, según la raza bacteriana usada. El único cromosoma de E. coli tiene un
tamaño de 4000 kb, con una longitud de 1.4 mm, y es un DNA circular de doble hebra.
Además, se sabe que el proceso de replicación se inicia en un solo sito del cromosoma
(OriC) y que a partir de allí el DNA se sintetiza en ambos sentidos y que por lo tanto se
forman dos horquillas de replicación (bidireccional). A continuación, se indican (Tabla 1)
algunas características importantes del proceso de replicación en E. coli en comparación
con lo que ocurre en las células humanas.
Tabla 1. Parámetros cuantitativos del proceso de replicación del DNA en E. coli y en células
humanas.
Característica E. coli Cél. humanas
Número de pb del DNA por célula 3.9 x 106 Aprox. 109
Tasa de replicación de la horquilla (µm/min) 30 3
Tasa de replicación de la horquilla (nt/segundo) 850 60 – 90
Número de orígenes de replicación por célula 1 103 - 104
Horas requeridas para completar la replicación del genoma 0.67 8
Horas requeridas para una completa división celular 0.33 24
De acuerdo con las características indicadas, se requieren unos 40 minutos para

completar la replicación del cromosoma total de E.coli. Considerando esto, en un
experimento se decidió determinar el tamaño de los fragmentos de DNA obtenidos a los
30 segundos de incubación con timidina-3H y a los 5 minutos después de agregar dicha
sustancia marcada. Se trató de utilizar células bacterianas que estaban coordinadas en su
ciclo de división celular, de modo que estaban sincronizadas para que inicien su proceso
de replicación celular. Para analizar el tamaño de los fragmentos de DNA obtenidos se
empleó electroforesis de DNA en agarosa y la ubicación de dichos fragmentos en el gel se
detectó por auto-radiografía, pues al estar marcados radiactivamente dichos fragmentos
pueden impresionar una placa radiográfica y ocasionar bandas cuyo tamaño en kb puede
ser medido.
PROCEDIMIENTO
1. Un cultivo de células de E. coli que estaban sincronizadas en su división celular fueron
incubadas a 37°C con timidina-3H. A los 30 segundos y a los 5 minutos después del
agregado de timidina tritiada, se tomaron alícuotas de células para el aislamiento del
DNA.
21 |
B. R. MESTAS
2. El proceso de aislamiento del cromosoma bacteriano consiste en suspenderé las

células bacterianas en buffer que contiene sacarosa al 8%, tritón X-100 al 5%, Tris-HCl
50 mM de pH 8.0 y EDTA 50 mM. Se añade lisozima 10 mg/ml y se deja en reposo por
30 segundos. Se calienta por 45 segundos en baño maría hirviente, se enfría y se
centrifuga en minicentrífuga por 10 minutos. Se observa un precipitado que es el DNA
bacteriano. Con un palillo de dientes se lo recoge y resuspende en un buffer parecido
al indicado anteriormente, se agrega isopropanol y se deja 20 minutos a -70°C. Se
centrifuga en una minicentrífuga por 10 minutos y en el fondo del tubo tenemos el DNA
bacteriano más puro. Se decanta, y resuspende el DNA en Tris-HCl 0.01 M que
contiene NaOH 0.1M. La preparación está lista para su examen en una electroforesis
en gel de agarosa.
3. Para la electroforesis se usó un gel de agarosa al 0.9%, disuelta en buffer Tris-acetato :
EDTA y contenía además NaOH 0.1M. Como marcador de tamaño de los fragmentos
de DNA se usó el fago lambda tratado con la enzima de restricción Hind III. Dicho fago
tiene 48.6 kb, y cuando es cortado con la enzima Hind III se obtienen fragmentos de
23.6, 9.6, 6.5, 4.3, 2.2, 2.0 y 0.5 kb. En este caso, el fago lambda está marcado
radiactivamente y luego de ser cortado con la enzima también se le resuspende en una
solución que contenga NaOH 0.1 M.
RESULTADOS
A continuación se presentan los resultados obtenidos bajo las condiciones
señaladas. La figura muestra el esquema de una autoradiografía, después de la corrida
electroforética
Las muestras corridas en la electroforesis son las siguientes:
22 |
B. R. MESTAS
Carril 1: Patrón de fragmentos del fago lambda marcado radiactivamente y tratado con
Hind III.
Carril 2: DNA de E. coli extraído 30 segundos después de incubada con timidina-3H.
Carril 3: DNa de E. coli extraído 5 minutos después de incubada con timidina-3H.
Carril 4: DNA de E. coli extraído 30 segundos después de incubada con timidina-3H t
tratada con fosfodiesterasa de serpiente.
Carril 5: DNA de E. coli extraído 30 segundos después de incubada con timidina-3H y
tratada con fosfodiesterasa de bazo.
Carril 6: DNA de E. coli extraído 30 segundos después de incubada con timidina tritiada y
actinomicina D.
Carril 7: DNA de E. coli extraído 30 segundos después de incubada con uridina-3H en
lugar de timidina tritiada.
CUESTIONARIO
1. En papel semi-logarítmico realizar una gráfica, colocando en el eje Y los tamaños de
los fragmentos del patrón fago lambda tratado con Hind III y en el eje X la distancia
recorrida por cada fragmento.
2. Utilizando la gráfica, determine el tamaño (en kb) de los fragmentos de DNA que se
observan en los carriles 2 – 7.
3. Cuál es la razón de tratar el DNA obtenido en cada paso con NaOH 0.1M.
4. Qué le indica el resultado obtenido en el carril 2.
5. ¿Qué le indica el resultado obtenido en el carril 3? ¿Podría Ud. Sugerir cual
fragmento es el que corresponde a la cadena líder?
6. ¿Porque el tratamiento con la fosfodiesterasa del veneno de serpiente no afecta el
resultado obtenido?
7. ¿Por qué el tratamiento con fosfodiesterasa de bazo disminuye el tamaño del
fragmento más pequeño que se observa en el carril 5 y no el de los más grandes?
8. ¿Con la actinomicina D no se obtienen fragmentos de DNA ¿Qué le indica eso?
9. Uridina-3H, después de 30 segundos solo marca los fragmentos más pequeños, ¿por
qué? ¿Qué le indica el hecho de que tales fragmentos se marquen con uridina?
10. Considerando el tamaño del genoma de E. coli (1.4 mm) y la velocidad de replicación
en µm/minuto de la Tabla 1, ¿cuánto tiempo demora la replicación total del genoma
de E. coli? Haga el cálculo en minutos.
11. Considerando los datos de Tabla 1, la velocidad de replicación de la horquilla
(nucleótidos/segundo) y el número de pares de bases (pb) del genoma de E. coli.
¿Cuántos minutos demora la replicación del genoma de E. coli?
12. Si se usara un inhibidor de la DNA girasa, tal como el ácido nalidíxico, ¿Se obtendrá
marcación con timidina tritiada? ¿Por qué? Y ¿qué pasará con uridina tritiada?
PROBLEMAS
1. La secuencia de nucleótidos de una cadena de DNA de una doble hélice es 5’-
GGATTTTTGTCCACAATCA-3’. ¿Cuál es la secuencia de la cadena
complementaria?
2. El fragmento de DNA de la Figura 5.1 tiene una doble cadena en cada extremo, pero
una cadena sencilla en el centro. Se indica la polaridad de la cadena superior. ¿El
fosfato (PO4-) que se muestra en la cadena inferior está en el extremo 5’ o en el 3’
del fragmento al cual está unido?
23 |
B. R. MESTAS
Figura 5.1. Fragmento de DNA con un hueco de cadena sencilla en la cadena inferior
3. Mire cuidadosamente las estructuras de las moléculas que aparecen en la Figura 5-2.
A. ¿Qué esperaría que pasara si la dideoxicitidina trifosfato (ddCTP) se añadiera a
una reacción de replicación del DNA en exceso por encima de la concentración de
deoxicitidina trifosfato (dCTP)?¿Se incorporaría en el DNA? Si así fuera, ¿Qué
sucedería después? Razone la respuesta.
B. ¿Qué pasaría si se añadiera ddCTP a un 10% de la concentración de dCTP?.
C. ¿Qué efectos esperaría si se añadiera dideoxicitidina monofosfato (ddCMP) a la
reacción de replicación del DNA en exceso o a un 10% de la concentración de
dCTP?
Figura 5-2. Sustratos de replicación potenciales. (A) Dideoxicitidina trifosfato (ddCTP). (B)
Dideoxicitidina monofosfato (ddCMP).
4. ¿De qué forma esperaría que afectara la pérdida de la actividad exonucleasa

correctora de pruebas 3’ a 5’ de la DNA polimerasa a la fidelidad de la síntesis de
DNA en E. coli? ¿De qué forma afectaría su pérdida a la velocidad de síntesis del
DNA? Razone su respuesta.
5. Ha descubierto un nuevo organismo que crece en las profundidades oceánicas en un

ambiente hostil de corrientes hidrotermales. Al caracterizar su replicación, descubre
para su sorpresa que replica las dos cadenas de forma continuada utilizando dos
DNA polimerasas: una que sintetiza el DNA en el sentido 5’ a 3’ habitual y una
segunda que sintetiza el DNA en el sentido 3’ a 5’. Ambas polimerasas utilizan los
nucleótidos 5’-trifosfato estándar para añadir nucleótidos a las cadenas de DNA en
crecimiento. Está sorprendido en encontrar que ambas cadenas de DNA recién
sintetizadas estén hechas con el mismo grado elevado de fidelidad que caracteriza la
síntesis de DNA en E. coli.
A. Describa brevemente los cuatro procesos que contribuyen a la gran fidelidad de la
replicación del DNA en E. coli.
B. Explique porqué es sorprendente que ambas cadenas de este nuevo organismo se
replique con gran fidelidad.
C. Sugiera al menos dos vías por las que se puede conseguir esta gran fidelidad. Si
necesita inventar enzimas adicionales que realicen funciones específicas, describa
sus actividades.
24 |
B. R. MESTAS
6. Muchos orígenes de replicación de los embriones tempranos de Drosophila están

activos, de manera que se pueden observar varios en una sola electromicrografía,
como se muestra en la Figura 5-3.
Figura 5-3. Electromicrografía en la que se muestran cuatro burbujas de replicación en un

cromosoma de un embrión temprano de Drosophila.
a. Identifique las cuatro burbujas de replicación en la Figura 5-3. Indique las

localizaciones aproximadas de los orígenes en los que empezó cada burbuja y
numere las horquillas de replicación de la 1 a la 8 y de izquierda a derecha.
b. ¿Cuánto cree que tardaran las horquillas 4 y 5 en encontrarse?¿Y las horquillas 7 y
8? La distancia entre nucleótidos en el DNA es de 0.34 nm, y las horquillas de
replicación eucariotas se desplazan a una velocidad de unos 50 nucleótidos/segundo.
Para este ejercicio no tenga en cuenta los nucleosomas que son evidentes en la
Figura 5-3 y considere que el DNA está completamente extendido.
7. Suponiendo que no hay restricciones de tiempo en la replicación del genoma de una

célula humana, ¿Cuál sería el número mínimo de orígenes de replicación que se
necesitarían?. Si la replicación tuviera que llevarse a cabo en una fase S que durara 8
horas y las horquillas de replicación se desplazaran a una velocidad de 50
nucleótidos/segundo, ¿Cuál sería ahora el número mínimo de orígenes de replicación
necesarios para replicar el genoma humano? (Tener en cuenta que el genoma
humano consta de un total de 6.4 x 109 nucleótidos en 46 cromosomas.)
BIBLIOGRAFIA
1. Alberts B., Johnson A., Lewis J. Raff M., Roberts K., Walter P. (2002) Molecular
Biology of the Cell. Garland Science.
2. Brown T.A. (2008) Genomas. Ed. Panamericana
3. Devlin T.M. (2005). Biochemnistry
4. Lewin, B. (2008) Genes IX. Jones and Bartlet Publishers.
5. Nelson D.L. and Cox, M.M. (2009) Lehninger Principles of Biochemistry. Ed. Woth
Publishers
25 |
B. R. MESTAS
PRACTICA Nº 6
EXTRACCIÓN DE DNA
INTRODUCCIÓN
Uno de los procedimientos básicos en biología molecular es la purificación y
extracción de moléculas de ácidos nucleicos (DNA o RNA), como primer paso para
posteriores análisis.
Son varios los métodos utilizados para la extracción de DNA. En general, todos
tienen el mismo principio; es decir, empiezan con una forma de lisis celular seguido por
una remoción de proteínas y por último la obtención de DNA de alta pureza por
precipitación etanólica.
Las variaciones que presentan los diferentes métodos dependen del tipo de célula
con la que se trabaja. En muchos casos, la liberación de DNA puede ser fácil, cuando se
trabaja con virus y con algunas bacterias como Mycoplasma y E. coli; sin embargo, resulta
más complicada con ciertos organismos como el Mycobacterium tuberculosis, debido a
sus características particulares de la membrana celular.
PROTOCOLOS DE EXTRACCIÓN
COLECTA DE LA MUESTRA
La colecta de la muestra y su manejo adecuados son indispensables para una
extracción del ADN exitosa. En la tabla 1 se dan algunas recomendaciones importantes
sobre la colecta y el manejo de tejidos vegetales y animales.
Tabla 1. Recomendaciones sobre la colecta y manejo de algunos tejidos de plantas y

animales
COLECTA EN CAMPO/ ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA

ORGANISMO
TRANSPORTE DE LA MUESTRA PREVIO A LA EXTRACCIÓN
En el caso de tejido foliar, se
recomienda colectar tejido joven
pues contiene más células por
unidad de peso que el tejido viejo y Almacenar el tejido a -80 °C y evitar ciclos
posee menos polisacáridos y de congelación y descongelación antes de
polifenoles que dificultan la proceder con la extracción. Se recomienda
extracción. Una vez colectado, el congelar varios paquetes pequeños de la
tejido debe congelarse misma muestra con la cantidad de material
Plantas inmediatamente en nitrógeno que será
líquido para evitar la formación de procesada. Alternativamente, el tejido
cristales y que se sinteticen puede ser lioflizado y almacenado a
metabolitos secundarios después temperatura ambiente entre 15 y 25 °C,
de la abscisión. Si el tejido es aunque esta alternativa no es viable para
obtenido de invernaderos o cultivo suculentas.
in vitro, no es necesario congelar el
material, se puede hacer la
extracción directamente.
Tejido Las muestras deben almacenarse de
Animales Cortar el tejido en pedazos acuerdo al método de colecta utilizado, en
pequeños (aproximadamente 0.5 x etanol a 4 °C o si fue congelado con
26 |
B. R. MESTAS
0.5 cm o menores) para facilitar su nitrógeno líquido a -80 °C

maceración posterior. El tejido se
puede deshidratar con etanol al 70
% (aunque esta opción puede
degradar el ADN o acarrear
contaminantes) o bien, congelarse
con nitrógeno líquido. Para
transportar la muestra es
recomendable utilizar un buffer
especializado que inactive las
endonucleasas, por ejemplo, el
RNAlater (Ambion®). Otra opción
es homogenizar el tejido en buffer
de lisis que contenga sales de
guanidina o ß-mercaptoetanol que
inhiben DNasas y RNasas.
Sangre
Utilizar agujas de calibre apropia
Las muestras pueden mantener se por
do, respetar la relación muestra/
unos días a 4 ºC después de su colecta. Si
anticoagulante y homogeneizar
se congela la muestra a -20 °C, debe
correctamente la muestra para
descongelarse a temperatura ambiente y
evitar la hemólisis y/o coagulación,
procesarse en su totalidad pues una vez
y la contaminación bacteriana. Una
descongelada, inicia la hemólisis, por ello
vez obtenida la muestra es
es aconsejable hacer alícuotas.
importante evitar movimientos
bruscos durante el transporte.
HOMOGENIZACIÓN DEL TEJIDO

La homogenización, mecánica o química, consiste en romper las uniones entre las
células para facilitar la interacción con las soluciones de lisis que ayudan a liberar el
material genético
1. Homogeneización Mecánica
Nitrógeno líquido. Este procedimiento consiste en macerar la muestra con nitrógeno
líquido, en un mortero de porcelana, hasta obtener un polvo muy fino. El nitrógeno líquido,
congela de inmediato la muestra y evita que se formen cristales en el interior de la célula
que rompen la estructura celular e inicie el proceso de degradación. Este procedimiento,
se puede utilizar en tejido fresco o congelado, por ejemplo semillas, plántulas, tejidos
fibrosos o viscosos y hongos. Es importante considerar que, si la muestra ya está
congelada, se deberá disgregar con nitrógeno líquido para evitar la degradación del DNA
por acción de las DNasas.
Pistilos u homogeneizadores. Los pistilos disgregan la muestra mediante fricción con la

pared del tubo que contiene la muestra, adicionalmente se puede utilizar algún material
abrasivo como vidrio pulverizado o resinas. El proceso se realiza manualmente, con
pistilos plásticos o con ayuda de dispositivos electrónicos, conocidos como
homogenizadores. Es recomendable adicionar un poco del buffer de lisis antes de iniciar,
estas soluciones desnaturalizan a las proteínas y mantienen estable al DNA. Cuando se
utilizan dispositivos es necesario colocar el tubo sobre una cama de hielo, lo cual evita
que el DNA se fragmente por el calor que genera la fricción. El uso de pistilos u
homogenizadores se recomienda en general para muestras pequeñas y tejidos blandos,
aunque también se usa para tejidos no fibrosos como hojas jóvenes o flores. No es
recomendable utilizar este método con tejidos congelados, porque las células del interior
del tejido se descongelan antes de entrar en contacto con la solución de lisis y el DNA se
27 |
B. R. MESTAS
fragmenta por acción de las DNasas. En este caso se recomienda que el tejido se
disgregue en presencia de nitrógeno líquido. Alternativamente se pueden utilizar el buffers
comerciales como RNALater® ICE (Ambion®). La muestra se sumerge en el reactivo y se
mantiene a -20°C toda la noche, posteriormente se puede descongelar la muestra y
macerar sin requerir nitrógeno líquido
2. Homogeneización química
En la homogenización mediante agentes químicos, la muestra se mantiene en
solución a altas temperaturas en presencia de detergentes, proteasas y agentes
caotrópicos que rompen las uniones entre las células o que incluso pueden perforar la
membrana celular. La disgregación química es recomendable para bacterias, muestras
pequeñas de tejidos frescos o sangre. En tejidos fibrosos es recomendable cortar en
fragmentos pequeños para favorecer su disgregación. Antes de iniciar la
homogeneización es necesario contar con información sobre la cantidad apropiada de
tejido que debe utilizarse pues una disgregación rápida y completa es esencial para
asegurar la obtención de DNA y evitar su degradación. Si se excede la cantidad
recomendada se puede sobresaturar el sistema, con lo que se afecta el rendimiento y
aumentan las impurezas del extracto, de manera que es aconsejable realizar
experimentos preliminares con distintas cantidades de material inicial para determinar cuál
es la cantidad apropiada, en particular en los sistemas de extracción tradicionales. Por
ejemplo, en el caso de tejido vegetal, el material liofilizado contiene mayor cantidad de
células, por lo que se recomienda utilizar solo el 50% de peso fresco. Si el tejido contiene
una alta cantidad de polisacáridos o polifenoles, se inicia con el 25% del peso. Sin
embargo, si la especie tiene un genoma pequeño es posible incrementar la cantidad hasta
un 50%. En el caso de tejido animal, aunque el peso o la cantidad inicial sea la misma el
rendimiento puede variar significativamente entre tejidos. En la tabla 2 se muestra la
cantidad de tejido recomendada y el rendimiento esperado cuando la extracción se lleva a
cabo utilizando combos de extracción comercial.
Tabla 2. Tipo de tejido, cantidad de muestra y rendimiento esperado de ADN, usando combo
de extracción comercial
RENDIMIENTO DE DNA
MATERIAL CANTIDAD
(μg)
Células de E. coli 2 x 109 10-30
Células HeLa 5 x 106 20-40
Células 293F 5 x 106 15-30
Sangre de humano 200 ul 3-10
Cola de ratón 1 a 1.2 cm 5-25
Cerebro de ratón 25 mg 10-30
Hígado de ratón 25 mg 10-30
Baso de ratón 10 mg 10-40
Espinaca 100 mg 2.0 - 2.5
Arabidopsis thaliana 100 mg 1.8 - 3.1
Alfalfa 100 mg 2.1 - 3.0
Girasol 100 mg 1.6 - 4.0
Hongo 100 mg 1.1 - 1.4
Soya 100 mg 0.3 - 2.0
Trigo 100 mg 9.2 - 14.6
Maíz 100 mg 4.4 - 6.6
Jitomate 100 mg 1.0 - 2.3
28 |
B. R. MESTAS
LISIS CELULAR
Durante el proceso de lisis las interacciones entre las moléculas que conforman la
pared, la membrana celular y nuclear se modifican o destruyen permitiendo que los ácidos
nucleicos se liberen.
Entre los métodos de lisis celular más utilizados están:

a) Detergentes. Los detergentes aniónicos se utilizan básicamente para extraer DNA de
parásitos, células en cultivo y tejido, siendo el dodecil sulfato de amonio (SDS),
Nonidet-P40 (NP40) y sarkosil unos de los más usados para la ruptura de la membrana
celular.
b) Enzimas. Se utilizan especialmente para la extracción de DNA bacteriano total o
plasmídico, siendo la lisozima la enzima de elección. La lisozima actúa
desestabilizando la pared celular de bacterias Gram negativas, ya que rompe las
uniones glucosídicas entre los polisacáridos N-acetilglucosamina (NAG) y el ácido N-
acetilmurámico (NAM).
c) Agentes desnaturalizantes. Se utilizan para extraer DNA de diferentes tipos celulares
y tejidos, siendo el cloruro de guanidina uno de los más empleados.
ELIMINACIÓN DE PROTEINAS
Se lleva a cabo mediante el uso de enzimas proteolíticas tales como la proteinasa K.
Algunos protocolos de extracción realizan la lisis con detergentes como el SDS en
presencia de proteinasa K en un solo paso. Adicionalmente, la digestión se acompaña del
uso de la sal disódica del ácido etilén-diamino-tetra-acético (EDTA) para inhibir la acción
de las DNAasas.
Alternativamente, para organismos ricos en glicoproteínas como las micobacterias y

tripanosomas, entre otros, luego de la digestión se realiza un tratamiento con el
detergente catiónico bromuro de hexadecil-trimetil-amonio (CETAB) en presencia de NaCl
0.7 M, con la finalidad de eliminar las glicoproteínas y obtener un DNA más puro.
La desproteinización también se lleva a cabo con solventes orgánicos tales como el

fenol y el cloroformo, los cuales tienen la propiedad de desnaturalizar las proteínas. El
fenol debe ser bidestilado, equilibrado y protegido contra la oxidación mediante la adición
de 8-hidroxiquinolina. Por su parte, al cloroformo se le adiciona alcohol isoamílico en
proporción 24:1 volumen a volumen, con el fin de prevenir espuma y facilitar la separación
de las fases acuosas y orgánicas. Estos solventes se utilizan en una relación de 1:1 (v:v)
de la muestra que se pretende limpiar, quedando las proteínas desnaturalizadas en la
interfase y el DNA en la fase acuosa.
ELIMINACION DE RNA
Se realiza mediante la digestión de RNA con RNAasas como la ribonucleasa A de
páncreas bovino. Este paso en algunos protocolos se lleva a cabo después de la
extracción de DNA.
CONCENTRACION DEL DNA

Se logra mediante precipitación con etanol en presencia de cationes monovalentes
a concentraciones de 0.1 a 0.5 M. El etanol en la presencia de estos cationes induce un
cambio estructural en el DNA que causa la agregación y precipitación del mismo.
Adicionalmente, con este tratamiento se remueven los residuos de fenol y cloroformo del
29 |
B. R. MESTAS
paso anterior. Entre las sales más utilizadas se encuentran el acetato de sodio, acetato de
potasio, acetato de amonio y cloruro de litio.
30 |
B. R. MESTAS
EXTRACCIÓN DE DNA GENÓMICO DE Saccharomyces cerevisiae

