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OBJETIVO:
• Observar las diferentes reacciones químicas producidas por las bacterias como
respuesta de su metabolismo.
• Reconocer las principales pruebas bioquímicas empleadas en la identificación de
bacterias.
• Aprender a realizar, leer e interpretar las diferentes pruebas bioquímicas empleadas en
el laboratorio, utilizando las tablas de clasificación de las bacterias de acuerdo a sus
reacciones bioquímicas.
• Aprender la utilidad de los diferentes medios de cultivo selectivos y diferenciales.
• Aplicar los diferentes métodos de siembra vistos en la teoría.
• Realizar algunas pruebas adicionales para identificación de bacterias.
INTRODUCCIÓN
Los microorganismos al igual que todo ser vivo necesita de nutrientes para un buen desarrollo.
Si se combinan las fuentes de crecimiento e inhibidores adecuados y se proporcionan las
condiciones favorables se puede lograr la separación de grupos de microorganismos lo que
facilitara su estudio posterior.
Se conocen diferentes métodos para el cultivo de microorganismos, pero sin lugar a dudas uno
de los factores más importantes para realizar en forma correcta cualquier método de cultivo,
aislamiento, recuento e identificación bioquímica son los métodos de esterilización y técnicas
de asepsia que son utilizadas en el laboratorio, si estas fallan se puede correr el riesgo de
contaminación y por consiguiente de falsos positivos en los resultados finales.
Después de cultivado el microorganismo en estudio, para su identificación más exacta se
recurre a las pruebas bioquímicas para determinar el metabolismo general de dicho espécimen
y de esta manera llegar a una caracterización primaria o secundaria.
El metabolismo microbiano lo podemos definir como el conjunto de reacciones bioquímicas que
pueden llevar a cabo los organismos para obtener energía que más adelante podrá usarse en
otros procesos.
Las diferencias en la forma como procesan los nutrientes y los desechos que producen y
liberan los microorganismos son el resultado de las enzimas que poseen y pueden ser
utilizadas para su clasificación.
Estas enzimas participan en procesos de fermentación y oxidación de azucares y de otros
compuestos orgánicos, liberando metabolitos característicos para identificar cada grupo
taxonómico.
El metabolismo bacteriano se define como el conjunto de actividades químicas de la célula las
cuales se puede dividir en dos: la producción de energía y la utilización de energía.
La diferencia en la forma como procesan los nutrientes y los desechos que producen y liberan
los microorganismos es el resultado de las enzimas que poseen y pueden ser utilizadas para
su clasificación.
Estas enzimas participan en los procesos de fermentación y oxidación de azucares y de otros
compuestos orgánicos, liberando metabolitos característicos para identificar cada grupo
taxonómico.
La mayor parte de bacterias obtienen energía a través de reacciones químicas. Siendo más
comunes las de oxidación – reducción; ya sea en forma anaeróbica o aeróbica. Algunas
bacterias obtiene energía de la luz es decir, fotosintéticas, sin embargo, la energía lumínica
debe convertirse en energía química para ser utilizada por la célula.
Producción de energía en forma aeróbica: La célula utiliza una serie de reacciones
para el transporte de electrones. Esta serie de reacciones son llamadas cadena
respiratoria o sistema del citocromo. Su función es aceptar electrones de compuestos
reducidos y transferirlos al oxígeno que es el último aceptor, para formar agua, y de ahí
que se llame aeróbica. Liberando energía suficiente para sintetizar ATP como fuente de
electrones las bacterias pueden utilizar carbohidratos, lípidos y proteínas. Otras pueden
utilizar compuestos orgánicos e inorgánicos. Algunas pueden utilizar CO2
(quimioautotrofas).
Producción de energía en forma anaeróbica: se habla de respiración anaeróbica
cuando el aceptor final de electrones es una molécula inorgánica diferente del oxigeno
o de fermentación cuando los electrones son aceptados por un compuesto orgánico. El
ATP formado por las reacciones productoras de energía se gasta por diversas vías.
