Evaluación del Alumno en Curso Ordinario Código: ABP2.

No. Rev.:

Evaluación Formativa No ___. Rúbrica y Guía Fecha Rev:

de observación para Aprendizaje Basado en
Hoja 1 de 1
problemas (ABP).

Materia: Operaciones Unitarias Profesor: Cynthia Rangel Fecha de aviso de actividad:20/04/2021

I
Tema: Bioseparaciones Tiempo de evaluación: 2 horas

Porcentaje de evaluación: 40% Calificación: Fecha de entrega: 28/04/2021

Competencia de unidad: 4 Aplica las diferentes técnicas de bioseparación para la obtención de

metabolitos de interés
 Integrante (s):
 Barajas Alcocer Jehiely
 Godínez Guerrero Dulce Guadalupe
 González Granados Juan Jesús Paolo
 Hernández Hernández Manuel de Jesús
 Ríos Hernández Andrea Lizbeth
El propósito de esta Rúbrica es recabar los datos de cómo cada ABP
demuestra el nivel de competencia que ha adquirido el estudiante. La
competencia de egreso que es evaluada con esta Rúbrica es:
Instrucciones para (1) Identificar, formular y resolver problemas de ingeniería aplicando los
el evaluador: principios de las ciencias básicas e ingeniería (7) Trabajar efectivamente en
equipos que establecen metas, planean tareas.

Instrucciones: Para cada ABP por favor califique con los criterios
establecidos, donde 4 = Excelente, 3 = competente, 2 = En desarrollo, 1 =
Principiante. Indique las puntuaciones en la columna de más a la derecha. Si
el criterio no aplica para el presente ABP, use “N/A”. Al final de esta Rúbrica,
existe unacelda para
sus comentarios.
Instrucciones para Realizar la resolución del problema con los puntos señalados en el esquema
los estudiantes: funcional.
1.Supongan que son contratados por una farmacéutica para dirigir el
proceso de producción de antibióticos. En el laboratorio deciden
utilizar los microrganismos Streptomyces kanamycetus y Bacillus
licheniformis para la obtención de kanamicina y de Bacitracina,
respectivamente. De acuerdo con el protocolo de obtención del
metabolito, contesta lo siguiente:

a) Para obtener ambos antibióticos hay que lisar las células de los
microorganismos, ¿Los protocolos de lisis celular de Streptomyces
kanamycetus y Bacillus licheniformis son iguales? De ser diferentes menciona
las principales diferencias y además describe ¿Por qué tendrían que ser
protocolos diferentes?

Lisis celular: es el proceso por el cual una célula se desintegra o es

destruida a través de la ruptura de su membrana plasmática y/o pared
celular. El resultado de la lisis de una o más células se conoce como el
“lisado”, término muy utilizado en la biología experimental para referirse
a la mezcla de la membrana plasmática “rota” y a todos los
componentes citosólicos que son liberados tras dicha ruptura.

Se determino que es microorganismo Streptomyces kanamycetus

tenemos que se lleva a cabo mediante una lisis química alcalina la cual
está basada en la generación de iones OH- con el fin de impulsar el proceso
de lisis celular y el microorganismo Bacillus licheniformis también se
lleva a cabo mediante una lisis química, pero por medio de detergentes,
es una manera más suave de romper la membrana celular por medio de
detergentes o agentes caotrópicos que permiten disolver la membrana
celular.