OBJETIVO
 Familiarizar a los estudiantes con protocolos estándares de extracción de DNA
MATERIALES Y REACTIVOS
 Medio de cultivo YPD: Extracto de levadura 1% (p/v); peptona 2% (p/v); glucosa 2%
(p/v).
 Solución SZB (pH 5): Sorbitol 1M; citrato de sódio 100mM; EDTA 0.1 M; β-
glucoronidasa 50 unidades, 2-mercaptoetanol 100mM.
 Solución TE: Tris-HCl 50 mM, EDTA 20 mM (pH 7,4)
 SDS al 10%
 Acetato de potasio 5M (pH 4,8)
 Isopropanol
 Etanol al 70%
PROCEDIMIENTO
1. Los cultivos de las levaduras se dejan crecer durante 16 horas en agitación (120 rpm)
o hasta obtener más de 100 millones de células/ml a 28 ºC, en 5 ml de YPED.
2. Las células se colectan por centrifugación a 8000 rpm durante 5 min en un tubo de
microcentrífuga.
3. Las células se resuspenden en 0,5 ml de una solución de SZB. La suspensión se
incuba en baño maría a 37 ºC durante 60 min, agitando periódicamente. Centrifugar a
8000 rpm por 10 min.
4. Resuspender el precipitado en 0,5 ml de solución TE. Adicionar, 50µl de SDS al 10%
e incubar en baño María a 65 ºC por 30 min.
5. Adicionar 0,2 ml de acetato de potasio 5M (pH 4,8), mezclar (mínimo 30 seg.), y llevar
a baño de hielo por 30 min.
6. Centrifugar a 14000 rpm por 5 min y transferir el sobrenadante a un tubo limpio.
7. Centrifugar de nuevo por 5 min para eliminar impurezas y trasvasar el sobrenadante a
otro tubo.
8. Adicionar 0,2 ml de acetato de amonio 5 M y 1 ml de isopropanol (conservado a -20
ºC). Incubar a temperatura ambiente por 10 min agitando suavemente el tubo.
Centrifugar a 14000 rpm por 10 min, descartar el sobrenadante.
9. Al precipitado añadir 0,5 ml de etanol al 70% (conservado a -20 ºC), centrifugar a
14000 rpm por 5 min, descartar el sobrenadante. Dejar secar el precipitado a
temperatura ambiente.
10. Resuspender el DNA en 50 µl de TE. Incubar por 5 min en baño maría a 100º C, y
dejar enfriar a temperatura ambiente.
11. Almacenar a -20 ºC hasta su uso posterior.
BIBLIOGRAFIA
David, L.G. Dibner, M.D.& Battery, J.F. Bassin methods in molecular biology. Elsiever
Science Publishing Co. Ind. NY. 1986
Perbal, B. A practical guide to molecular cloning. 2nd edition John Wiley 6 Sons, 1988
Sambrook, J. et al. 1989 Molecular cloning: a Laboratory Manual, 2nd edition, Col Spring.
Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
31 |
B. R. MESTAS
Esteban Osorio-Cadavid, Mauricio Ramírez, William Andrés López, Luz Adriana

Mambuscay. Estandarización de un protocolo sencillo para la extracción de DNA
genómico de levaduras. Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XI. 2009.
32 |
B. R. MESTAS
EXTRACCIÓN DE DNA DE SANGRE
 Tubos vacutainer con anticoagulante EDTA, heparina o citrato para obtención de
 sangre total (5 ml por mesa)
 Tubos Falcón de 15 ml y Eppendorf estériles de 1.5 ml
 Micropipetas
 Puntas estériles
 Vortex
 Centrifuga con rotor para tubos de 15 m y Microcentrifuga para viales de 1.5 ml
 Guantes
 Buffer de lisis de glóbulos rojos (100 ml): 0.83 g de Cloruro de Amonio, 0.1 g de
Bicarbonato de Potasio, 0.2 ml de EDTA 0.5 M pH 8.0, 80 ml de agua destilada estéril.
Mezclar en un Erlenmeyer con magneto hasta homogenización completa. Completar a
100 ml con agua destilada estéril. Autoclavar. Almacenar a 4ºC.
 Buffer de lisis celular (100 ml): 5 ml de EDTA 0.5 M pH 8.0, 20 ml de SDS 10% 60 ml
de agua destilada estéril. Mezclar cuidadosamente (evitando la formación de espuma)
en un Erlenmeyer hasta homogenización completa. Completar a 100 ml en una probeta
con agua destilada estéril. No Autoclavar. Almacenar a temperatura ambiente
 Solución precipitante de proteínas (50 ml): 38,54 g de Acetato de Amonio, 10 ml de
agua destilada estéril. Mezclar en un Erlenmeyer usando magneto hasta completa
homogenización. Puede requerir calentamiento ligero. Completar a 50 ml con agua
destilada estéril. Autoclavar. Almacenar a 4ºC.
 Solución de rehidratación 10 ml: TE (Tris-HCL 10 mM EDTA 1mM). Preparar TRIS 1 M
pH 8.0 100ml (PM 121.1g), EDTA 0.5 M pH 8.0 100ml. A partir de estos hacer la
mezcla TE y diluciones correspondientes
PROCEDIMIENTO
1. En un tubo de 15 ml, medir 8 ml de Buffer de lisis de glóbulos rojos y sobre este
adicionar con una pipeta de Pasteur 2 ml de sangre total. Con la misma pipeta
mezclar muy bien y con mucha suavidad hasta lograr una completa homogenización.
2. Por inversión agitar muy suavemente durante 7 minutos a temperatura ambiente.
3. Centrifugar a 3000 R.P.M. durante 8 minutos. Descartar el sobrenadante y conservar
el precipitado.
4. Mezclar con una pipeta Pasteur muy suavemente el precipitado en el líquido residual.
5. Adicionar 2.5 ml de Buffer de lisis celular y mezclar varias veces, hasta homogenizar.
Dejar al menos 20 minutos a temperatura ambiente. (En este paso se puede
suspender el procedimiento, incluso hasta el día siguiente, dejando los tubos a 4ºC).
6. Adicionar 800 µl de solución precipitante de proteínas. Mezclar fuerte, hasta observar
grumos de las proteínas precipitadas. Centrifugar a 4000 R.P.M. durante 10 minutos.
7. Verter todo el sobrenadante sobre un tubo de 15 ml que contenga 2,4 ml de
isopropanol frío (alcohol isopropílico), dejar en reposo al menos unos 5 minutos.
Mezclar cuidadosamente por inversión hasta precipitar el DNA.
8. Envolver el DNA en una pipeta y pasarlo rápidamente por etanol al 70% frío, dejar
secar a temperatura ambiente y resuspender finalmente en buffer TE (Tris-HCL 10
mM EDTA 1mM) de 50-500 µl, dependiendo de la cantidad de ADN recuperado. Nota:
El ADN se puede recuperar tomándolo con pipeta Pasteur y centrifugando a 10.000
rpm por 5 min y lavar con 200 µl etanol al 70%
33 |
B. R. MESTAS
BIBLIOGRAFIA
David, L.G. Dibner, M.D.& Battery, J.F. Bassin methods in molecular biology. Elsiever
Science Publishing Co. Ind. NY. 1986
Perbal, B. A practical guide to molecular cloning. 2nd edition John Wiley 6 Sons, 1988
Sambrook, J. et al. 1989 Molecular cloning: a Laboratory Manual, 2nd edition, Col Spring.
Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
34 |
B. R. MESTAS
PRACTICA Nº 7
EXTRACCIÓN DE DNA VEGETAL

El DNA vegetal es más difícil de obtener de una forma que sea luego clonable o
digerible, que el proporcionado por células animales, debido principalmente a la presencia
de metabolitos secundarios y polisacáridos, los cuales interfieren con el procedimiento de
extracción y se co-purifican con el DNA. Algunos de estos problemas se pueden superar
usando hojas sin expandir.
Los tejidos de plantas son robustos y por ello requieren pre-tratamientos

intensivos, tales como largas incubaciones enzimáticas, molido en nitrógeno líquido con
polvo de albúmina seguida por extracción con el tampón CTAB, etc.
El método aquí descrito proporciona cantidades relativamente puras de DNA

genómico, que se puede usar como molde de amplificación con fines de figer printing
molecular (RAPDs, microsatélites u otras metodologías) (Griffin y Griffin, 1994).
1. Buffer de maceración: 10 ml de Tris-HCl 1 M pH 7.4, 2.5 ml de EDTA 0.5 M, 2.5 ml de
SDS al 10%, 2.5 ml de NaCl. Agregar agua bidestilada hasta completar 50 ml.
2. NaCl 5 M
3. Cloroformo
4. Alcohol isopropìlico
5. Etanol absoluto
6. Buffer TE (Tris-HCl 50 mM pH 8.0, EDTA 1mM).
PROCEDIMIENTO
1. Colocar hojas de quinua (0.15 g) con 400 l de buffer de maceración en un tubo de
microcentrífuga nuevo. Homogenizar hasta que se muestre de color verde intenso.
Centrifugar a 14,400 rpm por 1 minuto.
2. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Agregar un volumen de cloroformo y
mezclar por inversión. Dejar reposar por 5 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar
por 5 minutos en la microcentrífuga.
3. Trasvasar 300 l del sobrenadante y precipitar con 1 volumen de NaCl 5 M con uno de
los siguientes alcoholes: Alcohol isopropílico 1 volumen; etanol absoluto 2 volúmenes.
4. Dejar en reposo, a temperatura ambiente, por 5 minutos, luego sedimentar en la
microcentrífuga a velocidad máxima por 5 minutos.
5. Dejar secando a temperatura ambiente. Resuspender en 100 l de agua libre de
nucleasas, o en buffer TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM). El producto final es de 20
ng/ml de DNA aproximadamente.
6. Esquematice lo realizado
35 |
B. R. MESTAS
EXTRACCIÓN DE DNA VEGETAL
Método Collins et al. (1987)

 Agregar 400 µl del tampón de lisis (0,08 M NaCl, 0,16 M sucrosa, 0,06 M EDTA, 0,5%
SDS, 0,1 M Tris-HCl, pH 8,6) a la muestra. Homogenizar en un vial de 1,5ml.
 Incubar a 64°C durante 30 minutos.
 Transferir 56 µl de acetato de potasio 8 M para la precipitación de proteínas.
 Incubar durante 60 minutos a -20°C.
 Centrifugar a 3.500 rpm durante 15 min, el sobrenadante pasarlo a un tubo nuevo.
 Adicionar 100 µl de etanol al 100%.
 Centrifugar a 3.500 rpm durante 15 min.
 Descartar el sobrenadante.
 Al precipitado adicionar 100 µl de etanol al 75%, el producto final se seca y se
resuspende en 100 µl de agua ultrapura.
 El producto final se trata con un µl de RNAasa (Fermentas®) a 37°C durante 60 min.
Finalmente la muestra se almacena a -20°C.
BIBLIOGRAFÍA
1. Alberts, B Johnson, A. Lewis,J, Raff, M. Roberts, K and Walter, P (2002) Molecular
Biology of The Cell. G.S. Fourth Edition. Garland Science.
2. Adrien Gallou, Alba Priscilia Suaste Dzul, María Guadalupe Serna Domínguez, Gilda
Yadi Andrade Michel (2015) Manual de prácticas del Laboratorio de Biología
Molecular. Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria.
SENASICA.
36 |
B. R. MESTAS
PRÁCTICA N° 8
CUANTIFICACIÓN DE DNA
FUNDAMENTO
La concentración de DNA se puede estimar utilizando un espectrofotómetro de luz
ultravioleta (UV) a una longitud de onda de 260 nm, debido a que las base púricas y
pirimidínicas del DNA tienen la propiedad de absorber la luz UV a esta longitud de onda.
Es importante tener en cuenta que, dado el emparejamiento de sus bases (puentes de
hidrógeno), el DNA bicatenario absorbe menos que el monocatenario. La determinación
de la pureza del DNA se establece mediante la relación de las lecturas de las
absorbancias a 260 y 280 nm. Es así como una unidad (u) de densidad óptica (DO) a 260
nm equivale a 50 g/ml de DNA de doble cadena, a 40 g/ml de RNA y DNA de cadena
simple, y a 20 g/ml de oligonucleótidos. Las preparaciones puras de DNA y RNA tienen
una relación de DO 260/280 nm de 1.8 a 2.0. Valores inferiores a 1.8, se consideran como
DNA contaminado con proteína y fenol.
Además, también se puede estimar la concentración de DNA utilizando colorantes

como la difenilamina. Cuando se trata DNA con difenilamina en condiciones ácidas, se
forma un compuesto azul que tiene su máxima absorción a 595 nm. Esta reacción la dan
las desoxipentosas y no es específica para DNA. En solución ácida, la cadena lineal de
una desoxipentosa se convierte a la forma -hidroxilevulinoaldehido altamente reactiva y
que reacciona con difenilamina para dar un complejo azul. En el DNA solamente
reacciona la desoxirribosa del nucleótido de purina, así que el valor obtenido representa la
mitad del total de desoxirribosa presente.
PARTE EXPERIMENTAL
MATERIALES
1. Solución de DNA de las prácticas anteriores
2. Amortiguador salino (NaCl 0.15 mol/l; citrato de sodio 0.015 mol/l, pH 7).
3. Reactivo de difenilamina (disuelva 10 g de difenilamina pura en 1 litro de ácido acético
glacial y agregue 25 ml de ácido sulfúrico concentrado. Esta solución debe prepararse
en el momento de usar).
4. Baño de agua hirviendo
EXPERIMENTO 1. Cuantificación de DNA por el método espectrofotométrico