Parte de ella se utiliza en la síntesis de nuevos componentes para las células nuevas,
manteniendo la integridad física y química de la misma célula, en el transporte de
solutos a través de la membrana, en la locomoción, y en la producción de calor.
IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS
En esta práctica tratamos de simular un aislamiento de microorganismos a partir de una
muestra (agua o alimentos contaminados...), para identificarlos posteriormente mediante un
conjunto de pruebas. Concretamente, vamos a realizar la determinación de enterobacterias.
Muchas de ellas forman parte de la flora normal del tracto digestivo del hombre pudiendo
producir enfermedades en determinadas circunstancias. Otros como Salmonella o Vibrio
pueden causar enfermedades por la ingestión de alimentos o agua contaminados. De ahí la
necesidad de desarrollar pruebas que permitan aislar e identificar rápidamente estos
microorganismos.
Las enterobacterias, son bacilos Gram negativos, aerobios y anerobios facultativos, no
esporulados, y comprenden los siguientes géneros:
- Escherichia
- Enterobacter
- Klebsiella
- Citrobacter
Procedimiento
Materiales:
1. AISLAMIENTO
Para el aislamiento se utilizan medios que son selectivos para determinadas bacterias, donde
podremos ver la morfología, color y otras características de los distintos tipos de
microorganismos presentes en la muestra. Se llevarán a cabo inoculaciones en placas de
medios sólidos (Agar nutritivo, Verde Brillante, EMB, TCBS) y en medio líquido (Peptona
alcalina).
Cultivos en placas
1. Tomar una muestra de la suspensión microbiana con un asa de siembra estéril y
sembrar por estría los siguientes medios, con el fin de obtener colonias bien aisladas: 1
placa de Agar nutritivo, 1 placa de Verde Brillante, 1 placa de EMB, 1 placa de TCBS.
2. Incubar a 24 h a 37 °C.
3. Observar la morfología de las colonias y describirlas teniendo en cuenta las siguientes
características:
• FORMA: puntiforme, circular, rizoide, irregular, filamentosa.
• TAMAÑO: grande (más de 3 Mm.), mediana (2-3 Mm.), pequeña (1-2 Mm.)
2. IDENTIFICACIÓN
Las siguientes pruebas se deben realizar con los distintos microorganismos obtenidos en los
aislamientos en placa.
• Pruebas con agar hierro de kligler (agar KIA, ("Agar Hierro de Kligler")): esta prueba
determina la capacidad que tiene un microorganismo para atacar un carbohidrato especifico
incorporado en un medio de crecimiento básico con producción o no de gases, junto con la
producción de ácido sulfhídrico.
Proporciona varios datos fisiológicos importantes para determinar si un microorganismo es
capaz de utilizar la lactosa, produce gas o ácido sulfhídrico. Es un medio que requiere un
procedimiento de inoculación especial.
El agar Hierro de Kliger (KIA), es un medio sólido y diferencial. El fundamento se basa en la
capacidad de fermentación de dos azucares (glucosa y lactosa), en la producción de ác.
sulfhídrico y en la producción de gas.
El Rojo de fenol como : indicador, si vira a rosáceo , indica basicidad del medio, si es amarillo
indica acidificación (derivada de ác. de la fermentación)
Para esta prueba se siembra por método de punción un tubo que contiene Agar kligler inclinado
(agar KIA) a partir de colonias aisladas del microorganismo a ensayar, se incuba a 35°C +/- 2°C
por 24 – 48 horas.
Prueba muy usada para diferenciación de bacilos gram positivos.
Procedimiento
1. Inocular los microorganismos aislados en la placa de EMB en un tubo de medio KIA
con el asa de siembra. La siembra se hará de la siguiente manera: sembrar la
superficie por estría y sembrar la parte interna del medio por picadura.