El protocolo de lisis que se llevó a cabo de los dos microorganismos no

son iguales ya que se realizan de diferente manera, aunque en ambos
casos es mediante una lisis química pero el desarrollo es por técnicas
diferentes ya que estamos hablando de que los microorganismos tienen
características diferentes ya que uno es antibacteriano y otro
antimicrobiano, lo que hace también que se obtengan antibióticos
diferentes pues donde se obtiene Kanamicina se trata de un antibiótico
del grupo de los aminoglucósidos, de amplio espectro, bactericida,
activo sobre bacterias Gram positivas, Gram negativas y
Mycobacterium, por lo que se indica en una amplia gama de infecciones
y en bacitracina que es un antibiótico producido por una mezcla de
polipéptidos cíclicos de síntesis no ribosomal relacionados unos con los
otros y producidos por cepas de la variedad Tracy de la bacteria Bacillus
subtilis aislado.
Estos protocolos deben ser diferentes porque hay ciertas
consideraciones que debemos tomar en cuenta al igual que las
características determinantes de los microorganismos (tipos de
 infecciones que causan, grado de virulencia y susceptibilidad que tienen
a los diferentes antimicrobianos y antibacterianos); las características
determinantes de los antimicrobianos y antibacterianos (espectros de
actividad antimicrobiana, pruebas de eficacia clínica en el tratamiento de
las infecciones, características farmacocinéticas y farmacodinámicas,
perfiles de toxicidad y costes), y por ultimo las características
determinantes que designen gravedad clínica, y etiologías microbianas
de las infecciones, antecedentes de uso previo de antimicrobianos, y
alteraciones genéticas, metabólicas, fisiológicas o patológicas) que
puedan presentarse.
b) Para la producción de antibióticos en medio líquido se utilizan
reactores de aproximadamente 6000L, una vez realizada la lisis
celular ¿Qué operación debe realizarse para la separación de los
metabolitos, restos celulares, azucares y proteínas presentes en el
cultivo de 5000L de Streptomyces kanamycetus? Justifica tu
respuesta.

El microorganismo productor se desarrolla en envases grandes (6000 litros o

más) que contienen un medio de cultivo líquido (5000L de Streptomyces
kanamycetus). La concentración de oxígeno, la temperatura, el pH y los niveles
nutrientes deben ser óptimos dependiendo del microorganismo productor, pues
los antibióticos son metabólicos secundarios (producidos en la idiofase) y el
tamaño de la población se debe controlar muy cuidadosamente para asegurarse
de que la producción máxima está obtenida antes de que las células mueran
(quimios tato). Una vez que el proceso finalice, el antibiótico se debe extraer y
purificar. Lo que sería simple de alcanzar, si el antibiótico es soluble en solvente
orgánico. Si no, debe ser aislado, comúnmente por intercambio iónico, adsorción
o precipitación química.
Por lo tanto, para la separación de metabolitos, restos celulares, azucares y
proteínas, se debe realizar por medio de una técnica de aislamiento, para poder
obtener solamente al antibiótico ya que es lo que nos interesa.
Técnicas de aislamiento:
Aislar es separar un tipo de microorganismo a partir de una población
heterogénea de microrganismos. En hábitats naturales raramente encontramos
un solo tipo de microorganismo en una muestra, por lo tanto, es necesario hacer
algún procedimiento de aislamiento para separar e identificar los distintos tipos de
microorganismos presentes. El objetivo del aislamiento es obtener colonias bien
separadas (las colonias se forman a partir de una sola “unidad formadora de
colonias”) de las que se conseguirá un cultivo puro. Una vez obtenidos los
cultivos puros se podrán estudiar las características macroscópicas,
microscópicas, fisiológicas, etc. de un microorganismo en particular. Hay que
tener en cuenta que siempre el aislamiento se da en un medio sólido. El medio
líquido sirve para enriquecer, pero no para aislar.
El aislamiento se puede lograr directamente a partir de una muestra cuando el o
los microorganismos están en una proporción adecuada. Cuando el
microorganismo que se desea aislar e identificar se encuentra en baja proporción
en la muestra, o interesa un solo tipo de microorganismo, se lleva a cabo un
procedimiento que involucra una primera etapa de aumento del número de
microorganismos del tipo que se desea aislar en relación al resto de la población
(enriquecimiento). Luego se aísla por el método de estrías o por dilución y se
identifica.
Las técnicas de aislamiento una puede ser si el antibiótico es soluble en un
solvente orgánico.
Para aislar se utiliza alguno de los siguientes procedimientos:
a) Métodos generales
1. Por diseminación en superficie (agotamiento de ansa, depósito y posterior
quemado y dilución)
2. Por mezcla.
b) Métodos especiales (calentamiento, agregado de álcali o ácido, por
temperatura de incubación, cambios en el pH y presencia de sales o colorantes).
Estos métodos sirven cuando se desea aislar un microorganismo que posea una
característica especial (resistente al calor, anaerobio, etc).