1. Diluir el DNA en agua destilada en un volumen final de 1 ml para el macrométodo y 100
l para el micrométodo. La cantidad de DNA tomada dependerá de la intensidad de la
banda observada en el gel de agarosa.
2. Utilizar agua destilada como blanco y realizar las mediciones a 260 y 280 nm,
utilizando celdas de cuarzo.
3. Determinar la concentración teniendo en cuenta la dilución del DNA. Por ejemplo, para
un DNA diluido 1/100 en un volumen final de 1 ml y una lectura de 0.050 a 260 nm, se
tiene que 0.050 (DO) x 50 g/ml x 100 (factor de dilución) = 250 g/ml = 0.25 g/l = 250
ng/l.
EXPERIMENTO 2. Cuantificación de DNA por el método colorimétrico
37 |
B. R. MESTAS
Tome 2 ml de solución de ácido nucleico (que contenga aproximadamente 10 mg

de ácido nucleico en 50 ml de amortiguador salino) y agregue 4 ml de reactivo de
difenilamina. Caliente en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos, enfríe y lea la
extinción a 595 nm. Use un blanco de agua destilada.
RESULTADOS
1. Anote sus resultados y determine la concentración de DNA para cada uno de los
métodos utilizados.
2. Esquematice lo realizado.
BIBLIOGRAFIA
Sambrook J, Fritsch EF, and Maniatis T. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual,
2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York.
Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K. Eds.
1995. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc., Chichester, NY,
Brisbane, Toronto, Singapore.
38 |
B. R. MESTAS
PRÁCTICA N° 9
ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS EN GELES DE

AGAROSA
OBJETIVO
 Separar e identificar diferentes fragmentos de ácidos nucleicos usando
electroforesis en geles de agarosa
INTRODUCCION
La concentración e integridad del DNA extraído, así como el tamaño de distintos
fragmentos de DNA (por ejemplo, productos de PCR) pueden ser verificadas mediante
electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida. La electroforesis consiste en la
separación de moléculas (proteínas, isoenzimas, ácidos nucleicos) a través de una matriz
tamponada (agarosa, acrilamida, almidón). La matriz funciona como un filtro, separando
las moléculas en un campo eléctrico, de acuerdo al tamaño y la carga neta que poseen.
En el caso de los ácidos nucleicos, el grupo fosfato es el responsable por la fuerte carga
negativa en condiciones de pH neutro, haciendo que los fragmentos migren hacia el polo
positivo (ánodo) durante la electroforesis.
La resolución y velocidad de separación de fragmentos de DNA por electroforesis

son reguladas a través de la concentración de agarosa (o acrilamida) en el gel y el voltaje
aplicado durante la electroforesis. La agarosa funciona como un filtro en el que los
fragmentos de menor tamaño migran más rápidamente hacia el ánodo que aquellos de
mayor tamaño. Al aumentar la concentración de agarosa se dificulta el movimiento de los
fragmentos a lo largo del gel, permitiendo obtener una mayor resolución en los fragmentos
de menor longitud. El incremento del voltaje aumenta proporcionalmente la velocidad de
migración de los fragmentos en el gel.
Los ácidos nucleídos separados en geles de agarosa pueden visualizarse

mediante tinción con colorantes fluorescentes, lo cual permite evaluar su integridad y
estimar su concentración mediante un análisis comparativo con patrones de
concentración conocida. Los colorantes fluorescentes actúan mediante inserción entre las
pares de bases que conforman el ácido nucleico. El bromuro de etidio es ampliamente
utilizado para la visualización de DNA y RNA. Sin embargo, éste es un reactivo altamente
tóxico, con propiedades mutagénicas, por lo que debe ser manejado con extremo cuidado
en el laboratorio. En la actualidad existen colorantes fluorescentes alternativos, como
SYBR Safe, SYBR Gold, SYBR Green I, Vista Green y Syto60, desarrollados
específicamente para reducir los riesgos potenciales de mutagénesis.
La técnica para la cuantificación de DNA consiste simplemente en la utilización de

una secuencia de concentraciones de solución patrón de DNA con la que se comparan
muestras de DNA de concentración desconocida. El cálculo de las concentraciones se
hace bajo la luz ultravioleta según la fluorescencia. Debe evitarse la exposición
prolongada a la luz ultravioleta, incluso con máscara de protección. La estimación de las
concentraciones de DNA puede realizarse sobre una fotografía digital del gel tomada bajo
luz ultravioleta si se cuenta con un analizador de imágenes.
39 |
B. R. MESTAS
La concentración de agarosa y el voltaje con los que se debe trabajar depende del
tamaño del segmento de DNA que se quiera visualizar. Los segmentos de gran tamaño, el
del DNA total (proveniente de una extracción de DNA), deben trabajarse con
concentraciones del 0.8% y a voltajes de 60V para evitar la fragmentación del mismo. Los
segmentos de 1,500 pb en adelante con geles al 1%, los segmentos de 500 pb a 1,500 pb
en geles 1,5% o 2% y los pequeños segmentos de de 100 pb a 500 pb (los microsatélites
por ejemplo) en geles al 4% o 6%. Para estos el voltaje puede variar de 20v a 120v de
pendiendo de la velocidad a la que quiera que migre el DNA, a voltajes elevados más
rápido corren las muestras.
La pureza de la agarosa y de la solución tampón (TAE o TBE) puede variar según

la finalidad del ensayo. Es posible reutilizar una solución de agarosa cuando el fin es
utilizarla sólo para visualización de algún producto de PCR. No se debe reutilizar cuando
se va a cuantificar DNA ni a extraer bandas a partir del gel. Para reutilizar la solución de
agarosa se recomienda guardar el gel en un envase con tapa, esto evita la evaporación y
la entrada de polvo. En caso dado de que se evapore algo de la solución se puede
completar el volumen con solución tampón limpia.
PARTE EXPERIMENTAL
1. Muestra obtenida en la Práctica 6 y 7.
2. Marcador de peso molecular.
3. Cámara de electroforesis y accesorios requeridos: soporte, peines, tabla niveladora,
burbuja niveladora, etc.
4. Solución amortiguadora de Tris-Boratos-EDTA (TBE). La solución se prepara 10X y
se utiliza 1X. Para preparar 500 ml de una solución 10X TBE mezclar: 54 g de Tris
Base (PM= 121.14 g/mol), 27.5 g de ácido bórico (H3BO3) (PM= 61.83 g/mol), 20 ml
de EDTA sódico (0.5 M, pH 8.0), llevar a 500 ml con agua destilada y autoclavar.
5. Gel de agarosa al 1% en TBE con bromuro de etidio. Precaución: el bromuro de
etidio es un agente mutagénico, utilice guantes para manipular cualquier material o
solución que contenga este químico.
6. Amortiguador de muestra con azul de bromofenol.
7. Tubos de 1.5 ml.
8. Beaker o erlenmeyer de 125 ml.
9. Micropipeta de 20 μl con sus respectivas puntas.
10. Lámpara de UV. Precaución: la luz ultravioleta puede dañar sus ojos. NUNCA
observe un gel bajo la luz ultravioleta sin el uso de anteojos que filtren dicha luz.
11. Guantes.
PROCEDIMIENTO
1. Ubicar la zona de electroforesis y tener cuidado con los materiales, evitar manipular
objetos ajenos al área.
2. Preparar Buffer TBE al 1X
Preparación del gel de agarosa al 1%

3. Pesar 400 mg de agarosa en polvo.
4. Montar los soportes y materiales adecuados para preparar el gel procurando nivelar
la superficie, verificar que no existan fugas y colocar los peines adecuados.
40 |
B. R. MESTAS
5. Depositar la agarosa en el matraz de 250 ml y agregar 40 ml del Buffer TBE 1X.

Calentar la agarosa en el horno de microondas por 1 min o hasta que se disuelva
perfectamente.
NOTA: Manejar con extremo cuidado el matraz y evitar respirar los vapores
del contenido.
6. Enfriar un poco sin que se solidifique la agarosa y agregar una gota de bromuro de
etidio* (manipular el reactivo lo menos posible y evitar derrames o mancharse).
Mezclar perfectamente hasta homogeneizar y verter el contenido en el molde.
7. Esperar a que solidifique (aproximadamente 20 min) y colocar el gel en la cámara de
electroforesis de tal forma que los pozos principales queden del lado correspondiente
al polo negativo (color negro). Llenar la cámara hasta la marca indicada con TBE 1X y
con precaución retirar los peines.
Preparación de las muestras

8. En un papel parafilm, colocar 3 µL del buffer de carga para 10 µL de muestra. Mezclar
la muestra con el buffer y vaciar en un pozo del gel (dejar libre el primer pozo para el
marcador de peso molecular) para cada una de las muestras.
9. Concluido el proceso, tapar la cámara de electroforesis haciendo coincidir los polos:
positivo con positivo y negativo con negativo. Conectar la cámara a la fuente de poder
y programar la corrida a 90 volts constantes durante 20-30 min.
Visualización de resultados
10. Sacar el gel de la cámara de electroforesis
11. Examine el gel bajo la lámpara de luz ultravioleta para determinar la posición de las
bandas en el gel.
12. Tomar la foto del gel.
BIBLIOGRAFÍA
1. BioRad. Manual de instrucciones de la cámara mini sub cell para electroforesis en
geles de agarosa.
2. Adrien Gallou, Alba Priscilia Suaste Dzul, María Guadalupe Serna Domínguez, Gilda
Yadi Andrade Michel (2015) Manual de prácticas del Laboratorio de Biología Molecular.
Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria. SENASICA.
41 |
B. R. MESTAS
PRÁCTICA N° 10
SINTESIS DE RNA
DEFINA LOS SIGUIENTES TÉRMINOS

a) Espliceosoma
b) Exón
c) Exosoma
d) Factor general de transcripción
e) Holoenzima de la RNA polimerasa
f) Intrón
g) Maduración del RNA por corte y empalme
h) RNA mensajero
i) Promotor
j) RNA polimerasa
k) RNA ribosómico
l) RNA nuclear pequeño
m) Transcripción
PROBLEMAS
1. Una RNA polimerasa está transcribiendo un segmento de DNA que contiene la
secuencia
5’-GTAACGGATG-3’
3’-CATTGCCTAC-5’
Si la polimerasa transcribe esta secuencia de izquierda a derecha, ¿cuál será la
secuencia del RNA? ¿Cuál sería la secuencia de RNA si la polimerasa se moviera de
derecha a izquierda?
2. ¿Cuáles son las funciones de los factores generales de transcripción en la

transcripción mediada por la RNA polimerasa, y porqué se denominan “generales”?
3. Los intrones con automaduración utilizan dos estrategias para llevar a cabo el corte y
empalme. Los intrones del grupo I unen un nucleótido de G del medio y lo activan
para atacar el enlace fosfodiéster que une el intrón al nucleótido terminal del exón
anterior (Fig. 1A). Los intrones del grupo II activan un nucleótido particularmente
reactivo de A dentro de la secuencia intrónica y lo utiliza para atacar el enlace
fosfodiéster que une el intrón con el nucleótido con el nucleótido terminal del exón
anterior (Fig. 1B). Para ambos tipos de intrones, el paso siguiente une los dos exones
y libera el extremo 3’del intrón. ¿Cuáles son las estructuras de los intrones escindidos
en cada caso? ¿Qué mecanismo se asemeja más a la maduración de los pre-mRNA
catalizada por el espliceosoma?
42 |
B. R. MESTAS
Figura 1. Paso inicial en la automaduración. (A) Reacción catalizada por un intrón autocatalítico
del grupo I. (B) reacción catalizada por un intrón autocatalítico del grupo II.
4. La purificación de un factor de transcripción de un ensayo rápido que impida que sea