2. Incubar 18-24 h a 37°C.
3. Observar e interpretar los cambios producidos en el medio.
• Prueba con agar TSI (agar tres azúcares hierro): Esta prueba determina la capacidad que
tiene un microorganismo para fermentar los hidratos de carbono (la glucosa, lactosa y
sacarosa) presentes en el medio y la producción o no de gas.
El agar triple azúcar hierro es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la
capacidad de producción de ácido y gas por fermentación de los carbohidratos ya que
incorpora un indicador rojo de fenol y el sulfato de hierro para la detección del ácido sulfhídrico.
Es un medio útil para identificación de enterobacterias.
Se trabaja en tubos de Khan solidificados en plano inclinado, se inocula el medio por punción
en profundidad y la superficie del pico de flauta con estría. Se incuba a 37ºC y se realiza la
lectura a las 18 – 24 hs.
La fermentación de azúcares provoca la acidificación del medio con el consiguiente viraje del
indicador rojo de fenol a amarillo.
Esto determina que existan 2 cámaras de reacción dentro del mismo tubo.
La porción inclinada (pico) expuesta en toda su superficie al oxígeno es aerobia y la porción
inferior (fondo) está protegida del aire y es relativamente anaeróbica. La porción inclinada del
tubo que esta expuesta al oxígeno atmosférico tiende a tornarse alcalina (roja por el rojo de
fenol) por la utilización aerobia de las peptonas. En el fondo del tubo, donde no hay oxígeno, la
degradación proteica es mínima y se pueden detectar pequeñas cantidades de ácido por la
aparición de un color amarillo (indicador: rojo de fenol). En ausencia de fermentación de
carbohidratos, no se formarán ácidos y por la producción de aminas en el pico todo el tubo
quedara rojo. Esto se da en organismos no fermentadores. El medio esta diseñado de tal forma
que la glucosas se encuentra en una porción 10 veces menor que la lactosa y la sacarosa. Si el
TSI es inoculado con una bacteria fermentadora de glucosa pero no de lactosa ni de sacarosa,
la cantidad de ácido producida por fermentación a partir de la glucosa será baja porque la
concentración de glucosa es baja. Al principio se producirá viraje del indicador al amarillo en el
tubo, pero al continuar la incubación, el pico del tubo retomara al rojo por la degradación
aerobia de las peptonas antes descritas. Si el microorganismo fermenta la lactosa y/o la
sacarosa, como las concentraciones de estos azúcares es de 10 veces mayor, se producirá
mayor cantidad de ácido que no puede ser revirado por la producción de aminas en la
superficie por metabolismo aerobio.
La producción de ácido sulfhídrico a partir de tiosulfato se pone de manifiesto por precipitar el
Fe+2 del sulfato ferroso. Como esta reacción se da solo en medio ácido, un ennegrecimiento
del fondo del tubo se lee como fermentación de algunos de los azúcares del medio. Además
puede observarse la producción de gas, como burbujas en el fondo del tubo. Esta prueba se
siembra por el método por punción en un tubo que contiene agra TSI inclinado a partir de
colonias aisladas del microorganismo a ensayar, se incuba a 35 °C +/- 2 °C por 24 – 48 horas.
La interpretación de esta prueba se hace de la siguiente forma:
· Cambio de color en el medio de rojo a amarillo indica la fermentación de la glucosa
lactosa y sacarosa ( pico de flauta ácido/ profundidad ácida: A/A. Ej: Shigella
· Cambio de color en el tercio del medio (parte inferior), indica fermentación de la
glucosa, pero no de la lactosa ni sacarosa (pico de flauta alcalino/ profundidad
ácida: K/A).
· Cambio de color en dos tercios del agar (parte inferior y medio), indica la
fermentación de la glucosa y lactosa pero no de la sacarosa.