c) Suponga que realiza una separación por fracciones del antibiótico

que produce Bacillus licheniformis, ¿Qué técnica utilizaría para
identificar en qué fracción se obtuvo la mayor cantidad de
antibiótico? ¿Qué datos cree necesarios deba conocer para
realizarla? Justifica tu respuesta
La extracción con solventes (activo o inerte) es una técnica de separación
selectiva de un compuesto a partir de una mezcla (sólida o líquida). Se basa en
las diferencias de solubilidad de los componentes de una mezcla en un
solvente adecuado. Se emplea para el aislamiento de sustancias disueltas en
soluciones o en mezclas sólidas o también para remover impurezas solubles en
mezclas de compuestos. Constituye una de las técnicas de separación más
utilizada en el laboratorio químico.
La separación de un compuesto por extracción se basa en la transferencia
selectiva del compuesto desde una mezcla sólida o líquida con otros
compuestos hacia una fase líquida (normalmente un disolvente orgánico). El
éxito de la técnica depende básicamente de la diferencia de solubilidad en el
solvente de extracción, entre el compuesto deseado y los otros compuestos
presentes en la mezcla inicial. El proceso puede ilustrarse considerando la
extracción de un compuesto orgánico desde una solución con un solvente
inmiscible en el solvente de la solución. Si a un sistema formado por dos fases
líquidas inmiscibles o poco miscibles entre sí, se agrega una tercera sustancia
soluble en ambas, dicha sustancia se distribuye entre las dos fases de manera
definida. Se demuestra experimentalmente que, en el equilibrio, a temperatura
constante, la relación de las concentraciones en las dos fases tiene un valor
definido, independiente de la cantidad real de la sustancia disuelta.
Método propuesto
La cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) es la técnica utilizada para
contestar este inciso, ya que para separar los componentes de una mezcla
debemos basarnos en diferentes tipos de interacciones químicas entre las
sustancias analizadas y la columna cromatográfica.
Es decir, la muestra a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus
componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones
químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la
columna. El grado de retención de los componentes de la muestra depende de
la naturaleza del compuesto, de la composición de la fase estacionaria y de la
fase móvil, que en si es todo lo que se necesita conocer para llevarla a cabo.
Algunos parámetros de esta técnica que se deben cuidar son:
• Diámetro interno
• Medidas de las partículas
• Tamaño del poro
• Presión del sistema
d) Una vez que ha identificado que la fracción soluble contiene la
mayor cantidad de antibiótico producido por Streptomyces
kanamycetus ¿Cuál sería el método de purificación a utilizar
para obtener este antibiótico lo más puro posible para su uso en
humanos? Justifica tu respuesta

Purificación de Kanamicina

La kanamicina A, referida simplemente como kanamicina es un antibiótico

del grupo de los aminoglucósidos, de amplio espectro, bactericida,
activo sobre bacterias Gram positivas, Gram negativas y
Mycobacterium, por lo que se indica en una amplia gama de infecciones.
El producto de partida de Kanamicina se purificó por precipitación ácida.
Para ello, se pesaron 2,0 g de Kanamicina y se colocaron en un matraz
redondo de 250 ml. A continuación, se añadieron 40 ml de agua
desionizada y 350 UL de NaOH 10M, hasta llegar a pH 14. La disolución
se mantuvo en agitación durante 2 horas. Transcurrido el tiempo, el
matraz fue introducido en un baño de hielo y la purificación se acidificó
hasta pH 4 utilizando HCl 1M. La acidificación provocó la aparición de un
precipitado blanco correspondiente a la Kanamicina. El precipitado se
filtró a vacío durante 1 hora utilizando un matraz Kitasato, hasta el
secado completo.
El producto se caracterizó por mediante H-RMN (resonancia magnética
nuclear de hidrógeno). En un espectro H-RMN cada señal obtenida se
corresponde a un átomo de hidrógeno o de varios con el mismo entorno
químico, teniendo cada compuesto un espectro característico.
La eliminación de las impurezas fue confirmada ya que todas las
 señales correspondían a hidrógenos de la Kanamicina.