inactivado antes de que la fracción que lo contiene sea identificada. Un avance
técnico clave fue el uso de un promotor unido a una secuencia de 400 nucleótidos de
DNA que carecía de nucleótido C. Cuando se omite el GTP en la mezcla de ensayo
(pero se incluye CTP, UTP, y ATP), el único transcrito largo de RNA se fabrica a partir
de esta secuencia de DNA, dado que todos los otros transcritos se terminan cuando
se requiere una G. Esta estrategia permite realizar un ensayo rápido de transcripción
específica simplemente midiendo la incorporación de un nucleótido radiactivo en el
transcrito largo.
Para probar esta idea, se construyeron dos plásmidos que llevan la secuencia
sintética: uno con un promotor de un adenovirus (pML1) y el otro sin promotor (pC1)
(Fig. 2A). Cada plásmido se mezcló con RNA polimerasa II pura, factores de
transcripción, UTP, ATP y 32P-CTP. Además, se añadieron varias combinaciones de
GTP (que termina la transcripción cuando se incorpora una G). Los productos se
midieron por electroforesis en gel mostrándose los resultados en la fig. 2B.
A. ¿Por qué está ausente el transcrito de 400 nucleótidos del carril 4 pero presente
en los carriles 2, 6 y 8?
B. ¿Puede adivinar la fuente de la síntesis en el carril 3 cuando se ha utilizado el
plásmido sin promotor pC1?
C. ¿Por qué hay un transcrito de 400 nucleótidos en el carril 5 pero no en el carril 7?
Figura 2. Caracterización de la transcripción utilizando un molde sin nucleótido C. (A) Estructuras de los
plásmidos del ensayo. (B) Resultados de los ensayos de transcripción bajo diferentes condiciones. Todas las
reacciones contienen RNA polimerasa II, factores de transcripción, UTP, ATP y 32P-CTP. Los otros
componentes se numeran encima de cada carril, C representa el plásmido pC1; ML representa el plásmido
pML1.
43 |
B. R. MESTAS
5. La subunidad mayor de la RNA polimerasa II de levaduras posee un CTD (dominio C-

terminal) que comprende 27 repeticiones casi perfectas de la secuencia YSPTSPS. Si
se reemplaza el gen normal de la RNA polimerasa II por uno que codifica un CTD con
sólo 11 repeticiones, las células son viables a 30C pero son incapaces de crecer a
12C. Esta sensibilidad al frío permite seleccionar los mutantes reversos haciéndolos
crecer a 12C. Se demostró que algunas de estas reversiones eran mutaciones
dominantes en genes previamente desconocidos como Srb2.
Los extractos obtenidos de levaduras que carecen del gen Srb2 no pueden
transcribir moldes de DNA añadidos al extracto, pero pueden activarse para la
transcripción al añadir la proteína Srb2. Para comprobar el papel de la proteína Srb2 en
la transcripción, se incubaron DNA plasmídicos con secuencias libres de G, cortas o
largas, localizadas a continuación del promotor (Fig. 3A) en presencia o ausencia de
una cantidad limitante de Srb2 recombinante [y sin añadir nucleótidos trifosfato (NTP)
de modo que no se podía comenzar la transcripción]. Las reacciones se mezclaron y la
transcripción se inicio a diferentes tiempos al añadir una mezcla de los cuatro NTP que
incluía 32P-CTP (Fig. 3B). Después de una breve incubación (de modo que la
transcripción no tuviese tiempo de reiniciarse), los productos se separaron por
electroforesis en gel. Fuera cual fuese el molde que se preincubaba con Srb2, ese era
el único molde que se transcribía (Fig.3C). Por el contrario, si se mezclaba un exceso
de Srb2 con un molde durante la preincubación, se observaba transcripción a partir de
ambos moldes una vez mezclados.
A. ¿Mostró Srb2 preferencia por alguno de los moldes cuando la preincubación se
llevaba a cabo con los moldes individuales o con la mezcla (Fig. 3C, carriles 1 a 3)?
B. ¿Indican los resultados que Srb2 actúa esquiométricamente o catalíticamente? ¿Por
qué?
C. ¿Forma parte Srb2 del complejo de preiniciación o actúa una vez se ha iniciado la
transcripción? ¿Cómo puede decirlo?
D. ¿Qué ocurre durante la preincubación que favorece tanto la transcripción a partir del
molde añadido durante la preincubación?
E. ¿Indican estos resultados que Srb2 se une al CTD de la RNA polimerasa II?
Figura. 3. Experimentos para

comprobar la función de Srb2
en la transcripción. (A) Moldes
libres de G cortos (C) y largos (L).
(B) Diseño experimental. (C)
Resultados experimentales. Los
transcritos a partir de los moldes
C y L se visualizaron mediante
autorradiografía.
44 |
B. R. MESTAS
6. La secuencia AAUAAA ubicada justo a 5’ del sitio de poliadenilación es una señal

crítica para la poliadenilación, como se ha verificado de muchas maneras. Una
confirmación elegante utilizó una modificación química para interferir con las
interacciones proteicas específicas. Las moléculas de RNA que contenían la
secuencia señal se marcaron radiactivamente en un extremo y luego se trataron con
dietilpirocarbonato, que puede modificar los nucleótidos A y G haciendo que el RNA
sea sensible a la rotura mediante un tratamiento con anilinas. Las condiciones
experimentales empleadas fueron tales que las moléculas de RNA contenían
aproximadamente una modificación cada una. En ese momento se trataron con
anilina. Las series de fragmentos resultantes tienen longitudes que corresponden a
posiciones de A o G en el RNA (Fig. 2, carril 1).
Para definir los nucleótidos A y G críticos, los RNA modificados, pero aún
intactos, se incubaron con un extremo capaz de cortar y poliadenilar. Los RNA fueron
luego divididos entre aquellos que habían adquirido la cola de poli-A (poli-A+) y
aquellos que no (poli-A-). Estas dos fracciones fueron tratadas con anilina y los
fragmentos, analizados por electroforesis en gel (Fig. 4, carriles 2 y 3). En una
segunda reacción se añadió EDTA al extracto junto con los RNA modificados; esto no
afecta a la escisión del RNA pero impide la adición de la cola de poli-A. Estos RNA
escindidos fueron aislados, tratados con anilina y examinados por electroforesis
(carril4).
A. ¿En qué extremo se marcan las moléculas de RNA?
B. Explica por qué las bandas correspondientes a la señal AAUAAA (corchete en Fig.4)
se pierde en el RNA poli-A+ y en el RNA escindido.
C. Explique por qué la banda de la flecha (el nucleótido normal donde se añade la cola
de poli-A) falta en el RNA poli-A+ pero está presente en RNA escindido.
D. ¿Qué nucleótidos A y G son importantes para la escisión, y qué nucleótidos A y G
son importantes para la adición de la cola de poli-A?
E. ¿Qué información adicional podría obtenerse marcando las moléculas de RNA en el
otro extremo?
Figura 4. Análisis autorradiográfico de los experimentos para definir las purinas importantes
en la escisión y poliadenilación del RNA. La secuencia del RNA precursor se muestra a la
izquierda con el extremo 5’ abajo y el extremo 3’ arriba. Todos los RNA fueron modificados
mediante reacción con el dietilpirocarbonato. El RNA no tratado con el extracto (no tratado) se
muestra en el carril 1. El RNA tratado con el extracto pero sin poliadenilar (poli-A-) se muestra en el
carril 2. El RNA poliadenilado (poli-A+) en el extracto se muestar en el carril 3. El RNA que fue
escindido pero no poliadenilado (escindido) se muestra en el carril 4. Los fragmentos más cortos
de RNA corren más rápido; es decir, migran hacia la parte inferior del gel durante la electroforesis.
45 |
B. R. MESTAS
PRACTICA N° 11
SINTESIS DE PROTEINAS

a) Traducción
b) Aminoacil-tRNA sintetasa
c) Anticodón
d) Código genético
e) Codón
f) Factor de iniciación eucariota (eIF)
g) Pauta de lectura (marco de lectura)
h) Proteosoma
i) Ribosoma
j) Ribozima
k) RNA ribosómico
l) RNA de transferencia
m) RNA de transferencia iniciador
PROBLEMAS
1. Para la siguiente secuencia de RNA, indique los aminoácidos codificados en las tres
pautas de lectura. Si le dijesen que este segmento de RNA estaba en medio de un
mRNA que codificaba una proteína grande, ¿cómo sabría cuál es la pauta de lectura
utilizada? ¿Por qué?
AGUCUAGGCACUGA
2. Una mutación de un gen bacteriano genera un codón de paro UGA en medio del
mRNA que codifica para una determinada proteína. Una segunda mutación en la célula
lleva a un cambio de un solo nucleótido en un tRNA que permite la traducción correcta
de la proteína; es decir, la segunda mutación “suprime” el defecto causado por la
primera. El tRNA alterado traduce el codón UGA como triptófano. ¿Qué cambio de
nucleótido ha ocurrido probablemente en la molécula de tRNA mutante? ¿Qué
consecuencias tendría la presencia de este tRNA mutante en la traducción de los
genes normales de esta célula?
3. El factor de elongación EF-Tu introduce dos cortas demoras entre el apareamiento

entre el apareamiento de bases codón-anticodón y la formación del enlace peptídico.
Estas demoras aumentan la precisión de la síntesis proteica. Describa estas demoras y
explique de qué manera mejoran la fidelidad de la traducción.
4. El peso molecular promedio de las proteínas codificadas por el genoma humano es de

aproximadamente 50,000 daltons. Algunas proteínas son mucho mayores que este
promedio. Por ejemplo, la proteína llamada titina, fabricada en las células musculares,
tiene un peso molecular de 3’000,000 daltons.
A. Calcule cuánto tiempo tardará una célula muscular en traducir el mRNA de una
proteína promedio y el mRNA de la titina. El peso molecular promedio de un
aminoácido es de unos 110 daltons. Considere que la velocidad de traducción es de
dos aminoácidos por segundo.
B. Si los nucleótidos de la región codificante de un mRNA constituyen el 5% del total
de los que son transcritos, ¿cuánto tardará una célula muscular en transcribir el gen
46 |
B. R. MESTAS
de una proteína promedio comparado con el gen de la titina? Suponer que la

velocidad de transcripción es de 20 nucleótidos por segundo.
5. Muchos de los errores de la síntesis proteica ocurren porque las tRNA sintetasas
tienen dificultades para discriminar entre aminoácidos parecidos. Por ejemplo, la
isoleucil-tRNA sintetasa (IleRS) normalmente activa isoleucina.
IleRS + Ile + ATP  IleRs(Ile-AMP) + PPi
Con una frecuencia de 1 cada 180 activaciones correctas, la IleRS activa

erróneamente una valina
IleRS + Val + ATP  IleRs(Val-AMP) + PPi
La síntesis de proteínas es más precisa de lo que esta frecuencia sugiere, ya que

la sintetasa es capaz de editar la mayoría de sus errores, en una reacción que requiere
la presencia del tRNAIle.
IleRs(Val-AMP) + tRNAIle  IleRs + Val + AMP + tRNAIle EDICION
El tRNAIle, por supuesto, también es necesario para la correcta aminoacilación