· Cambio de color pico de flauta ácido (amarillo) / profundidad ácida (amarillo) hay
fermentación de azúcares: glucosa, sacarosa y lactosa Ej: Escherichia coli
· Ningún cambio de color en el medio indica ausencia de la fermentación de los tres
azúcares (pico de flauta alcalino/ profundidad alcalina: K/K).
· Ruptura del agar o elevación del mismo separándose del fondo del tubo o
formación de espacios de aire indica formación de dióxido de carbono.
· Aparición de un precipitado negro indica producción de sulfuro de hidrógeno o
ácido sulfhídrico (y se adiciona en el resultado / H2S).
Para revelar el resultado de esta prueba es importante tener en cuenta el tiempo de incubación
ya que especies de Proteus vuelven alcalino el medio poco después de la inoculación y sus
resultados deben ser leídos en las primeras 2-6 horas, mientras que Citrobacter freundii y
Klebsiella pneumoniae tienen actividad ureasa dentro de las 24-48 horas de incubación.
Producción de hemolisinas: las hemolisinas son sustancias que dejan libre la hemoglobina
que contienen los glóbulos rojos sanguíneos. Se producen por varios tipos de bacterias como:
streptococcus sp y staphylococcus sp. Las hemolisinas pueden producir cambios visibles
cuando se cultivan las bacterias en placas con agar de sangre . esta prueba se realiza
sembrando el microorganismo en agar sangre por el método de agotamiento con el asa
bacteriológica (francés preferiblemente) y luego se incuban las placas a 35°C +/- 2°C por 24 –
48 horas y posteriormente se hace la lectura así:
- Hemólisis Alfa: presencia de un halo color verde alrededor de la colonia; esta hemólisis es
un tipo de hemólisis incompleta en la cual los glóbulos rojos que rodean las colonias son
parcialmente dañados, pero no lisados completamente. El enverdesimiento del medio se
produce debido a la salida de la célula de un derivado del tipo de la meta hemoglobina . que es
oxidado a compuestos del tipo de la biliverdina.
- Hemólisis Beta: en la cual las colonias del microorganismo aparecen el la placa de agar
sangre rodeadas de una zona clara, incolora en la cual los hematíes han experimentado lisis y
se ha reducido la hemoglobina (halo transparente) .
- Hemólisis Gamma: o ausencia de hemólisis, es éste tipo de hemólisis no hay daño de la
célula, es decir, no hay lisis total o parcial de los glóbulos rojos y por lo tanto no se producen
modificaciones en el medio en contacto con la colonia de la bacteria.
El tipo de hemólisis producido en agar sangre es útil para una identificación inicial de los
estreptococos. Sin embargo , las reacciones hemolíticas pueden sufrir variaciones
dependiendo del tipo de sangre usado. Estas variaciones son evidentes con los Streptococos
del grupo D.
Prueba de la lactosa Se usa para diferenciar entre las enterobacterias en general y el grupo
de las coliformes. Se trata por tanto de una prueba de gran importancia debido a que los
coliformes se utilizan como organismos indicadores de contaminación fecal en análisis, sobre
todo, de aguas. En bacteriología se define el grupo de organismos coliformes como los
"bacilos Gram negativos, aerobios y anaerobios facultativos, no formadores de esporas
y que fermentan la lactosa con formación de gas a 35ºC en 48 horas". No se trata de un
grupo taxonómico e incluye una gran variedad de bacterias, la mayoría de ellas de origen
intestinal.
Una manera sencilla de realizar la prueba de la fermentación de la lactosa en enterobacterias
es sembrar el microorganismo en agar McConkey, es un medio sólido, diferencial y selectivo,
frente a bacterias no entéricas, es diferencial ya que se usa para la discriminación de bacterias
con capacidad de fermentar la lactosa (Lac + y ‐).
En agar McConkey las bacterias Gram positivas ven inhibido su crecimiento debido a la
presencia de sales biliares y cristal violeta y sólo crecerán las enterobacterias, pero entre ellas
las que fermenten la lactosa (coliformes) liberarán productos ácidos que producirán un cambio
de pH que se detectará gracias al rojo neutro.