e) ¿Con qué método determinaría la calidad de la pureza de la kanamicina y la

Bacitricina? Justifica tu respuesta. Si se inyectara el compuesto puro de
cada uno como control a un espectro de masas ¿Cuál sería el espectro
esperado?
Para determinar la calidad de la pureza de los diferentes antibióticos, así como detectar y
cuantificar diferentes residuos de antibióticos, son múltiples los métodos y diferentes
técnicas que se pueden utilizar.
Dentro de las técnicas existentes hoy en día se destacan el empleo de biosensores por
inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), el cual permite manejar gran número de
muestras debido a su bajo costo y facilidad operativa, siendo un ensayo rápido para la
evaluación cualitativa y presuntiva de los antibióticos en los alimentos de origen animal.
Aunque su especificidad y sensibilidad depende del antibiótico a analizar, siempre se
tendrá que utilizar métodos de confirmación los cuales permiten obtener información
adicional para la cuantificación e identificación inequívoca del analito.
Sabemos que como técnicas de confirmación se utilizan, generalmente, cromatografía de
gases (GC) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Aunque la cromatografía
de gases no es muy apropiada para analizar residuos de medicamentos, debido a que en
su gran mayoría poseen altos pesos moleculares.
Las agencias de salud pública en muchos países se basan en la detección por
espectrometría de masas para la identificación inequívoca de los residuos de agentes
antimicrobianos.
La espectrometría de masas ya sea en modo simple (MS) es la técnica de detección más
extendida. Sin duda alguna, la técnica analítica instrumental más completa que existe
actualmente. Entre las cualidades que justifican esta afirmación, podemos citar, su
capacidad de identificación, análisis de muestras complejas, alta sensibilidad,
caracterización estructural e isotópica de moléculas, por lo cual es considerada,
universal, específica y relativamente rápida. El acoplamiento cromatografía líquida-
espectrometría de masas (LCMS/MS) es especialmente adecuado para el análisis en
química ambiental debido a su gran sensibilidad y selectividad; y mayormente también se
ha utilizado en el análisis de residuos de medicamentos.
Algunos otros métodos utilizados son:
• Cromatografía liquida
• Cromatografía liquida de alta resolución
• Cromatografía Líquida acoplado a espectrometría de masas (LC-MS): Es una técnica
robusta, sensible y selectiva, y se ha convertido en una técnica muy difundida para el
análisis cuantitativo y cualitativo. También se emplea en la detección de residuos de
medicamentos como son los antibióticos.
• Etc.
 f) Finalmente se decide clonar la ruta de biosíntesis en una bacteria. Para
determinar si se expresan las enzimas implicadas en la ruta de biosíntesis,
¿Qué técnica utilizaría? Agregue una ilustración de los resultados
esperados.
Para determinar si se expresan las enzimas implicadas en la ruta de biosíntesis se hace el uso
de una técnica analítica, se trata de la electroforesis.
La electroforesis es una técnica que emplean los cientificos en el laboratorio utilizada para
separar el ADN, el ARN, o moléculas o proteínas en base a su tamaño y carga eléctrica, en la
cuál se utiliza una corriente eléctrica para mover las moléculas y que se separen a través de un
gel. Los poros del gel actúan como un colador, permitiendo que las moléculas más pequeñas se
muevan más rápido que las grandes. Las condiciones utilizadas durante la electroforesis
pueden ser ajustadas para separar moléculas en el rango de tamaño que se desee, en nuestro
caso de acuerdo a las enzimas.
En nuestro caso se pretende realizar un ensayo enzimático el cuál se usa para identificar si
entre las moléculas separadas hay una enzima, se puede detectar añadiendo sus sustratos
(naturales o sintéticos) y sus cofactores, y detectando la aparición del producto, generalmente
coloreado.

Para la detección de proteínas por medio de electroforesis. Se realiza la separación de

proteínas por SDS-PAGE discontinua vertical.
 SDS-PAGE = SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis, electroforesis en gel de
poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sódico.
Gel de poliacrilamida, en placa, vertical. Esta separación es de acuerdo con la masa molecular
(estrictamente, con la longitud de la cadena polipeptídica).
La muestra se trata con SDS (a mayor concentración que en la composición del gel) y se
calienta brevemente a 90-100°C, para provocar la desnaturalización. Se suele añadir también β-
mercaptoetanol para reducir los puentes disulfuro, separando así las subunidades de la
proteína y permitiendo que se extiendan por efecto del SDS.
En la preparación del gel se mezclan:
o un tampón de pH (comúnmente Tris-HCl)
o acrilamida y bisacrilamida
o un agente iniciador de la polimerización, como el persulfato amónico (genera radicales
libres)
o un agente catalizador de la polimerización, como el TEMED (N, N,N’,N’-
tetrametiletilenodiamina)
o SDS

