Se denomina TCNICA HISTOLOGICA al conjunto de procedimientos aplicados a un material biolgico (animal o vegetal) con la

finalidad de prepararlo y conferirle las condiciones ptimas para poder observar, examinar y analizar sus componentes morfolgicos a
travs de los microscopios fotnicos y electrnicos.

PROCEDIMIENTOS INMEDIATOS O VITALES

Permiten la observacin y el estudio de protozoarios, clulas sanguneas, clulas descamadas o disociadas, clulas en cultivo de tejidos;
estructuras muy delgadas y translcidas como la membrana peritoneal de animales pequeos o epidermis de vegetales, granos de polen
etc. suspendidas en los lquidos de su hbitat natural o solucin salina balanceada. Para una observacin ptima suele utilizarse tipos
especiales de microscopios fotnicos como el de campo oscuro o el de contraste de fases: observacin al estado fresco.
En ciertos casos, cuando se requiera destacar alguna estructura celular o tisular se pueden emplear colorantes inocuos para la vida de
las clulas, no modifican la estructura de ellas ni interfieren en sus funciones. A este procedimiento se le conoce como coloracin vital.

COLORACIN VITAL Puede ser de dos tipos:

1. Coloracin intravital, consiste en la administracin de colorantes vitales a travs de las vas digestiva o intratraqueal; mediante
inyecciones sanguneas, linfticas, subcutnea, o intraperitoneal. Las soluciones de uso ms frecuente son: tinta china, carmn de litio,
azul tripan (partculas colorantes que demuestran la capacidad fagoctica).
2. Coloracin supravital, En este procedimiento se emplean colorantes que se aplican a clulas o tejidos provenientes de organismos
vivos. Se demuestran: mitocondrias con el verde de Jano, los grnulos de las clulas cebadas con el rojo neutro, la sustancia
granulofilamentosa de los reticulocitos con el azul brillante de cresyl, ramificaciones nerviosas con el azul de metileno; o el ADN y el ARN
de las clulas con naranja de acridina (empleando el microscopio de fluorescencia).

PROCEDIMIENTOS MEDIATOS O POSTVITALES

Tienen por finalidad preparar clulas, tejidos y rganos procedentes de seres en los que los procesos vitales se han detenido y es
necesario conservar la estructura que tenan en vida. De manera general, para alcanzar este objetivo es necesario realizar los siguientes
pasos:
- Toma de la muestra
- Microtoma
- Fijacin
- Coloracin o tincin
- Inclusin
- Montaje

A) TOMA DE LA MUESTRA
La calidad y la fidelidad con que una clula o un tejido muestren una imagen al microscopio, con las caractersticas morfolgicas que
posean cuando estaban con vida, dependen esencialmente de la prontitud y el cuidado que se aplic para obtener la muestra a ser
procesada mediante los pasos mencionados anteriormente.
Existen diversos procedimientos que permiten obtener muestras de tejidos y rganos para conseguir preparaciones histolgicas de
buena calidad. Estos son:
a) Mediante la biopsia: (del griego bios = vida y opsis = visin), consiste en la toma de un fragmento de tejido u rgano de un ser
vivo. Realiza a travs de una operacin quirrgica hecha exprofesamente o durante la intervencin quirrgica efectuada en
pacientes y corroborar as un diagnstico de una determinada lesin. La biopsia puede ser:
incisional
excisional
por sacabocados
por puncin y absorcin
por raspado
por trepanacin
El estudio de clulas de superficies epiteliales de renovacin constante (mucosas bucal, gstrica, vaginal, uretral), se realiza a travs
de la Citologa Exfoliativa. En otros casos clulas obtenidas mediante puncin (clulas sanguneas o de la mdula sea) se extienden
en una lmina portaobjetos para hacer los frotis, colorearlas y examinarlas.
b) mediante la necropsia, las muestras se obtienen de seres muertos: En este caso es recomendable que los tejidos y rganos se
obtengan inmediatamente despus de producida la muerte.
Recomendaciones para la toma de las muestras.
Los tejidos y los rganos provenientes de biopsias y necropsias se seccionar empleando bisturs o navajas de afeitar nuevos, sin
hacer presin sobre ellos. No es recomendable el uso de tijeras para cortar los tejidos pues stas ocasionan compresiones y
jalonamientos de los tejidos y rganos que distorsionar su estructura microscpica. El tamao de las muestras no debe exceder de 10
mm por lado con un grosor de 5 mm.
B) FIJACION.
Es un procedimiento cuya finalidad, al aplicarlo es Detener la vida de las clulas e impedir las modificaciones post morten que pueda
sufrir la clula (procesos autolticos), manteniendo la estructura morfolgica de clulas y tejidos sin que ocurran cambios notables en
ellos.
Esto se consigue inmovilizando (por coagulacin o precipitacin) las molculas protenicas e inhibiendo principalmente las
enzimticas hacindolas insolubles. Esta accin garantiza la integridad de las clulas y tejidos; se efecta por mediante agentes
qumicos denominados fijadores.
Los fijadores se clasifican en dos grandes grupos:
a) Oxidantes: el tetraxido de osmio (cido smico), el bicromato de potasio, cido crmico, bicloruro de mercurio o sublimado
corrosivo, cido pcrico, cido actico.
b) Reductores: el formaldehdo, el glutaraldehdo, el alcohol etlico, el alcohol metlico.

