Técnicas Histológicas y Microscopia

Preparación del Tejido MO

1º Paso: Obtención de la muestra:

· Biopsia; tejido vivo.
· Autopsia; tejido muerto.
· Necropsia; tejido podrido - necrosado.

2º Paso: Fijación: conserva la muestra, evitando la perdida de la estructura,

· El fijador de uso más común es la formalina 10%
· Este fijador no reacciona con los lípidos, por lo tanto es un mal fijador de las membranas;

3º Paso: Deshidratación:
· Luego después de la fijación, se lava y deshidrata la muestra con alcoholes crecientes para quitar el agua de la
muestra. Después de eso, se utilizan solventes como el xileno (aclaración) o tolueno para extraer el alcohol al 100%

4º Paso: Inclusión:
· Incluir la muestra en la parafina liquida
· Luego después que la parafina se ha enfriado y endurecido se obtendrá un bloque denominado taco que mantiene la
consistencia.
· Se coloca el taco en una maquina denominada micrótomo, cortes de 5 a 7 μm (micras), que permite el paso de la luz.
Hasta acá el proceso se denomina montaje inicial.

5º Paso: Coloración:
· Los cortes de tejido se montan en portaobjetos. Los cortes incluidos en parafina deben ser “desparafinados” con xileno
y rehidratados con alcoholes decrecientes en agua. Para teñirlos se utiliza Hemotoxilina y Eosina, los componentes
nucleares se tiñen de azul y los citoplasmáticos de rosado. Después de la tinción se deshidrata y aclara nuevamente y se
coloca en un portaobjetos, cubriéndolo con Bálsamo de Canadá.

Hematoxilina: Colorante básico. Tiene afinidad por estructuras ácidas.

Eosina: Colorante ácido. Tiene afinidad por estructuras básicas

Preparación de tejido MET

Fijación: se utiliza glutaraldheido o tetroxido de osmio
Deshidratación: alcoholes crecientes o acetona.
Inclusión: se utiliza resinas epoxi y materiales plásticos
Cortes: con un ultramicrotomo.
Contraste: agregado de iones de metales pesados (antes o después de la inclusión) para intensificar la dispersión de
electrones.
Montaje: los cortes se montan en una grilla cubierta por una película plástica

Preparación de tejido para MEB

Fijación: gutaraldheido.
Deshidratación: alcohol o acetona.
Secado por punto crítico: en ciertas muestras biológicas, preserva estructura.
Metalizado: vaporización de metales sobre la superficie de la muestra.
Microscopia
Poder de resolución
Distancia mínima que debe existir entre dos puntos del objeto para que se visualicen como separados.
_ Ojo humano: 250 μm = 0.25 mm
_ Microscopio óptico de campo claro (máxima): 0,2 μm = 200 nm
_ Microscopio electrónico de barrido (máxima): 10 nm
_ Microscopio electrónico de transmisión (máxima): 2 nm

Límite de resolución
Es la capacidad de visualizar como dos imágenes separadas dos puntos que están muy próximos.

Microscopia Óptica
· Microscopio de campo claro: Es el microscopio óptico propiamente dicho y el más usado.
Utiliza un haz de luz blanca que atraviesa la muestra (previamente coloreada) e ilumina el campo de observación. Los
detalles se observan debido a las diferencias de absorción de la luz en las distintas partes del preparado biológico.

· Microscopio de campo escuro: Tiene un condensador especial que dirige los rayos luminosos desde la parte lateral e
ilumina la muestra oblicuamente. La lente recibe sólo la luz dispersada por los diferentes componentes celulares, por eso
se ven brillantes sobre un fondo oscuro. Se utiliza para ver células vivas y móviles, y elementos con poco contraste con
el MO de campo claro.

· Microscopio de fluorescencia: Permite detectar estructuras que fluorescen. Pueden ser autofluorescentes o adquirir
fluorescencia mediante colorantes especiales (fluorocromos unidos a anticuerpos). La luz utilizada es capaz de activar el
flourocromo y que sea visible. Fuente de luz variable: visible, UV o de long. de onda corta.

· Microscopio confocal de barrido: Es un sistema que combina partes de un MO al que se adapta un equipo fluorescente
y con un sistema de barrido. La fuente de luz es un rayo láser que escanea el interior de la muestra en un plano. Permite
obtener imágenes de estructuras complejas (tridimensionales o en corte) con excelente definición. Permite estudiar
planos por separado e incluso hacer reconstrucciones 3D y 4D.

· Microscopio de luz ultravioleta: La imagen en este tipo de microscopio depende de la absorción de la luz UV por las
moléculas de la muestra. Los resultados se registran en una placa fotográfica para q se pueda analizar-se.

· Microscopio de polarización: Utiliza luz polarizada para iluminar la muestra. Permite diferenciar detalles debido a la
presencia de estructuras isotrópicas y anisotrópicas. Las isotrópicas, no modifican la luz polarizada y se ven oscuras. Las
estructuras anisotrópicas (llamadas también birefringentes) se ven brillantes ya que modifican el plano de luz polarizada
y envían rayos luminosos al filtro analizador.

Microscopia Electrónica
· Microscopio electrónico de transmisión (MET); utiliza la interacción de un haz de electrones con la muestra para
producir una imagen.
· Microscopio electrónico de barrido (MEB); el haz de electrones no atraviesa la muestra sino que explora su superficie.
· Microscopio electrónico de transmisión-barrido; combina características del MET y del MTB para permitir el
microanálisis de rayos X por sonda electrónica.
 Acidofilia y Basofilia
ACIDOFILIA: Afinidad que demuestra una estructura o tejido por un colorante ácido. Ej: Citoplasma, filamentos,
proteínas, colágeno y fibras musculares.
BASOFILIA: Afinidad que demuestra una estructura o tejido por un colorante básico. Ej: heterocromatina, núcleo,
nucléolo, RER, ADN y ARN, GAG,s
ACIDÓFILO: Estructura que reacciona con un colorante ácido.
BASÓFILO: Estructura que reacciona con un colorante básico.

Reactivo de Schiff
Es la leucofucsina, formado por fucsina y bisulfato. Es incolora. Pero torna en rojo en contacto con aldehídos.

PAS
Esta reacción se emplea para determinar la presencia de macromoléculas ricas en hidratos de carbono. (Glucógeno y
glucoproteínas)

Cortes por congelación Técnicas histoquímicas

_Permiten observar sustancias que se alteran o pierden con la técnica
histológica de rutina (por ej. lípidos, que se tiñen con sudanes).
_Técnica que permite hacer diagnósticos rápidos
(intraoperatorios) de biopsias tomadas intraquirúrgicamente.
Los cortes son de baja calidad (20 μm); el diagnóstico se confirma con
la técnica histológica de rutina y se colorea con H&E.
_Se colorean con azul de metileno u otros colorantes acuosos.
_No son aplicables a tejidos duros.
_Permite visualizar sustancias específicas.
_Se sirve de una reacción enzimática para colorear (no de cargas como
la H&E). No hay basofilia ni acidofilia sino reacciones + o -
_Se usa una coloración de contraste para ver el resto del preparado.
Ejemplos de técnicas: PAS, Feulgen, TRAP.
Ejemplo TRAP:
rojo: célula + para la sustancia a detectar (enzima fosfatasa ácida)
celeste: contraste con hematoxilina