Permite obtener una estimación de la masa molecular de las proteínas separadas. Para ello es
preciso analizar en la misma electroforesis unas proteínas patrón, de tamaño conocido, con las
que se construye una curva de calibrado, representando movilidad frente a logaritmo de masa
molecular. Para controlar el avance del frente de electroforesis (posición de máxima movilidad)
se añade a la muestra un colorante marcador (“tracking dye”), molécula cargada y de pequeño
tamaño que avanza más que cualquier componente de la muestra; el más habitual es el azul de
bromofenol.
Para mejorar la resolución (obteniendo bandas más compactas) se suele emplear electroforesis
discontinua:
 o En la parte superior, un gel acumulador o concentrador (stacking gel), que tiene como
efecto concentrar la muestra en una banda estrecha.
o Ocupando la mayor parte de la placa, un gel separador (resolving gel) en el que tiene
lugar la separación de los componentes.
El efecto concentrador se debe a una mayor porosidad del gel acumulador combinada con una
diferente composición de los tampones de cubeta (Tris-glicina) y de gel (Tris-HCl) y distinto pH
para ambos geles.

g) ¿Qué técnica utilizaría para verificar la correcta integración de los genes que
codifican los genes de biosíntesis? Describa los resultados esperados.

Nosotros utilizaríamos la técnica de electroforesis para la separación de ácidos nucleicos para

verificar una correcta integración de los genes que codifican para la ruta de biosíntesis. Para
ello se debe considerar el medio o gel a utilizar para esta técnica al igual que la forma en
realizarla, por ejemplo, para esta identificación se hace una separación de DNA en geles de
agarosa, por medio de electroforesis horizontal submarina.
En esta, las moléculas de DNA de las células son excesivamente grandes para avanzar a
través de un gel de electroforesis normal, pero pueden analizarse si previamente se han
fragmentado de forma controlada. Se suelen emplear geles de agarosa (concentración entre
0,3% y 2%), más porosos que los de poliacrilamida. Las características mecánicas de estos
geles hacen aconsejable la realización de la electroforesis en horizontal, habitualmente
“submarina”. Las muestras se aplican en pocillos practicados dentro del gel.
Una de las formas más comunes de fragmentar el DNA es el empleo de endonucleasas de
restricción, que cortan en secuencias diana características. La carga eléctrica de una molécula
de DNA depende de sus grupos fosfato, y el número de éstos es igual al doble del número de
pares de bases. La forma de todas las moléculas de DNA es esencialmente la misma. En
consecuencia, resulta que la movilidad en electroforesis depende exclusivamente de la longitud
de la molécula (medida habitualmente como número de pares de bases, pb): la electroforesis
separa los fragmentos de DNA de acuerdo con su longitud en pb. De forma similar al caso de
proteínas en SDS-PAGE, se suelen aplicar patrones en uno de los pocillos para hacer una
curva de calibrado de tamaños. El avance del frente de electroforesis se observa gracias a
colorantes como azul de bromofenol y xileno cianol, añadidos a la muestra.
Cuando los fragmentos de ácido nucleico analizados son de tamaño muy pequeño se utilizan
geles de poliacrilamida, o de mezclas de agarosa y poliacrilamida cuando el tamaño es
intermedio.

Electroforesis en placa horizontal.

Esta técnica además de ser muy utilizada en distintos procesos y para finalidades diferentes, es
una técnica muy utilizada para la identificación y separación de ácidos nucleicos además de ser
utilizada en la industria farmacéutica para la creación de antibióticos.

Referencias
Abraham EP, Chain E. An enzyme from bacteria able to destroy penicillin. Nature
1940;146(3713):837.

Beale JM, Block J. Organic medicinal and pharmaceutical chemistry. Lippincott Williams &
Wilkins. New York: 2010.

