UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN.

Facultad de Agronomía
Ingeniero agrónomo

Métodos y procedimientos para aislar y reproducir microorganismos

fitopatógenos

Fitopatología y laboratorio
Curso impartido por:
Benito Encinia Castillo
Alumno
Jesús Alejandro Silva Martinez

13 de abril de 2021

INTRODUCCIÓN
 En la naturaleza la mayoría de los microorganismos no se encuentran aislados,
sino integrados en poblaciones mixtas, para el estudio de sus de estos
microorganismos y de sus propiedades se tienen que separar unas de otras a
través de varios métodos obteniendo así cultivos de cada una. En esta
investigación se observan diferentes métodos de los cuales son las más comunes
técnicas para separar estas poblaciones y así estudiarlas, para ello se
complementan con un poco de tutoriales acerca de como se realizan diferentes
métodos.

DESARROLLO

Método de estría cruzada en tres sectores

 Es la técnica más utilizada para aislar a los

microorganismos en una placa de agar.
 Se coloca la muestra y se realiza un barrido con un asa de
inoculación hasta lograr separar colonias individuales de la
cepa de interés.

 La estría cruzada se puede utilizar como un

procedimiento semicuantitativo.

Interpretación:

 Desarrollo en el tercer sector: Abundante

 Desarrollo en el segundo sector: Moderado
 Desarrollo en el tercer sector: Escaso
Procedimiento

Pasos:
1. Esterilizar el asa en la flama del mechero o incinerador.
2. Enfriar el asa en un extremo de la placa de agar.
a. Tomar la muestra con el asa.
b. Estriar la superficie del medio, sin romper el agar.
c. Esterilizar y enfriar el asa.
d. Estriar el segundo sector, cruzar tres de las estrías con el
primer sector para arrastrar
microorganismos.
e. Esterilizar y enfriar el asa.
f. Estriar el tercer sector de forma similar al segundo.
g. Esterilizar el asa al término del procedimiento.

Mediante el uso de esta técnica de simple ejecución y fácil interpretación, se

pueden evaluar diferentes grupos bacterianos según el medio de cultivo que
contenga el frasco. Es aplicable para evaluar bacterias heterotróficas, aerobias
totales (BAT), bacterias reductoras de sulfato (BRS), anaerobias heterotróficas
totales (BAnT), etc.
El método consiste en efectuar una serie de diluciones decimales a partir de una
muestra, inoculando 1 ml de las diluciones realizadas en una caja Petri
añadiendo posteriormente medio cultivo estéril de acuerdo con el
microorganismo y posteriormente llevar a incubar en condiciones adecuadas.
Se inocula el primer frasco, sin retirar la aguja se agita el mismo, se invierte y se
retira 1 ml que se inocula en el 2° frasco. Con una nueva jeringa, se retira 1 ml
 del frasco N° 2, previamente agitado, y se inocula el frasco N° 3 y así
sucesivamente, utilizando una nueva jeringa para cada frasco.

Extensión en superficie con espátula de Drigalski

Aquí también pueden prepararse diluciones decimales. Se deposita sobre la

superficie de la placa una gota ó 0,1 ml de una determinada dilución del cultivo de
microorganismos y se extiende con ayuda de la espátula, previamente esterilizada
por flameado, en todas las direcciones hasta que esté completamente seco.

Inoculación en la placa de agar Mac Conkey por siembra y aislamiento:

1. Observar la dureza del medio agar Mac Conkey y la posición del ansa necesaria
para no romper la superficie.

2. Esterilizar el ansa (al rojo) y enfriar manteniendo esterilidad.

3. Tomar una colonia aislada del microorganismo aislado en el TP1 con el ansa
en forma estéril.

4. Sembrar en la placa de agar Mac Conkey mediante la técnica de depósito y

posterior quemado. 5. Volver a esterilizar el ansa al terminar de sembrar para
eliminar microorganismos remanentes.

6. Incubar la placa de Petri a 37ºC (invertida) hasta aparición de colonias.

Métodos especiales

Se basan en las características del germen que se quiere aislar. Hay que tener en
cuenta que puede haber gérmenes que poseen idénticos comportamientos frente
a un mismo agente físico o químico.

i) Calentamiento: se utiliza para el aislamiento de gérmenes esporulados de los no

esporulados. Consiste en calentar la suspensión a 100ºC durante 10 min. y 85ºC
durante 15 o 30 min. Luego se siembra en medios sólidos.

ii) Agregado de álcali o ácido: tratamiento de la muestra con algunos de estos

agentes ya que existen microorganismos que los resisten y otros que no.

iii) Variaciones de la temperatura de incubación: incubando a dos temperaturas

distintas

iv) Cambios en el pH: existen unos pocos gérmenes que pueden crecer en medios
con pHs extremos. v) Presencia de sales o colorantes: debido a la capacidad de
distintos microorganismos de crecer o no en medios con sales, sustratos.

Método para microorganismos anaeróbicos.

Debido a la sensibilidad de las bacterias anaeróbicas al

oxígeno, es de vital importancia realizar su cultivo de
manera que se erradique el oxígeno tanto de la
preparación del medio de cultivo y soluciones, como de
la inoculación y crecimiento de los mismos. Es por ello
que algunas medidas utilizadas en el cultivo de
anaerobios incluyen la utilización de materiales de vidrio
en contraposición de plásticos, el colocar los cultivos en cámaras especiales que
evitan el intercambio de gases y utilizar gases como nitrógeno, dióxido de
carbono, helio, entre otros, para saturar la atmósfera (Strobel, 2009).

Generadores de mezclas gaseosas:

Sobres comerciales de Gas Pack: son de aluminio y contienen dos tabletas: a)

Ácido cítrico y bicarbonato de sodio y b) borohidruro de sodio. Al hidratarse el
sobre, la primera tableta libera CO2 y la segunda H2. Si la jarra funciona bien al
cabo de una hora existe menos del 1% de O2

CONCLUSIÓN

Al analizar los diferentes métodos que existen para separar los cultivos y de esta
manera identificarlos y estudiarlos podemos observar que hay para cualquier
microorganismo y como se puede estudiar cada uno. De esta manera podemos
analizar también los microorganismos que necesitan oxigeno y como quitar ese
porcentaje para poderse estudiar. Podemos observar que este tipo de métodos y
procedimientos a lo largo de la carrera serán fiables para conocer los
microorganismos que pueden afectar a los cultivos, pero también sembrar cultivos
que son necesarios para las producciones agropecuarias.

VIDEOS COMPLEMENTARIOS

 SIEMBRA POR ESTRIA EN PLACA - YouTube

 Siembra en placa por extensión o en superficie. - YouTube

 2016/11 - Bacterias Anaerobias: Generalidades y Presentación de Casos - YouTube

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

 Aislamiento de microorganismos - Técnica de estria cruzada - Presentaciones de Google

 Técnica de Recuento por Dilución (laboratoriomag.com.ar)

 SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS (unr.edu.ar)

 Metodos de Aislamiento de Microorganismos - StuDocu

 Tecnicas y metodos de aislamiento y selección de microorganismos | conalepfelixtovar

(wordpress.com)
 Strobel, H. (2009). Basic Laboratory Culture Methods for Anaerobic Bacteria. En Biofuels
(págs. 247-261). Humana Press.