Tema 1

1. Niveles de organización

El precio que hay que pagar por pasar a un nivel organizativo superior es el aporte continuo de
energía.

Toma materia viva a mayor grado de organización mayor será su complejidad estructural.

La segunda Ley de la Termodinámica establece que los procesos físicos y químicos tienden a
aumentar el desorden, el caos en el universo, es decir, su entropía.

Lo seres vivos parecen ser capaces de crear orden a partir del desorden

Los seres vivos a través de la absorción construyen sus propias y complejas estructuras (energía
libre), para después expulsarlas en forma de energía (calor) aumentando el desorden o entropía.

El aumento del orden en las células vivas se compensa con un aumento mayor del desorden en
su entorno.

Los seres vivos son sistemas abiertos (Intercambian materia y energía con su entorno)

Transformamos de unidades pequeñas en grandes moléculas

 2. Escala de la vida
Histología: Composición, estructura y
características de los tejidos orgánicos.

Citología: morfología de la célula

Biología celular: propiedad, estructura y

funciones de las células, su interacción con el
ambiente y su ciclo vital.

Biología molecular: composición molecular y

funcionamiento de las moléculas.

3. Métodos de estudio de células y tejidos (biología celular)

Las células, tejidos y órganos tienen dos hándicap: su pequeño tamaño y su translucida. Sin
embargo, se puede solucionar con los microscopios.

El microscopio óptico, estudia la morfología de los tejidos y las células, lo que llamamos la
estructura. Solo se vé su estructura

El microscopio electrónico, nos permite conocer cómo es el interior de la célula y cómo son los
componentes de la matriz extracelular que la rodea lo que llamamos la ultraestructura.
Dentro de esta nos encontramos:
- Microscopio Electrónico de Transmisión (MET)
- Microscopio Electrónico de Barrido (MEB)

➔ La mayoría de los tejidos son “post-mortem”

➔ Los tejidos frescos son química y físicamente inestables, blandos y translúcidos.
➔ La observación microscópica se realiza de secciones delgadas
➔ El procesamiento de las muestras para su estudio con el microscopio óptico y el
microscopio electrónico, presenta las mismas etapas.
➔ La diferencias en los reactivos utilizados y condiciones técnicas son debido a la distinta
naturaleza de la observación con uno y otro microscopio.

a. La técnica histológica

Tipos de Microscopio óptico:

- Campo claro: se necesita que la

muestra sea lo suficientemente fina para que
la luz pase a través de ella, por ello se tiene
que utilizar diversos métodos de tinción.
- Microscopía confocal
- Campo oscuro: solo la luz refractada
por las estructuras de la muestra penetra en
el objetivo. Se pueden detectar partículas
individuales muy pequeñas.
- De luz polarizada
- Contraste de fase
 - Fluorescencia
Denominamos proceso histológico a una serie de métodos y técnicas utilizados para poder
estudiar las características morfológicas y moleculares de los tejidos. Hay diversos caminos para
estudiar los tejidos, es decir, series de técnicas que se utilizarán dependiendo de qué
característica deseemos observar.

Fijación

Todos los tejidos sufren tras su muerte dos tipos de procesos degradativos. El objetivo de la
fijación es preservar sus características morfológicas y moleculares (estructura y composición
química) lo más parecidas posibles a las que poseía en su estado vivo.

No existe un fijador universal, debemos escoger aquel que mejor se adapte al estudio que
deseamos realizar (MO o ME).

Para el estudio microscópico-óptico, pequeños fragmentos de 1 cm 3

del órgano se introducen en los casetes de inclusión, para ser fijados durante 24 horas a 4Cº.
Hay diferentes fijadores:

Etanol, metanol, acetona: deshidratan y coagulan las proteínas, especialmente proteínas

citosólicas. Extraen los lípidos de los tejidos, sin modificar los carbohidratos, glucógeno,
pigmentos y ciertas proteínas.

Ácido acético: cambia el estado coloidal de las proteínas. Sin embargo, destruye las
mitocondrias y tiene una mala fijación a la membrana y al citoplasma

Ácido pícrico: coagula las proteínas de los tejidos manteniendo la estructura celular y preserva
bien el glucógeno y lípidos.