Resultados Las colonias lactosa (+) aparecerán de color rojo o violeta contrastando con la
coloración amarillenta de las colonias lactosa (-).
Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo dos
técnicas:
Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre, se debe
tener la precaución de no retirar algo de agar con el asa al retirar la colonia ya que los
eritrocitos del medio contienen catalasa y su presencia dará un falso resultado positivo.
Resultados Aparición de burbujas de O2
Procedimiento
1. Tomar con cuidado una colonia con el asa de siembra (evitar tomar agar) de la
placa de EMB (Enterobacteriaceae) y TCBS (Vibrionaceae)
2. Poner la colonia directamente sobre un portaobjetos sin añadir agua.
3. Echar sobre la colonia una gota de agua oxigenada pura o al 30 %.
4. Observar si se forman burbujas de oxígeno.
Resultado: La aparición de burbujas indica que el microorganismo es catalasa positivo.
· La no-aparición de burbujas es un indicador negativo rotundo.
Citocromo oxidasa: el sistema citocromo oxidasa esta constituido por hemoproteinas capaces
de catalizar la oxidación de un citocromo reducido por el oxigeno molecular. Las bacterias que
obtienen su energía por respiración y utilización de oxigeno molecular como aceptor final de
electrones, contienen diferentes sistemas citocromo oxidasa, en tanto que las bacterias
anaerobias obligadas no contienen tales sistemas. El ensayo de citocromo oxidasa permite
detectar la presencia del microorganismo de ciertas enzimas del sistema citocromo oxidasa ,
capaces de catalizar el transporte de electrones entre un dador presente en la bacteria y el
colorante redox tetrametil –p-fenilendiamina (color azul) o el diclorhidrato de dimetil-p-
fenilendiamina (color Rosado).
La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para
• Identificar todas las especies de Neisseria (+)
• Diferenciar Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las enterobacterias.
Procedimiento
Procedimiento
1. Tomar con el asa de siembra una colonia de la placa de EMB o TCBS (o bien hacer
una suspensión de una colonia en agua) y depositar en un porta.
2. Poner la colonia sospechosa sobre el porta con un asa y añadir una gota de sustrato
cromógeno fresco (10 mg/ml).
3. Esperar 20-60 segundos y observar si existe algún cambio en la coloración. Si se pone
azul es (+).
Para la prueba pueden emplearse diferentes medios como el agar SIM, KIA, o el TSI. El medio
de SIM es más sensible a esta prueba que el KIA presumiblemente debido a la falta de hidratos
de carbono para suprimir la formación de H2S y uso de hierro peptonizado como indicador, y
también por su consistencia semisólida. El menos eficaz es el TSI porque se cree que la
sacarosa suprime los mecanismos enzimáticos para la producción de H2S. De otra parte el
indicador más sensible para detectar la producción de este ácido es el acetato de plomo pero
debe manejarse con cuidado ya que suprime en algunos casos el crecimiento de
microorganismos exigentes nutricionalmente.
Para esta prueba se siembra por punción cualquiera de los medios seleccionados y se incuba a
35°C +/- 2°C por 24 horas. Pasado el tiempo de incubación se observa si hubo o no aparición
de un precipitado de color negro en la línea de punción o en el medio. Si hubo formación del
precipitado la prueba es positiva.