(carga) de la isoleucina para dar el Ile-tRNAIle.
IleRs(Ile-AMP) + tRNAIle  Ile-tRNAIle + IleRs + AMP + CARGA
¿Se requieren las mismas regiones del tRNAIle para la carga de la isoleucina que
para la edición de la valina? Una aproximación a esta pregunta consiste en introducir
cambios en el tRNAIle para determinar si las dos actividades se ven afectadas de la
misma forma. En lugar de cambiar la secuencia nucleótido a nucleótido, se hicieron
cambios de bloques de secuencia, utilizando como donante el tRNAVal. El tRNAVal por
sí mismo no estimula la carga de isoleucina ni la edición de la valina por parte de la
IleRS. Sin embargo, el cambio de su anticodón de 5’-CAU a 5’-GAU le permite ser
cargado bastante eficientemente por la IleRS. Se construyeron diversos tRNA
quiméricos mediante la combinación de partes del tRNAIle y del tRNAVal. Se analizó la
capacidad de cada quimera de estimular la carga de isoleucina y la edición de valina,
como se muestra en la Fig.1.
A. ¿Qué mínimo debe ser insertado en el tRNAVal para permitir la carga de la
isoleucina por parte de la IleRS?
B. ¿Qué mínimo debe ser insertado en el tRNAVal para permitir la edición de la valina
por parte de la IleRS?
C. ¿Reconoce la IleRS las mismas características del tRNAIle cuando cataliza la carga
de la isoleucina que cuando procesa la edición de la valina? Explique su
respuesta.
47 |
B. R. MESTAS
Figura 1. Regiones del tRNAIle responsables de la carga y la edición. (A) tRNAIle y tRNAVal. (B) Carga de
la isoleucina y edición de la valina. Bajo los resultados de carga de la isoleucina (barras negras) y de edición
de la valina (barras grises) se muestran los tRNA quiméricos compuestos de fracciones del tRNA Val (negro) y
tRNAIle (gris).
6. Ha aislado un antibiótico, llamado edeína, de un cultivo bacteriano. La edeína inhibe la

síntesis proteica, pero no tienen ningún efecto sobre la síntesis del DNA ni del RNA.
Cuando se añade a un lisado de reticulocitos, la edeína detiene la síntesis proteica
después de un largo periodo de latencia (Fig. 2). Por el contrario, la cicloheximida
detiene la síntesis proteica inmediatamente. El análisis del lisado inhibido por edeína
mediante una centrifugación en gradiente de densidad demostró que no quedaba
ningún polirribosoma en el momento en el que se había detenido la síntesis proteica.
En su lugar, todo el mRNA de la globina se acumulaba en un pico anormal de 40S, que
contenía cantidades equimolares de la subunidad menor del ribosoma y del tRNA
iniciador.
A. ¿Qué paso de la síntesis proteica inhibe la edeína?
B. ¿Por qué hay un periodo de latencia entre la adición de la edeína y el cese de la
síntesis proteica? ¿Qué determina la extensión de este periodo de latencia?
C. ¿Esperaría que los polirribosomas desaparecieran si añade cicloheximida a la vez
que la edeína?
7.
Figura 2 Efecto de los inhibidores edeína y cicloheximida sobre la síntesis de proteínas en
lisados de reticulocitos.
48 |
B. R. MESTAS
PRÁCTICA N°12
CONTROL DE LA EXPRESION GENICA

a) Control traduccional
b) Control transcripcional
c) Proteína represora de genes
d) Operón
e) Operador
f) Proteína represora de genes
g) Represor triptófano
h) Región del control del gen
i) Impronta genómica
j) Metilación del DNA
k) RNA de interferencia
PROBLEMAS
1. En principio, una célula eucariota puede regular la expresión génica en cualquier etapa
de la vía que lleva del DNA a la proteína activa (Fig. 7-2)
A. Sitúa los puntos de control enumerados a continuación en los sitios adecuados del
esquema de la Fig. 7-2.
1. Control de la degradación del mRNA
2. Control de la actividad proteica
3. Control del procesamiento del mRNA
4. Control del transporte y localización del mRNA
5. Control transcripcional
6. Control traduccional
B. ¿Qué tipos de control de la lista anterior es poco probable que se utilicen en
bacterias?
2. Defina control negativo y control positivo en términos de cómo funcionan las formas
activas de las proteínas reguladoras de genes. Explique de qué forma un ligando
“inductor” activa un gen que está controlado negativamente. ¿De qué forma activa un
ligando inductor a un gen que está controlado positivamente? Explique como un
ligando “inhibidor” inactiva un gen que está controlado negativamente y de qué forma
inactiva un gen está controlado positivamente.
3. Las células bacterianas pueden adquirir el aminoácido triptófano de su entorno o, si el

aporte externo es insuficiente, pueden sintetizar triptófano a partir de pequeñas
moléculas de la célula. El represor del triptófano inhibe la transcripción de los genes del
operador de triptófano, el cual codifica las enzimas de la biosíntesis del triptófano.
Cuando se ha unido al triptófano, el represor del triptófano se une a un sitio específico
del promotor en el operón.
A. ¿Por qué la unión al operón dependiente de triptófano es una propiedad útil para el
represor del triptófano?
B. ¿Qué pasará con la regulación de las enzimas de la biosíntesis del triptófano en las
células que expresan una forma mutante del represor del triptófano que (i) no puede
unirse al DNA o que (ii) se une al DNA incluso cuando no hay triptófano unido?
C. ¿Qué pasaría en las situaciones (i) y (ii) si la célula produjera la forma de represor
del triptófano normal a partir de una segunda copia del gen no mutada?
49 |
B. R. MESTAS
4. Se ha descubierto varios mecanismos distintos para la localización del mRNA. Todos

requieren señales específicas del propio mRNA, por lo general en su región no
traducida 3’ (UTR). Resuma brevemente tres mecanismos mediante los cuales los
mRNA celulares podrían situarse en su localización dentro de la célula.
5. En nematodos, la elección entre espermatogénesis y oogénesis en la línea germinal

hermafrodita depende de la regulación traduccional de los genes Tra2 y Fem3, como
muestra la Fig. 7-52. Cuando se expresan, Tra2 induce a oogénesis y Fem3 induce la
espermatogénesis. La traducción del mRNA de cada gen se regula mediante la unión
de proteínas a elementos presentes en sus regiones 3’ no traducidas. En cada caso, el
mRNA unido a proteína, aunque es estable, no se traduce de manera eficiente y tiene
una cola de poli-A corta. En cada caso, el mRNA en su forma no unida es activo
traduccionalmente y tiene una cola de poli-A larga. ¿Cómo cree que afectan las
longitudes de las colas de poli-A a la eficiencia de la traducción de estos mRNA?
50 |
B. R. MESTAS
PRÁCTICA 13
ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO DE SECUENCIAS
El primer paso para secuenciar el DNA involucra extraerlo de las células que lo
contienen. Hay muchos métodos que pueden usarse para extraer DNA (convencionales o
comerciales). Después de que el DNA ha sido aislado, el segundo paso es amplificar por
PCR los fragmentos de DNA (ej. genes) deseados. El siguiente paso antes de secuenciar,
es la purificación de los fragmentos de DNA. Este paso es muy importante para propósitos
de validación de la secuencia.
Los fragmentos de DNA obtenidos son enviados a secuenciar en una plataforma

de genómica. Existen en todo el mundo, laboratorios o empresas comerciales dedicados
al servicio de secuenciación automática que permiten reducir los costos de este proceso
cuando se hace a pequeña escala (ej. equipos y reactivos especializados costosos).
Además, estas plataformas tienen una alta experiencia en las diferentes técnicas, lo que
les permite ofrecer un soporte de garantía para encontrar una solución a cualquier
dificultad. El único punto crítico para la confiabilidad de los resultados es la calidad del
DNA o fragmento de DNA a enviar. Por eso es muy importante seguir los requisitos en
materia de calidad y cantidad de las muestras.
Las muestras de DNA son secuenciadas con la técnica de Sanger (Sanger et al.,
1977). Esta técnica se basa en la habilidad que tienen las polimerasas de introducir tanto
deoxinucleótidos como dideoxinucléotidos a una cadena de DNA en crecimiento.
Utilizando la técnica en sistemas automatizados de tecnología capilar y de

fluorescencia, se puede detectar de manera diferencial cada uno de los
dideoxinucleótidos que se adicionan al final de un fragmento en la polimerización, los
cuales son separados de otros fragmentos de diferente tamaño, por medio de una
electroforesis capilar y a través de un software, se descifra la secuencia de un fragmento
de DNA. Existen otras técnicas de secuenciación como la técnica de pirosecuenciación
que se basa en la detección de la señal luminosa generada por una reacción
quimioluminiscente, en la cual se utiliza como sustrato el pirofosfato que se libera como
resultado de la incorporación de un nucleótido a la cadena de DNA naciente (Shendure et
al., 2004). La técnica más reciente es la secuenciación con chip semiconductor (Ion
Torrent Semiconductor Sequencing; Perkel, 2011). Este método es basado en la
capacidad de detectar un ion de hidrógeno [H+], proveniente de la polimerización de la
cadena complementaria a un DNA patrón, los dNTP´s son incorporados durante un ciclo
de secuenciación, permitiendo la formación del enlace fosfodiéster y una posterior
liberación de PPi e H+. Esta polimerización se lleva a cabo en conjunto de pocillos,
colocados sobre un sensor de efecto de campo sensible a iones, utilizados en las
mediciones de pH en soluciones, por lo que cuando cambia la concentración de iones,
cambia por consecuencia la corriente del transmisor y genera una señal eléctrica
detectada en el chip. A diferencia de otras técnicas de secuenciación, ésta no utiliza un
sistema óptico de detección.
Después del proceso de secuenciación, la plataforma de genómica envía los

resultados en archivos electrónicos que contienen el electroferograma y toda la
información del análisis. La última etapa para la identificación molecular es el análisis de
51 |
B. R. MESTAS
secuencia de DNA con métodos bioinformáticos. El análisis de la secuencia de DNA, es el

descubrimiento de similitudes funcionales y estructurales, y las diferencias entre múltiples
secuencias biológicas. Esto puede hacerse comparando las nuevas (desconocidas) con
las bien estudiadas y registradas (conocidas) secuencias. Este análisis incluye la
búsqueda en la base de datos de secuencias, la alineación de secuencias, el
descubrimiento de patrones, la reconstrucción de las relaciones evolutivas, la formación y
la comparación del genoma. Los científicos han encontrado que dos secuencias similares
poseen el mismo papel funcional. La comparación se puede hacer desde aspectos de
comportamiento bioquímico o de acuerdo a la estructura de la proteína. Si dos secuencias
de diferentes organismos son similares, se dice que son secuencias homólogas.
Para el análisis de secuencias, se utiliza el siguiente protocolo:

Corrección y ensamble de las secuencias de DNA
El primer paso del análisis es la corrección manual de las secuencias y
posteriormente el ensamble de las secuencias de un mismo fragmento en contig (ej.
superposición de las secuencias sentido, anti sentido e internas). Este paso se puede
efectuar con el programa libre “BioEdit”, que se puede descargar en la página:
http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html.
Búsqueda de secuencias registradas

El segundo paso es comparar la secuencia nucleotídica obtenida con otras
secuencias depositadas en bancos públicos (ej. GenBank®) de genes. Una vez hecha la
comparación, se importan las secuencias registradas con mayor similitud o adecuadas
para hacer el análisis bioinformático. Este paso es crucial para tener una buena
identificación de los organismos bajo estudio y establecer las correctas relaciones de
filogenia o evolutivas.
Alineación de secuencias de DNA

En este paso, se comparan las secuencias mediante la búsqueda de patrones de
caracteres comunes y el establecimiento de los residuos de correspondencia entre las
secuencias relacionadas. El alineamiento de pares de secuencias es fundamental en la
búsqueda de similitudes dentro de la base de datos y el alineamiento de secuencias
múltiples. Un concepto importante en el análisis de la secuencia es la homología de
secuencia. Cuando dos secuencias son descendientes de un origen evolutivo común, se
dice que tienen una relación homóloga u homología. Un término relacionado, pero
diferente es la similitud de secuencias (estos términos suelen utilizarse indistintamente de
manera errónea). Este paso se efectúa con el programa libre MEGA 5 (Molecular
Evolutionary Genetics Analysis, http://www.megasoftware.net/index.php)
Análisis flogenético
La finalidad de los análisis filogenéticos es estimar una relación de parentesco
(árbol filogenético) que muestre la historia evolutiva del grupo taxonómico de estudio. Es
decir, el objetivo final es obtener un árbol filogenético que sea reflejo del proceso evolutivo
donde las entidades biológicas son el resultado de la descendencia con modificación
entre especies ancestrales y descendientes. Existen diferentes métodos utilizados en
estudios de sistemática filogenética [Máxima Parsimonia (MP), Máxima Verosimilitud (MV)
e Inferencia Bayesiana (IB), entre otros] que deben ser propiamente seleccionados en
dependencia de los objetivos de las diferentes investigaciones. Estos análisis son
realizados con el programa MEGA 5, por ejemplo, el algoritmo Neighbor-Joining (NJ) es
utilizado para la identificar las secuencias que tengan la menor distancia genética.
52 |
B. R. MESTAS
Mientras, el modelo MV es utilizado para establecer la historia evolutiva de un grupo

taxonómico estudiado, ya que es un método estadístico basado en modelos de evolución
molecular, donde se toma en cuenta conocimiento a priori acerca de los caracteres,
especialmente cuando son caracteres moleculares (secuencias de nucleótidos de DNA).
La bioinformática, al igual que todas las ciencias que son base en la investigación
científica, provee grandes volúmenes de información que requiere de técnicas
computacionales avanzadas para permitir hacer un procesamiento en tiempo real.
Muchas de estas técnicas se enmarcan dentro de temas de investigación y desarrollo
informático que tienen que ver con el almacenamiento y procesamiento de datos, entre las
cuales podemos mencionar las bases de datos y algunas técnicas de inteligencia artificial,
entre otras. Por lo anterior, estos análisis que estaban restringidos a los centros de
investigación que tenían importantes recursos a nivel bioinformático, son ahora accesibles
para cualquier centro. La disponibilidad de herramientas en línea, permite incluso al
biólogo molecular principiante, obtener una cantidad considerable de información útil a
partir de los bancos de datos de nucleótidos, y así realizar casi cualquier análisis vía
servidor.
El sitio “phylogeny.fr” (http://www.phylogeny.fr/version2_cgi/index.cgi) está