Formaldehído: conservan la estructura general de la célula y sus orgánulos, ya que reacciona

con la parte amino de las proteínas. Preserva bien los lípidos y no reacciona con los
carbohidratos.

Glutaraldehído: en solución polimeriza formando dímeros y trímeros. Poca velocidad de

penetración pero tiene una alta capacidad para preservar la estructura celular.

Tetróxido de osmio: poca penetración.

Líquido de Bouin: ácido acético glacial, formaldehído 37% y ácido pícrico

Solución de Clarke: etanol y ácido acético glacial en una proporción de 3:1

Solución de Carnoy: Etanol absoluto (60%), ácido acético glacial (10%) y cloroformo (30%)
Criostato

Una forma rápida de endurecer los tejidos sin necesidad de inclusión es el criostato.
- La preservación molecular es máxima
- Las muestras congeladas pueden cortarse en secciones finas (5-15 μm) y más gruesas del
orden de cientos de μm.
- Es la manera más rápida de obtener secciones puesto que es posible congelar la muestra
sin necesidad de fijación y córtala de inmediato, como las biopsias.

Debe de ser una congelación muy rápida (isopentano enfriado con nitrógeno líquido), evitando
la formación de cristales de hielo que deteriora las estructuras celulares

Deshidratación

Para eliminar el agua de las células y tejidos, se

sumerge la muestra en concentraciones
crecientes de etanol en agua (70%, 96% hasta el
etanol 100%).

Sustituimos en las células el agua por alcohol.

Se utilizan posteriormente de la deshidratación

solventes orgánicos y aromáticos (p. ej xileno)
para quitar cualquier residuo de agua y preparar
la muestra para la inclusión en parafina.

Inclusión en parafina

La parafina es la más utilizada de manera

rutinaria para los estudios de MO. El único
objetivo de la parafina es endurecer la muestra
para poder ser cortada.

Ofrece muchas ventajas prácticas:

➔ Es químicamente neutra
➔ Es soluble en muchos disolventes
➔ Es fácil de cortar con cuchilla

Para una buena impregnación la parafina debe

estar a 2ºC; por encima de su punto de fusión
(60ºC).

Generalmente, las muestras se someten a varios

baños de parafina pura líquida (en estufa) hasta
que se eliminan totalmente el disolvente.
Confección del bloque

Las muestras se retiran de los casetes de inclusión y se inmovilizan, con la orientación deseada,
en bloques de parafina realizados con los moldes adecuados.

La parafina solidifica por cristalización al bajar la temperatura y una vez endurecida, se procede al
desmolde del bloque.

Cortes en parafina
El microtomo consta de un soporte para el bloque de parafina
móvil y orientable, un soporte fijo y también orientable para la
cuchilla (acero) y un sistema mecánico sencillo de rotación para
el avance automático del bloque.

El microtomo de parafina permite la obtención de secciones

delgadas seriadas (3-5 μm) que deberán ser uniformes en grosor
y homogéneas en su superficie, sin desperfectos.

Una vez comenzado el corte de nuestra muestra se obtienen

tiras de secciones unidas por las caras paralelas a la cuchilla.
Estas tiras se suelen manipular con pinceles o lancetas y, antes
de su fijación definitiva en la superficie de un portaobjetos, han de estirarse para que nuestro
tejido quede perfectamente extendido. Aprovechando la hidrofobicidad de la parafina, las
secciones se colocan sobre agua calentada a unos 35 °C a 40 °C y el calor las hace extenderse
sin llegar a su punto de fusión, que está en torno a los 60 °C.

Dependiendo de lo que queramos ver del tejido cortaremos con un ángulo diferente y decidiremos
si longitudinalmente o transversalmente.