Reacción del rojo metilo: una de las características taxonómicas que se utilizan para
identificar los diferentes géneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporción de
productos de fermentación que se originan por la fermentación de la glucosa. Se conocen 2
tipos generales: la fermentación ácido-mixta y la fermentación del 2,3 butanodiol. En la
fermentación ácido-mixta se forman fundamentalmente ácido láctico, acético y succínico,
además de etanol, hidrógeno y dióxido de carbono. En la vía del butanodiol se forman
cantidades menores de ácido (acetato y succinato) y los principales productos son el
butanodiol, etanol, hidrógeno y CO2. El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo de
6.0 (amarillo) y 4.4 (rojo), que se utiliza para visualizar la producción de ácidos por la vía de
fermentación ácido mixta. Cuando se adiciona el rojo de metilo al caldo RM – VP después de
ser incubado a 35°C +/- 2°C por 24 horas con un inoculo grande, se observa la formación de
color rojo en caso de que el pH del medio haya bajado a 4,4 o menos como resultado de la
producción de ácidos, y se considera como una prueba positiva. Cuando el indicador no
cambia de color amarillo a rojo se considera una prueba negativa
• Reducción de nitratos: Esta prueba determina la capacidad que poseen algunas bacterias
de reducir el nitrato a nitrito gracias a la presencia de la enzima nitrato-reductasa que extrae
oxígeno al nitrato para formar el nitrito y otros productos de reducción como el agua. Casi todas
las especies de enterobacterias reducen los nitratos. Las enterobacterias son generalmente
nitratos (+). Esta prueba se utiliza principalmente para diferenciar entre sí determinadas
bacterias de los géneros Haemophylus y Neisseria
La presencia de nitritos en el medio se detecta adicionando el reactivo de griss (constituido por
alfa-naftilamina al 0.5% en ácido acético 5M y ácido sulfanilico al 0.8% en ácido acético 5M),
con la formación de un colorante de diazonio rojo, p-sulfobenceno-azo-alfa-naftilamina. Para el
procedimiento se inocula el medio caldo nitrato con un asa del microorganismo en estudio y se
incuba a 35°C + / - 2°C por 18 a 24 horas. Al terminar la incubación, se adiciona el reactivo de
griss y la aparición de un color rojo en los 30 segundos posteriores indica la presencia de
nitritos y representa una reacción positiva. Si no aparece color luego de agregado el reactivo,
esto puede indicar que lo nitratos no han sido reducidos o que han sido reducidos a otros
productos, como el amoniaco, nitrógeno molecular (denitrificación). Óxido nítrico u óxido nitroso
e hidroxilamina. Dado que los reactivos de prueba detectan solo los nitritos, este último proceso
llevaría a una lectura falso – negativa. Por lo tanto, es necesario agregar una pequeña cantidad
de polvo de zinc a todas las reacciones negativas. Los iones de zinc reducen los nitratos a
nitritos y la aparición de un color rojo después de adicionar el polvo de zinc indica la presencia
de nitratos residuales y confirma una reacción negativa verdadera.
Procedimiento
1. Inocular por picadura un tubo de medio semisólido con cada uno de los distintos
microorganismos aislados.
2. Incubar 24 horas a 37°C.
3. Observar la zona de crecimiento del microorganismo y si ha habido cambio en la
coloración del medio.
Escherichia + - + +
Shigella - - - +
Salmonella + - + +
Citrobacter + + + +
Klebsiella + - + +
Enterobacter + - + +
Serratia + - + +
Proteus + - + +
Yersinia - - - +
RESUMEN DE RESULTADOS
Oxidasa Aparición de color azul
Rojo de Metilo Aparición de color rojo
Ureasa Aparición de color rojo
Voges‐Proskauer Aparición de color rojo
PREGUNTAS
1. ¿En qué consiste la acción selectiva y diferencial de los medios de cultivo?
2. Haga una lista de 3 medios selectivos y 3 medios diferenciales, explicando para qué
grupo o grupos de microorganismos se empleen .
3. ¿Por qué las bacterias que son rojo metilo positivo rara vez son Voges – Proskauer
positivo?
4. ¿Por qué se omite la glucosa en la formulación de medios de cultivos de aislamiento
primarios como el Agar EMB o el Agar MacConkey? ¿Qué pasaría si no se omitiera
este carbohidrato en estos medios?.
PROCEDIMIENTO
- Escherichia
- Enterobacter
- Klebsiella
- Citrobacter
Material
- Agua problema.