La accin oxidante o reductora de los fijadores le confieren a las clulas ciertas condiciones que posibilitan una mejor aplicacin
de las sustancias colorantes, por ejemplo: el alcohol etlico absoluto conserva el glucgeno, el bicloruro de mercurio provoca que las
anilinas coloreen de manera ms brillante a las fibras colgenas, el bicromato de potasio facilita la coloracin de las mitocondrias, el
cido actico permite una mejor tincin de los ncleos, el cloruro de calcio conserva e insolubiliza parcialmente a los lpidos.
Los fijadores son:
a) Gaseosos: como el formaldehdo
b) lquidos: como el cido actico, al alcohol etlico, laacetona, etc.
c) slidos: como el bicloruro de mercurio, el bicromato de potasio, etc.

Condiciones de un buen fijador

Una sustancia fijadora para que ejerza de manera eficiente y adecuada sus funciones debe poseer las siguientes condiciones:
Matar inmediatamente a las clulas, impidiendo la aparicin de los procesos autolticos. Para tal fin el fijador debe poseer:

Un buen poder de penetracin, que en contados instantes se introduzca con rapidez en el espesor de la muestra
Un buen poder de difusin, que no fije slo la porcin superficial de la muestra sino que alcance las porciones ms profundas
de la misma.
Producir cierta dureza a los tejidos sin que se provoque excesiva retraccin o hacerlos quebradizos y friables.
Debe de ser de fcil manipulacin.
No debe disolver componentes celulares.
Que sea fcil de conseguir y que sea barato.
Las soluciones fijadoras suelen ser fijadores simples, o fijadores compuestos (mezclas fijadoras) en las que utilizan ms de una
sustancia fijadora.
Ejemplo de fijador simple
Formol o formalina. Est considerado como la sustancia fijadora de mayor uso en los laboratorios que realizan tcnica histolgica. El
formol comercial consiste en una solucin acuosa del gas formaldehido al 39 - 40%. Se presenta como un lquido claro, incoloro, que
emite vapores sumamente irritantes para la conjuntivas y la mucosa respiratoria. Su accin fijadora se ejerce coagulando las
protenas.
Es un fijador que posee un buen poder de penetracin y difusin. Mantiene de manera adecuada la estructura y facilita la coloracin
posterior de los componentes celulares y tisulares. Endurece bien las muestras. Conserva bastante bien a las grasas.