Técnicas de tinción
Las técnicas de tinción están basadas en reacciones químicas.
Tienen por objeto aumentar el contraste de las estructuras biológicas, de acuerdo con su afinidad
por los colorantes a utilizar.
Tipos:
- Técnicas histológicas generales o de rutina: muestra la topografía general del corte de una
muestra.
- Histología Animal: Hematoxilina-Eosina (H-E)
- Histología Vegetal: Hematoxilina-Verde Yodo (H-VI)

- Técnicas histológicas especiales: añaden nuevos datos, al colorear estructuras, dentro o

fuera de las células que resultan invisibles con una tinción de rutina. (para teñir algo en
concreto)

Dentro de esta categoría tenemos métodos de tinción que permiten observar y caracterizar
compuestos o radicales químicos, presentes en los tejidos, que son el producto de una
reacción química. A estas técnicas se las denomina Técnicas histoquímicas.

b. Técnicas especiales
INMUNOCITOQUÍMICA

En la inmunocitoquímica se utilizan dos tipos de anticuerpos: anticuerpos policlonales producidos

por animales inmunizados y anticuerpos monoclonales producidos por líneas celulares
inmortalizadas.

Las policionales: una proteína específica, como la actina, se aísla a partir de una célula muscular
de una especie y se inyecta en otra especie. La 2º especie, el sistema inmunitario reconoce la
moléculas de actina de la rata como un antígeno extraños esto desencadenó una cascada de
reacciones inmunitarias que activan las células inmunitarias llamadas linfocitos B. Diferentes
clones de linfocitos B se activan y eventualmente conducen a la producción y secreción de
anticuerpos anti-actina. Estos anticuerpos policlonales representan clones de linfocitos B donde
cada clon reconoce diferentes regiones de la molécula de actina. Los anticuerpos se retiran de la
sangre, se purifican y conjugan con un colorante fluorescente que servirá como localizador de la
molécula de actina en tejidos o células de la 1º especie.

Los anticuerpos monoclonales: son los producidos por una línea celular productora de
anticuerpos que se derivó de un solo clon de linfocitos B. Se inmuniza una especie con ese
antígeno. Los linfocitos B activados, que son de diferentes clonas, son aislados del tejido linfático
del animal y se fusionan con células de mieloma (células tumorales inmortales) para generar
hidromas. Esta fusión produce diferentes hidromas, uno por cada clon de linfocitos B activado
fusionado a la célula del mieloma, que conserva su capacidad de secretar un solo tipo de
anticuerpo (monoclonal) que reconoce a dicha proteína (p. ej actina)

Inmunofluorescencia directa e indirecta.

a. En la inmunofluorescencia directa, un anticuerpo primario marcado con fluorocromo
reacciona con un antígeno específico dentro de la muestra de tejido. A continuación, las
estructuras marcadas, se examinan con el microscopio de fluorescencia en el que una longitud de
onda excitadora (por lo general luz ultravioleta) desencadena la emisión de otra longitud de onda.
La longitud de esta emisión depende de la índole del fluorocromo utilizado para marcar el
anticuerpo.
b. El método indirecto comprende dos procesos. Primero, los anticuerpos primarios
específicos reaccionan con el antígeno de interés. Segundo, los anticuerpos secundarios, que
están marcados con fluorocromo, reaccionan con los anticuerpos primarios. La apariencia de las
estructuras marcadas dentro del tejido es la misma en ambos métodos y para verlas se necesita
un microscopio de fluorescencia.

4. Microscopía óptica de contraste de fase

Variaciones en la λ que atraviesa distintas estructuras celulares.
Debido a las propiedades de difracción del interior de la célula, la luz se retrasa al
atravesar la materia orgánica de diferente densidad.
La luz que atraviesa regiones de índice de refracción relativamente alto (las zonas
más densas) se refracta y queda fuera de fase con respecto al haz de luz que ha pasado por la
muestra. De este modo, Las partes oscuras de la imagen corresponden a las regiones densas de
la muestra; las claras corresponden a regiones menos densas.

Se aplica en el estudio de las células vivas. Por ejemplo: cultivos celulares y microorganismo o las
células vivas sin coloración.