diseñado principalmente para los biólogos que no tienen experiencia en la filogenia. Este
sitio tiene un cuadro en el que puede “pegar” secuencias en diferentes formatos y
disponer de una cuenta de correo electrónico. Después, simplemente hacer clic en el
botón “Ejecutar” y al finalizar el usuario recibirá los resultados de su análisis en su correo
electrónico. Mientras, el sitio “CIPRES” (Cyber Infrastructure for Phylogenetic RESearch;
http://www.phylo.org/portal2/login!input.action) es una plataforma que permite
reconstrucciones filogenéticas a gran escala (cientos de miles de secuencias) para los
especialistas en filogenia.
PROCEDIMIENTO
Utilizando las herramientas bioinformáticas propuestas realice el análisis
filogenético de la siguiente secuencia:
TGTACAAAAAAGTTGGTTAAAATCCAAATTATTTTCTGAAGGTAACATTTCTCTGTGAC
TGAAGAAAAAGGGGGATGATTAAAAAATAAGAATACAGACCATCTTGTTACTGAAGAA
TTATAATTACTTTTATTTCCAGGAAATGGGACTTAATGTATAATTATTTATATAGGCAAT
TTAAAAAAAATAGTTTTTGTATATAACAAAATGAAAAAAAAAACCCTTTTCAGTAGAAAA
ATTAAAAGGGTCCCTTGTTAATACTGATTTTGACCTCCAAATGGATTAAATTCTCTTTC
ATAAAACAATTTTAACTATTAGAAACCCTGTCCTTCCCTGAGCGACCCTTTCAGAACTA
GGAAGTTTGCCATTTTGGATTTTATTAAGGACCATGTGACTCAAAGTATTATAATAATA
ATAAAGTTGGAAGGGACCTTGAAGGTCATCGAGTCCAAACCCCCTGCTCAGGCAGGA
AACCCTATATCATTTCAGACAAATGGCTGTCCAGTCTCTTTCTTAAAAACTTCCAGTGA
TGGAGCTTTTCTCTGTCTCTTAGATTCAAATGGAATATGTGGGNTCTTCCTTGTTCAGG
TATTTTCCTTCAGTCTCACTTACCAAG
BIBLIOGRAFÍA
Adrien Gallou, Alba Priscilia Suaste Dzul, María Guadalupe Serna Domínguez, Gilda Yadi
Andrade Michel (2015) Manual de prácticas del Laboratorio de Biología Molecular.
Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria. SENASICA.
53 |
B. R. MESTAS
Sanger, F., Nicklen, S. y Coulson, A.R. 1977. DNA sequencing with chain-terminating
inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences 74: 5463-5467.
Shendure, J., Mitra, R.D., Varma, C. y Church, G.M. 2004. Advanced sequencing
technologies: Methods and goals. Nature Reviews Genetics 5: 335-344.
54 |
B. R. MESTAS
PRÁCTICA N° 14
DISEÑO DE INICIADORES O “PRIMERS”
INTRODUCCION
Los iniciadores o “primers” son secuencias de 18 a 30 nucleótidos que hibridan
con el DNA molde y flanquean la región que uno desea amplificar.
OBJETIVOS
 Manejar los criterios básicos para el diseño de “primers” específicos y
degenerados.
 Diseñar “primers” específicos y degenerados para amplificar una secuencia
génica.
 Utilizar herramientas bioinformáticas para el diseño de “primers”.
DISEÑO DE “PRIMERS” ESPECÍFICOS

Para el diseño de estos oligonucleótidos se deben tener en cuenta las siguientes
consideraciones:
1. Los primers deberían ser específicos para la secuencia a ser amplificada y pueden
tener una longitud de 18 a 30 bases. Los primers se deben probar contra la base
datos.
2. Los primers deberán formar duplex estables a la temperatura de hibridación,
3. Se debe evitar la complementariedad entre el “primer forward” (primer 1) y el “reverse”
(primer 2) y los productos de la amplificción,
4. Los primers “forward” y “reverse” deben tener una Tm (temperatura de fusión) similar.
5. El contenido de G + C debe ser de aproximadamente 50%
6. G o C en el extremo 3’
7. Se debe evitar corridas de A y/o T
8. Evitar secuencias que permitan la formación de horquillas
DISEÑO DE “PRMERS” DEGENERADOS

Aunque la mayoría de las PCR se realizan con iniciadores específicos, cuando se
desea amplificar un gen en base a las regiones mas conservadas de una familia de
proteínas se debe diseñar iniciadores degenerados. Para el diseño de este tipo de
iniciadores se debe tener en cuenta la degeneración del código genético, por lo que los
iniciadores que nos permitan amplificar una secuencia particular de aminoácidos también
debería ser degenerada de tal manera que codifique todas las posibles permutaciones. En
este sentido un “primer” diseñado según la secuencia de 6 aminoácidos cuyos codones
presentan 64 permutaciones, puede potencialmente reconocer 64 diferentes secuencias
nucleotídicas de as cuales solamente una de ellas se hibridará con la secuencia blanco.
Si dos de estos “primers” se usa en una reacción de PCR, entonces hay 64 x 64 o 4096
posibles permutaciones. En vista que los productos de PCR se amplifican
exponencialmente, puede darse el hecho de que si usamos “primers” altamente
degenerados, solamente muy pocos de ellos pueden reconocer el gen blanco. Por ello se
recomienda usar “primers” no muy degenerados.
El adecuado diseño de iniciadores degenerados es fundamental para un

clonamiento exitoso de un gen a partir de su secuencia proteica. Por ejemplo, uno de los
“primers” degenerados a partir de la secuencia aminoacídica Leu-Ile-Gli-Glu, sería:
55 |
B. R. MESTAS
a. De acuerdo al alfabeto de la Tabla 1, la secuencia del “primer” sería 5´-YTH-ATH-

GGN-GAR-3´.
b. Seguidamente se debe calcular el número de permutaciones de la secuencia: ((2 x 4)
x 3 x 4 x 2) = 192 permutaciones. El extremo 3´ del “primer” debería presentar la
mayor cantidad de las permutaciones de la secuencia aminoacídica, ya que la Taq
polimerasa no puede realizar la reacción de síntesis a partir de un “mismatch” que
esté en el extremo 3´.
c. La degenerancia del “primer” se puede reducir incorporando en la secuencia inosina,
ya que este nucleótido sintético puede generar enlaces de hidrógeno con las 4 bases
nitrogenadas. Para nuestra secuencia, el resultado sería 5´-YTH-ATH-GGI- GAR-3´ y
que presentaría sólo 48 permutaciones. Sin embargo, el uso de la inosina reduce la
temperatura de hibridación y por esta razón se puede obtener una elevada
amplificación de productos inespecíficos.
d. Finalmente, los nucelótios del extremo 3´ preferentemente deben ser G o C y no N, I
o T, ya que la timidina (y la inosina) no pueden hibridar específicamente. Se prefieren
las guanosinas y citidinas ya que estas bases se enlazan mediante 3 puentes de
hidrógeno y por lo tanto son mas fuertes que el par A-T.
Tabla 1. Alfabeto de nucleótidos degenerados que se usa para el diseño de iniciadores

degenerados.
Letra Especificaciones
A Adenosina
G Guanosina
R puRina (A o G)
K Keto (G o T)
S Strong (G o C)
B Not A (G, C o T)
H Not G (A, C o T)
N ANy (A, G, C o T)
C Citidina
T Timidina
Y pYrimidina (C o T)
M aMino (A o C)
W Weak (A o T)
D Not C (A, G o T)
V Not T (A, C o G)
I Inopina
EJERCICIOS
1. Utilizando el programa primer3 diseñe el par de iniciadores específicos que le
permitan amplificar las siguientes secuencias génicas:
a) GATGCTGCTTATTGAATATTGCCCTGAAGGAGGCAGAGATGGGTGGTCTGGA
GAACTGGGTGGGCAATACCCCCCTGTGTGAGTTGCGGCGTCTGTCGCCCCA
TGCGGGGGTGCGGATTTTCGGAAAGCTGGAGGGGAACAACCCCGCCGGTT
CGGTCAAGGATCGCCCGCCTTGAACATGATTCGTCGGGCGCTGGAGCGGGG
CACCATCACCCCCGCTACACGTCTGATCGAACCGACCAGCGGGAATACGGG
CATCCGCCCTGGCCATGGCGGCATCGGTACGCGGATTGTCCATGACGCTGA
TCATGCCAGACAATATGAGCATCGAAAGGCGCCAGGTGATGCGTGCCTACG
GAGAAGGAGTGCTCGCGGGCATCTCTTCGGGCGGAGCGCTGGCGGCGGCG
56 |
B. R. MESTAS
ATACGGGTGGCGCAGCATCTGGAGGTTGGCGTGATCGTCGTCATCATCTGC
GATCGGGGTGACCGCTACCTCTCTACCGGGCGTTTTTCCGGCCTGACGCAAT
GATGCAAGGGGCGCAGCAGGGTCTTGCCGA
b) ATGAGTGTAGGAACCAGGATACAGGATGTGCTCCTCCTTTTCGGGGAATTGC
GCAACGCGCCATACGCACCGGCGGTTTTTGCCACCAGCTTCGGGGCGGAAG
ATATGGTGCTCACGGACCTGATTGCGAAACATGCGCCCTGGATAGAGATATT
CACCCTCGATACCGGTCGTTTACCGGAGGAAACCTACCGGCTGATGCAGGA
AACCCGGGGGCA..............................CGCGCGCCATCTCCCCCGGCCAGGATA
TCCGCGCGGGTCGTTGGTGGTGGGAGAATCCGGCCACCAGAGAGTGCGGC
CTGCATGTCATTGACGGCAAACTGGTCCGCGCCAAGCCAGTAACACCACAA
AAAACTTCAGGACAAATATGATGCATACTACAGCCGAAAAACATGTTC
c) ATGAATACGCTCGAAGCCGAATCCCTCGGAATCCTGCGCGAAGCCGTAGCC
GAGGCGCGCAAGCCGGTGATGCTGTATTCCATCGGCAAGGATTCCTCGGTA
ATGCTGCACCTGGCGCGCAAGGCCTTTGCGCCGGGTCCGCTGCCCTTTCCG
TTGCTGCATGTGGACAC............................GGCTGCTATCCCCTCACCGCCGCT
GTCGAAAGCGATGCCGATACCCTGGAGGCGGTGATCGCCGAAACCCTGGC
CGCACGCAGCTCCGAGCGCGCCGGGCGGCTGATCGACCATGACAGCTCCG
GCTCCATGGAACGCAAGAAGCAGGAGGGCTATTTCTGATGAACGGTCGCTT
GCGTT
 Acceda a la implementación de Primer3 en el White Head Institute, en la siguiente

dirección: http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi. Le aparecerá la
siguiente ventana
57 |
B. R. MESTAS
 Pegue la secuencia en el campo de texto en la parte superior de la página de

primer3, como se muestra a continuación. Presione el botón “Pick Primers” y espere
unos segundos.
 Debe encontrarse ahora en la página de resultados de primer3:
 Regrese a la página inicial de primer3 con el botón de regreso de su navegador e

ingrese la secuencia correspondiente a su primer, por ejemplo
GTTCCGGAATTCGCGCGCG, en el cuadro de texto justo debajo de la opción de
escogencia del primer izquierdo, como se muestra a continuación. Presione “pick
primer” y observará que región de su secuencia se amplificará.
58 |
B. R. MESTAS
 Pero ... ¿es esto todo lo concerniente al diseño de primers?