- Tubos de ensayo con medio de cultivo apropiado y campana Durham
- Pipetas estériles de 1 ml
Medio de cultivo
Caldo lactosado biliado verde brillante (BGBL)
Técnica
1. Se preparan tres series de tres tubos cada una que contienen 10 ml de BGBL
adicionados con una campana Durham para recogida de gases.
2. A partir Se realizan diluciones seriadas 10-1, 10-2 y 10-3 de la muestra problema.
3. Añadir en cada uno de los tres tubos de la primera serie 1 ml de la dilución 1/10
4. En cada uno de los tubos de la segunda serie 1 ml de la dilución 1/100
5. En cada uno de los tubos de la tercera serie 1 ml de la dilución 1/1000
6. Incubar las tres series a 31ºC, haciendo lecturas a las 24 y 48 horas.
Con el número de tubos positivos de cada serie, se recurre a la Tabla del Número Más
Probable (NMP), donde se obtendrá el recuento por gramo o mililitro de muestra.
Material
- Tubos de ensayo con BGBL adicionado de campana Durham
- Placas Petri con agar EMB de Levine
- Tubos con agua de Triptona (TW)
- Tubos con Medio de Clark y Lubs (MR-VP)
- Tubos con agar citrato de Simmons
- Tubos con agar Kliger
Técnica
Se parte de los resultados obtenidos en la investigación de las Enterobacterias lactosa-
positivas.
• Con asa de siembra se subcultivan todos los tubos positivos (con gas) que se hayan
detectado en la determinación anterior, sobre Agar EMB de Levine empleando el
método de los tres giros, con el fin de obtener colonias aisladas tras su incubación a
37ºC, y con lecturas a las 24 y 48 horas. Realizar un Gram para confirmar
morfología y coloración.
Prueba del Indol: A partir de una colonia aislada en el medio EMB, sembrar con el asa de
platino un tubo de agua de peptona. Incubar y leer a las 24 horas a 37ºC.
Prueba del Rojo de metilo: A partir de una colonia aislada en el medio EMB, sembrar con el
asa de platino un tubo de medio Clark y Lubs. Incubar a 37ºC leyendo el resultado después de
1 a 4 días.
Prueba de Voges-Proskauer: A partir de una colonia aislada en el medio EMB, sembrar con el
asa de platino un tubo de medio Clark y Lubs. Incubar a 37ºC leyendo el resultado después de
1 a 4 días.
Prueba del citrato A partir de una colonia aislada en el medio EMB, sembrar con el asa de
platino un tubo de Agar Citrato de Simmons por el método de estrias sobre su superficie.
Incubar a 37ºC durante 24 horas.
Siembra del medio de Kliger A partir de una colonia aislada en el medio EMB, sembrar con el
asa de platino un tubo de medio de Kliger por estrias la superficie y por picadura central hasta
el fondo del tubo. Incubar a 37ºC durante 24 horas.
Lecturas
- Las colonias de E. coli en el medio EMB miden de 2-3 mm, son planas o ligeramente
cóncavas, con centros oscuros o casi negros (violeta). Con luz reflejada, se observa un
brillo metálico verdoso característico, aunque a veces puede no manifestarse. Medio de
cultivo selectivo y diferencial para gérmenes Gram negativos debido a la presencia de
eosina y azul de metileno que inhiben a los gérmenes Gram positivos. Lleva lactosa en su
composición y un indicador de pH que hace que podamos identificar los microorganismos
que fermentan dicho azúcar de los que no lo hacen.
- Añadir 1 ml del reactivo de Kovac´s al tubo del indol, agitar, dejar reposar. Aparición de
anillo rojo: reacción positiva, aparición de anillo amarillo: reacción negativa. Producción de
indol a partir del agua de peptona (triptófano).
- Añadir 2 gotas del reactivo rojo de metilo a uno de los tubos con medio Clark y Lubs.