5. Microscopía de fluorescencia
Las sustancias fluorescentes al ser iluminadas por una radiación de λ corta captan
energía y emiten luz de λ mayor, cambiando de color. Se utiliza para la detección de moléculas
con fluorescencia natural (autofluorescencia) como la vitamina A y algunos neurotransmisores.

Se utilizan marcadores fluorescentes (fluorocromos) para la

detección de los tejidos mineralizados.

También se encuentran los filtros electores que filtran la onda que

quieres.

Con este tipo de microscopio:

- Se estudian las células vivas o muertas
- Localización intracelular de componentes o sustancias
- Análisis de parámetros funcionales
 6. Microscopía electrónica
● Permite estudiar los detalles de las estructuras biológicas (ultraestructura)
● Resolución de imágenes = 3 nm (aumento máximo x 120 mil)
● Gran diversidad de técnicas

Tipos:
- Microscopio Electrónico de Transmisión (MET)
- Se estudian secciones
- Estructura celular interna
- Microscopio Electrónico de Barrido (MEB o MES)
- Se observa la pieza completa
- Visión tridimensional
- Se estudian la superficie
- Microscopio Fuerza Atómica (MFA)

A. MET:
Muestras
● Siempre “post-mortem”
● Fragmentos de 1mm3: poco poder de penetración de los reactivos
● Preservadas y estabilizadas (fijadas)
● Endurecidas para poder cortarlas (bloque) con epoxi
● Secciones ultrafinas (200 nm- 10 nm): poder de penetración de los e-
(ultramicrotomo)
● Desecadas (deshidratadas)
● Han de tener contraste: grados de electrodensidad (metales pesados)
No se tiñen sino que utilizan contraste con metales.
Los metales que se reflectan - negros
Los metales que no se reflectan - blancos
● Sometidas a alto vacío dentro de MET: ausencia de aire para no tener
interferencias.
Procesado
1. Fijación
a. Preservar
b. Detener procesos vitales antes de autolisis
c. Fijadores: glutaraldehído, tetraóxido de osmio (afinidad por lípidos de membrana)
2. Deshidratación
a. Eliminación del agua (alcoholes, acetona)
3. Inclusión
a. Consistencia dura par cortar y conservación
b. Bloque (polímeros: resinas epoxi, metacrilato)
4. Corte ultrafino
a. Con ultramicrotomo. Sección con cuchillas de vidrio o diamante
b. Grosor apropiado (50 nm - 200 nm).
5. Montado
a. Sobre rejillas metálicas de 3 mm (Cu, Ni)
6. Contraste
a. Sales de metales pesados
b. Acetato de uranilo: cromatina nuclear
c. Citrato de plomo: concentración de proteínas
(Cada agujero de la muestra es donde incide el haz de e-)

Fundamento:
La energía cinética acumulada en los electrones en su caída, se transforma en luz (fotones) que al
chocar con la pantalla fluorescente pero solo chocará los que no hayan encontrado metales
pesados en su trayectoria y estos se verán oscuros y los que los captan se verán blancos.
 B. MEB
Muestras
● Mineral, manufactura o biológicas (siempre “post-mortem”)
● Muestra completa (no se corta)
● Muestras biológicas: estabilizadas (fijadas)
● Extremadamente limpia (si hay suciedad va a salir)
● Desecadas (especialmente la muestra biológica)
● Conductiva (Muestra biológica con metalización: cubiertas de oro, platino)
● Sometidas a alto vacío dentro del MEB
Esquema
Se recogen los electrones dispersados que salen de la muestra.

Criofractura
Técnica utilizada en microscopía electrónica que permite describir la estructura molecular de las
superficies internas de la membrana celular.

Pasos:
1. Congelación rápida de la muestra
2. Corte o fractura de la misma a muy baja temperatura
3. La fractura resultante de la membrana plasmática
produce dos superficies nuevas. La superficie de la
membrana que atrás tiene el espacio extracelular se
llama cara E; la cara que tiene atrás el protoplasma
(citoplasma) se denomina cara P.
4. Sombreado metálico de la superficie de corte de la
muestra típicamente con platino evaporado.
5. Eliminación del tejido subyacente mediante detergentes
6. Observación de la réplica con un MET.