No!, por supuesto que no, aún es posible realizar algunos otros análisis. Por
ejemplo mediante mFold2 podemos visualizar el tipo de estructura secundaria
susceptible de ser formada por nuestros primers. Este tipo de visualización puede
resultarnos de ayuda a la hora de corregir ciertos parámetros.
Visite la siguiente dirección: http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/mfold-

simple.html o alternativamente: http://mfold.burnet.edu.au/dna_form. En cualquiera de
los dos casos se encontrará con un formulario donde podrá ingresar la secuencia del
primer a analizar. Deberá ingresar una cuenta de correo electrónico válida, donde los
resultados le serán enviados.
2. Diseñe los “primers” degenerados a partir de las siguientes aminoacídicas

correspondientes al extremo N-terminal de unas proteínas:
a) EAAWWA
b) VFFDKDQ
c) DDLESNR
BIBLIOGRAFÍA
1. Alberts, B Johnson, A. Lewis,J, Raff, M. Roberts, K and Walter, P (2002) Molecular
Biology of The Cell. G.S. Fourth Edition. Garland Science
2. Sheeler (1993) Biología Celular, estructura bioquímica y función. Ed. Limusa. México.
59 |
B. R. MESTAS
PRÁCTICA N° 15
COMUNICACIÓN CELULAR
a) AMP cíclico m) Proteínas de transmisión
b) Cascada de señalización n) Proteínas de armazón
c) Dominio de homología con la o) Proteínas transductoras
plecstrina (PH) p) Proteína de señalización
d) Dominio SH2 intracelular
e) Factor intercambiador de q) Proteína G
nucleótidos de guanina (GEF) r) Receptor
f) GMP cíclico s) Receptor acoplado a proteína G
g) Grb2 t) Receptor quinasa con secuencias
h) Molécula señal extracelular repetidas ricas en leucina (LRR)
i) Proteínas amplificadoras u) Receptor serina /treonina quinasa
j) Proteínas de anclaje v) Receptor tirosina quinasa
k) Proteínas integradoras w) Vía de señalización
l) Proteínas moduladoras
PROBLEMAS
1. ¿A qué se debe que células distintas puedan responder de manera diferente a la
misma molécula señalizadora, incluso cuando estas células tienen los mismos
receptores?
2. Un incremento en la concentración de cGMP en las células de la musculatura lisa del

pene causa una relajación de los vasos sanguíneos y desencadena una erección.
Explique de que forma la molécula señal NO (óxido nítrico) y el fármaco viagra
producen un aumento en el cGMP.
3. Considere una vía de señalización que se produce a través de tres proteínas quinasa,
las cuales se activan secuencialmente por fosforilación. En caso, las quinasas están
unidas formando un complejo señalizador mediante una proteína de armazón; en el
otro caso, las quinasa difunden libremente (Fig. 15-2). Analice las propiedades de
ambos tipos de organización en términos de amplificación de la señal, velocidad y
potencial de entrecruzamiento entre las vías de señalización.
Figura 15-2. Una cascada de proteínas

quinasa organizada por una proteína de
armazón o compuesta por componentes que
difunden libremente.
60 |
B. R. MESTAS
4. Si la señalización apareció como una solución a las demandas de la pluricelularidad,

¿cómo explican entonces los mecanismos tan similares de señalización que utilizan los
animales y el hongo unicelular Saccharomyces cerevisiae?
5. La maduración del fruto es un proceso complicado de desarrollo, diferenciación y

muerte (excepto para las semillas). El proceso se desencadena por cantidades
mínimas del gas etileno. Normalmente, el etileno es producido por los propios frutos a
través de una vía bioquímica, cuya etapa limitante está controlada por la ACC sintasa,
la cual convierte la S-adenosilmetionina en un compuesto de ciclopropano que es el
precursor inmediato del etileno. El etileno inicia un programa de expresión génica
secuencial que incluye la producción de varias nuevas enzimas, incluyendo la
poligalacturonasa, que probablemente contribuye a debilitar la pared celular.
La compañía en la que trabaja, Agribucks, está intentando obtener tomates

mutantes que no pueden sintetizar su propio etileno. Este fruto podría estar más tiempo
en la parra y desarrollar su sabor mientras aún permanece verde y firme. Se podrían
transportar en este estado robusto de inmadurez y exponerse al etileno justo antes de
su llegada al mercado. Esta estrategia debería permitir que se vendieran en su mejor
momento y el proceso no implicaría la adición de aditivos artificiales de ningún tipo.
Decide utilizar una aproximación antisentido, que funciona especialmente bien en

plantas. Pone el cDNA de la ACC sintasa en un vector de expresión de plantas de
manera que el gen se transcriba al revés, lo introduce en la célula de tomate y
regenera la planta por completo. Con total seguridad, la producción de etileno se inhibe
en un 99.5% en estas tomateras transgénicas y su fruto no alcanza la maduración.
Pero cuando se ponen en presencia de una pequeña cantidad de etileno, se convierten
en preciosos y sabrosos tomates rojos maduros en 2 semanas. ¿De qué manera
supone que la transcripción del gen del la ACC sintasa en sentido reverso bloque la
producción del etileno?
6. La proteína Ras funciona como un interruptor molecular que se activa gracias a un

factor intercambiador de nucleótidos de guanina (GEF) que le permite unirse al GTP.
Una proteína activadora de GTPasa (GAP) inactiva el interruptor al estimular a Ras
para que hidrolice su GTP unido a GDP de una manera mucho más rápida que en su
ausencia. Así, Ras actúa como un interruptor de la luz que una persona lo enciende y
otra lo apaga. En una línea celular que carece de la GAP específica de Ras, ¿qué
anormalidades en la actividad de Ras, si es que hay alguna, esperaría encontrar en
ausencia de señales extracelulares? ¿Y en su presencia?
61 |
B. R. MESTAS
PRÁCTICA 16
CÁNCER
a) Carcinoma j) Oncogén
b) Carcinógeno k) Protooncogén
c) Leucemia l) Retinoblastoma
d) Linfoma m) Proteína Rb
e) Metástasis n) Virus tumoral
f) Progresión tumoral o) Cáncer colono-rectal
g) Sarcoma p) p53
h) Gen Rb q) Promotor tumoral
i) Gen supresor de tumores
PROBLEMAS
1. Ahora que la secuenciación del DNA es tan barata, fácil y rápida, su tutor ha construido
un consorcio de investigadores que persigue el ambicioso objetivo de rastrear todas las
mutaciones de un conjunto de tumores humanos. Ha decidido centrarse en el cáncer
de mama y en el cáncer colono-rectal puesto que son responsables del 14% de las
muertes por cáncer. Para cada uno de los 11 cánceres de mama y de los 11 cánceres
colono-rectales, diseña cebadores para amplificar 120,839 exones en 14,661
transcritos de 13,023 genes. Como controles, amplifica las mismas regiones a partir de
muestras de DNA tomadas de dos individuos normales. Secuencia los productos de
PCR y utiliza un software analítico para comparar las 456 Mb de la secuencia tumoral
con la secuencia del genoma humano publicada. Queda estupefacto al encontrar
816,986 mutaciones puntuales. Este dato representa más de 37,000 mutaciones por
tumor. Seguramente no puede ser cierto.
Después de pensar en ello un buen rato, se da cuenta de que el ordenador

produce a veces errores al nombrar las bases. Al analizar la causa del error,
inspecciona visualmente cada lectura secuenciada y encuentra que puede excluir
353,738 cambios; el número se reduce así a 463,248 mutaciones, o alrededor de
21,000 mutaciones por tumor. Todavía demasiadas
A. ¿Puede sugerir al menos otras tres fuentes de mutaciones aparentes que en
realidad no contribuyen al desarrollo del tumor?
B. Después de aplicar diferentes criterios para filtrar cambios de secuencia
irrelevantes, encuentra un total de 1,307 mutaciones en los 22 cánceres colono-
rectales y de mama, o aproximadamente 59 mutaciones por tumor. ¿Cómo podría
decidir cuáles de estos cambios de secuencia se corresponden con mutaciones
relacionadas con el cáncer y cuáles es probable que sean mutaciones “pasajeras”
producidas en genes que no tienen relación con el cáncer (pero encontradas en los
tumores por que sean producido en las mismas células con mutaciones
verdaderamente cancerosas)?
C. ¿Detectará su exhaustiva estrategia de secuenciación todos los posibles cambios
genéticos que afectan a los genes diana de las células cancerosas?
62 |

Practicas de Biologia Molecular 2019

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Practicas de Biologia Molecular 2019

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

MANUAL DE PRACTICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR R.

MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO, MANEJO

Para al buen desempeño en las prácticas de laboratorio es necesario conocer las

En el Laboratorio de Biología Molecular se trabaja con DNA animal, vegetal y de

La luz ultravioleta (UV) empleada para la visualización de DNA a 385 nm de

El voltaje utilizado para la electroforesis puede generar quemaduras por descarga

El proceso de ebullición de las proteínas en baño maría a 100ºC deberá realizarse

MANEJO DE MUESTRAS Y REACTIVOS EN BIOLOGÍA MOLECULAR

El material biológico debe ser conservado a bajas temperaturas. El DNA genómico

Debido a la importancia que tiene la medición de volúmenes en los procedimientos

Se recomienda que los equipos empleados para los procedimientos descritos en

Los reactivos a usarse durante los procesos de extracción y purificación de ácidos

LISTA DE SUSTANCIAS PELIGROSAS

8. la piel. Utilizar guantes apropiados y lentes de protección y manipular en la campana

Lo anterior es cierto para la mayoría de soluciones acuosas, excepto para las

Si es usada inadecuadamente, la micropipeta transferirá volúmenes inexactos.

La micropipeta puede perder su calibración. Comprobar la calibración de la pipeta es

EL DNA COMO MATERIAL GENÉTICO

Los últimos 5 a 10 años marcan el inicio del conocimiento público de la biología

Figura 1. Tres líneas de investigación condujeron a descubrir que el DNA es el material

En Biología Molecular, el recuento de células es muy importante pues permite

Figura 1. Cámara de Neubauer

El hemocitómetro es un portaobjetos especializado en el cual una retícula es

Figura 2. Cuadrícula, dimensión y volumen de la cámara de Neubauer

Concentración = N° de célula contadas ÷ 4 × factor de dilución × 10,000

Para calcular la concentración celular presente en la suspensión celular original

Concentración = N° de célula contadas ÷ 100 × factor de dilución × 10,000.

Para calcular el total de células presentes en la suspensión original de la cual se

Células totales = concentración celular × volumen total de muestra original

Los ensayos de citotoxicidad son técnicas de cultivo celular. La toxicidad en tejidos

La supervivencia celular es dependiente de la capacidad del organismo en sustituir

Entre las pruebas de citotoxicidad in vitro, se puede analizar el comportamiento de

ribonucleico, la síntesis de proteínas, hormonas y enzimas, el metabolismo energético, la

La citotoxicidad puede ser definida como la capacidad que poseen ciertos

Ensayos que miden la actividad metabólica utilizan enzimas

Un buen ejemplo es la enzima lactato deshidrogenasa la cual es empleada en un

Ensayos basados en el principio de exclusión celular

EXPERIMENTO Nº 1. CONTEO DE CÉLULAS Y DETERMINACIÓN DE LA VIABILIDAD

El azul de tripán es un colorante vital. La reactividad del azul de tripán se basa en

3. Mezcle la suspensión celular completamente con una pipeta serológica.

9. Determine la densidad de células viables de la mezcla original de acuerdo a la

28 x 2 x 10,000 = 560,000 = 5.6x105 cells/ml

Células totales = 5.6 x 105 cells/ml x 5 ml = 2.8 x106 cells/ml

Nota: células en total de los 5 ml cuando fueron contadas

EXPERIMENTO Nº 2. CONTEO DE CÉLULAS Y DETERMINACIÓN DE LA VIABILIDAD

REPLICACIÓN DEL DNA

En 1972, Okazaki realizó diversos experimentos que le permitieron sugerir que la

Los experimentos que se relatan a continuación permitieron comprobar la

Se trabajó con células de E. coli. Debido a que los fragmentos de Okazaki se

De acuerdo con las características indicadas, se requieren unos 40 minutos para

2. El proceso de aislamiento del cromosoma bacteriano consiste en suspenderé las

Las muestras corridas en la electroforesis son las siguientes:

4. ¿De qué forma esperaría que afectara la pérdida de la actividad exonucleasa

5. Ha descubierto un nuevo organismo que crece en las profundidades oceánicas en un

6. Muchos orígenes de replicación de los embriones tempranos de Drosophila están

Figura 5-3. Electromicrografía en la que se muestran cuatro burbujas de replicación en un

a. Identifique las cuatro burbujas de replicación en la Figura 5-3. Indique las

7. Suponiendo que no hay restricciones de tiempo en la replicación del genoma de una

Tabla 1. Recomendaciones sobre la colecta y manejo de algunos tejidos de plantas y

COLECTA EN CAMPO/ ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA

0.5 cm o menores) para facilitar su nitrógeno líquido a -80 °C

HOMOGENIZACIÓN DEL TEJIDO

Pistilos u homogeneizadores. Los pistilos disgregan la muestra mediante fricción con la