Gorman M, Ryan CW. Cephalosporins and Penicillins. En: Chemistry and Biology (Editor:
Flynn EH). Academic

8. RÚBRICA Y GUÍA DE OBSERVACIÓN PARA APRENDIZAJE BASADO EN PROBLEMAS (ABP)

Criterios 4 3 2 1 Resultado
de Excele Compete Desarro Principia (Valoración
desempe nte (90- nte (80- llo (70- nte NA )
ño 100) 89) 79)
Análisis y Los estudiantes hacen Los estudiantes Los estudiantes Los estudiantes son
1 una hacen hacen incapaces de identificar
Abstracción Identificación clara de una Identificación una Identificación las variables del
del hechos, variables, clara de hechos, parcial de hechos, problema, los
análisis variables, variables,
problema de diferentes análisis de análisis de posibles
escenarios posibles para diferentes diferentes escenarios escenarios de
dar solución al escenarios posibles para solución no
posibles acordes al
problema. Realiza una para dar solución al dar solución al problema, la abstracción
problema. hacia
excelente abstracción problema. Realiza Muestran una un esquema o diagrama
una de
adecuada del problema, incompleta abstracción confusa procesos es incorrecta o
con abstracción del nula.
esquema o diagrama, del problema, problema, usando
con
acorde a las variables y esquemas o diagramas o
diagrama esquemas
procesos involucrados de proceso, no acorde a las variables
en el y
tema a identifica todas a las procesos involucrados
tratar. en
variables y procesos el tema a tratar.
involucrados en el
tema
a tratar.
Los estudiantes Los estudiantes Los estudiantes Los estudiantes podrían
2 Planteamiento pueden fácilmente tienen tienen ser
del problema convertir el enunciado pocos problemas varios problemas incapaz de traducir el
de un problema o idea para convertir el para convertir el enunciado del
a una secuencia de enunciado enunciado problema en
ecuaciones de un problema o del problema o idea ecuaciones. Aplica o
idea en identifica
interrelacionadas. en ecuaciones. El ecuaciones. El conceptos, principios o
Todos los conceptos, datos
principios estudiante escoge un estudiante es capaz de manera inapropiada.
y ecuaciones son de
correctamente modelo que aplica a identificar algunos
identificados y aplicados un problema de principios o
ecuaciones
con poco o nada de ingeniería, pero pero muestra tener
esfuerzo. presenta problemas dificultad en distinguir
en el desarrollarlo. que se necesita.

Resultados Obtiene resultados Obtiene Obtiene Obtiene resultados

3 completamente resultados resultados completamente
congruentes completamen parcialment incongruentes
te e
al planteamiento del congruentes al congruentes al al planteamiento del
problema. Presenta la planteamiento planteamiento del problema.
del
información relevante, problema. Presenta problema. La
bien la información
organizada sustentada información está regularmente
en relevante,
unidades correctas, con bien organizada,
organizada sustentada
gráficas, cuadros y sustentada en en unidades
demás unidades correctas,
elementos pertinentes. correctas, con con gráficas, cuadros
gráficas, y
cuadros y demás elementos
demás
elementos pertinentes
pertinentes
Discusión y Los estudiantes, Los estudiantes, Los estudiantes Los estudiantes,
4 obtienen e interpretan producen algunos emiten juicios de generan resultados con
conclusiones y discuten resultados, pero los resultados con poca interpretación
del problema. adecuadamente los luchan con la insuficiencia y significativa; las
resultados interpretación o desarrollan conclusiones están
significativos con carecen de apoyo conclusiones no mal, son triviales e
apropiadas e suficiente para claras. infundadas o no
Interesantes llevar a existen.
conclusiones. cabo sus
conclusio
nes.
En el trabajo Usualmente hace su Rara vez hace su Siempre depende de
5 Comparte otros para hacer su
colaborativo se trabajo. Rara vez se trabajo.
responsabilid organizan al 100% de le tiene que recordar. Frecuentemente trabajo.
ad es y manera autónoma y Funciona s
sin necesidad de adecuadamente e
deberes supervisión y , sin embargo, les
orientación estrecha no son tien
autónomos y e
requieren que recordar.
orientación. Requieren apoyo y
supervisión
estrecha para
resolver
problema en
equipo