Aparición de color rojo en el tubo: reacción positiva, aparición de color amarillo: reacción
negativa. Producción de ácido a partir de la glucosa (F. Ácido-mixta)
- Añadir 0.5 ml de KOH al 40% y 0.5 ml de alfa-naftol al otro tubo restante de medio de Clark
y Lubs. Aparición de color rojo: reacción positiva, aparición de color amarillo: reacción
negativa. Producción de acetil-metil-carbinol a partir de la glucosa (F. Butilén-glicólica).
- Observar el tubo de citrato de Simmons: crecimiento en superficie y color azul: reacción
positiva, sin crecimiento y color verde: reacción negativa. Utilización del citrato como única
fuente de carbono.
- Leer los resultados de la utilización de azúcares en el medio de Kliger tanto en superficie
como en profundidad. Utilización de glucosa, lactosa, producción de SH2 y gas por los
microorganismos en aerobiosis y anaerobiosis.
Actividades
1. Explique si las colonias observadas provienen de grupos de bacterias o de una sola
célula .
2. Características generales de coliformes y su importancia como indicadores
3. ¿Cuál es el fundamento de los diferentes medios empleados en la práctica y como es
el desarrollo típico de los coliformes en cada uno de ellos?
Material y equipo.
Autoclave. Licuadora.
Balanza granataria. Incubadora con termostato.
Utensilios estériles (cuchillos, pinzas, espátulas)
Pipetas bacteriológicas estériles de 10 y 1 ml.
1 tubo de 16x150 mm con tapa de rosca. Matraces de vidrio de 500 ml.
Cajas petri. Asa de platino
Portaobjetos desengrasados. Microscopio óptico.
Medios de cultivo y reactivos. Peptona.
Agar xilosa lisina desoxicolato XLD. Agar nutritivo.
Caldo urea. Agar sulfuro indol movilidad
Caldo Rapapport Vassiliadis NaCl
Agar verde brillante BGA. Agar triple azúcar hierro TSI.
Agar citrato de Simmons. Agar lisina descarboxilasa LIA
Procedimiento.
1.-Peenriquecimiento.
Transferir asépticamente 25 ml o 25 g de la muestra a un matraz con 225 ml de agua
peptonada. Licuar si fuera necesario durante un minuto. Incubar a 35°C durante 24 h.
2,-Enriquecimiento.
Transferir 0.1 ml del cultivo anterior a un tubo con 9.9 ml de caldo Rapapport Vassiliadis.
Incubar 24 h a 42°C.
3.-Aislamiento.
Sembrar por estría simple 2 placas de agar XLD y BGA. Incubar 24 h a 37°C.
4.-Identificacion bioquímica.
Seleccionar al menos dos colonias típicas sospechosas que se encuentren bien aisladas de
cada placa. Transferir con un asa de cada colonia seleccionada a la siguiente serie de tubos
que contienen los siguientes medios:
a) Agar TSI Sembrar por picadura en el fondo y por estría en la superficie.
b) Agar LIA. Sembrar por picadura en el fondo y por estría en la
c) Agar citrato de Simmons. Sembrar por picadura en el fondo y por estría en la
superficie.
d) Caldo urea. Inocular el caldo.
Incubar los tubos de pruebas bioquímicas a 35°C por 24h. Comprobar los resultados de las
pruebas bioquímicas con la tabla de resultados de los microorganismos enteropatógenos.
Actividades
1. ¿Cuál es el fundamentos de los diferentes medios empleados en la practica indicando cuáles
son los inhibidores y cómo es el desarrollo típico de Salmonella en cada uno de ellos?
2. ¿Por qué es importante detectar la presencia de Salmonella spp. en los alimentos?
3. ¿Indique las características generales de Salmonella?
4. ¿Qué condiciones promueven el crecimiento de Salmonella en alimentos y que puede
hacerse para retardar su crecimiento?
5. Mencione otras enfermedades causadas por la ingestión de alimentos contaminados por
microorganismos.