Fijadores compuestos.
Una sola sustancia fijadora difcilmente rene todas las condiciones para ejercer una buena fijacin, por lo tanto es aconsejable usar
mezclas fijadoras a travs de las cuales se acrecientan las cualidades de un fijador y se atenan sus defectos y desventajas.
http://www.facmed.unam.mx/deptos/biocetis/PDF/Portal%20de%20Recursos%20en%20Linea/Apuntes/3_tecnica_histologica.pdf

Colorantes vitales bsicos

Son aquellos que ejercen su accin en las partes vivas de las clulas sin alterar su metabolismo, y poniendo de relieve sus
estructuras. Son preferidos los colorantes vitales que son retenidos por la clula durante el tiempo necesario para poder realizar la
observacin

Rojo neutro
Es una sustancia soluble en agua. Puede ser administrada a los animales superiores por va endovenosa o digestiva, en la proporcin
del 1%; se aplica diariamente varios centmetros cbicos de la solucin. Por la va digestiva se usa cuando se trata de estudiar
lamucosa digestiva.
En los animales acuticos (renacuajos, protozoarios, etctera), se adiciona el colorante al agua donde viven en la proporcin de 1 x
100 000 1 x 200 000. El paso del animal colorado al agua natural no provoca la decoloracin inmediata, sino que esta tiene lugar
despus de varios das. Se emplea tambin como reactivo indicador para conocer la acidez o alcalinidad de las sustancias con que se
pone en contacto; pasa del rojo intenso (si tiene pH7 o menos), al rojizo (si tiene pH7,2 a pH7.6); o es anaranjado (s es superior a pH7.6),
hasta ser amarillo cuando tiene pH8, esto es cuando la alcalinidad es dbil.
Los cuerpos colorados con el rojo neutro pueden conservarse en esta forma si los colocamos por 12-48 horas en el fijador de
Mitamura.
Azul de metileno
Como colorante vital, el azul de metileno se emplea principalmente en las coloraciones postvitales o supravitales, utilizadas para el
estudio del tejido nervioso, ya que introduciendo en un animal el azul de metileno en inyeccin endovenosa, este se fija en las clulas
nerviosas. La solucin se prepara ensuero fisiolgico al 0,5% o al 1%.
Para evitar la decoloracin del tejido se coloca la pieza en la solucin fijadora de Bethe.
La fijacin se hace en 4-24 horas, y el lavado ser con alcohol. Con este fijador se consiguen preparaciones permanentes.
Azul de metileno, tie clulas animales, hace ms visibles sus ncleos, colorante vital en reticulocitos.

Verde Jano
Es tambin un colorante supravital, utilizado para el estudio de mitocondrios. Se aplica por inmersin o inyeccin. Los mejores
resultados se obtienen consangre. En este caso se usa en una solucin al 1 x 10 000 en suero fisiolgico al 0,85%. Se aplica una gota

en el portaobjeto con sangre fresca, y despus, se coloca un cubreobjeto. Una observacin minuciosa mostrar mitocondrios primero
en los linfocitos y luego en los leucocitos granulares, hasta que todos quedan teidos.
La coloracin dura varias horas, y la corporacin puede evitarse poniendo vaselina en el borde del cubreobjeto.
Azul Jano .- Es otro colorante supravital, que tiene iguales usos y se aplica de idntica forma que el verde Jano.
Azul naftol.- Ha sido ocasionalmente usado como colorante vital.
Violeta neutral.- Tiene propiedades similares al rojo neutro, pero ha tenido menos uso en trabajos microscpicos.

Colorantes vitales cidos

Alizarina roja S.- Se ha usado como colorante vital para el tejido nervioso en pequeos invertebrados.
Prpura brillante R.- Usado como colorante vital para la levadura.
Azul trypan.- Se emplea disuelto en agua destilada, al 1% o mejor en suero fisiolgico. Se aplica en inyecciones intraperitoneales o
subcutneas, en la proporcin de 0,5-1 cc de solucin por cada 20 gramos de peso del animal. Las inyecciones se repiten cada 5 das,
hasta que el animal tome color azul. La fijacin se hace en formol al 10%, y los cortes se realizan por congelacin.
http://www.ecured.cu/Anexo:Colorantes_vitales