Ingeniería Ambiental

Microbiología
Profesor:
M.I. Jesús Miguel Castro Montoya
Pracrica 2: Clasificación, diseño,
preparación y esterilización de
medios de cultivo
Entrega: 21/02/23
Alumno:

Identificación presuntiva de bacterias por su morfología colonial y

características microscópicas
Competencia general
Realiza adecuadamente la identificación presuntiva de algunas bacterias mediante criterios morfológicos
macroscópicos y microscópicos.
Competencias específicas
 Identifica y describe correctamente las características morfológicas de las colonias bacterianas, con base a
criterios establecidos.
 Elabora preparaciones en fresco y permanentes utilizando técnicas de tinción simple, diferencial, selectiva y
negativa.
 Distingue entre bacterias Gram positivas y Gram negativas, así como distintas estructuras bacterianas
manipulando adecuadamente el microscopio óptico.
Competencias transversales
 Sigue instrucciones y procedimientos de manera reflexiva, comprendiendo como cada uno de sus
pasos contribuye al alcance de un objetivo.
 Desarrolla habilidades de búsqueda, procesamiento y análisis de información procedente de fuentes diversas
y la organiza de forma oral y escrita.
Actitudes y valores
 Asume compromisos con responsabilidad al colaborar en equipo de aprendizaje para la consecución de
objetivos comunes.
 Respeta el trabajo de los demás y las normas de bioseguridad del laboratorio.
Antecedentes teóricos
Cuando se cultivan las bacterias sobre medios de cultivo sólidos, las células aisladas se multiplican
sucesivamente hasta dar un crecimiento visible conocido con el nombre de colonias, las características de estas,
tales como el tamaño, pigmentación, forma, borde, elevación, superficie, apariencia general, se usan en la
identificación de las especies. Una de las características más importante de las bacterias, es su morfología,
definida por el su arreglo y estructura. Existen bacterias en forma redondeada (cocos), en forma cilíndrica
(bacilos) y en forma de espirales (espirilos) y a su vez, cada categoría se clasifica con base a diferentes
arreglos. Las principales dificultades en la observación y estudio de los microorganismos, son su reducido
tamaño y su transparencia a la luz visible, por tanto, la observación y estudio de su morfología y algunas de sus
estructuras, requiere, además del microscopio, llevar a cabo preparaciones las cuales pueden realizarse en
fresco, o bien fijas y teñidas. La preparación fresca solo se usa durante la observación y se desecha; en tanto
que una preparación permanente dura por largos periodos de tiempo, gracias a que se utiliza, para su montaje,
un agente como el bálsamo de Canadá, que permite que el cubreobjetos permanezca adherido al portaobjetos.
La forma más sencilla de preparar un microorganismo para su examen microscópico, es hacer una preparación
en fresco, la cual puede realizarse mediante una preparación en fresco simple o mediante una preparación en
gota pendiente. Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos en su estado
natural; el inconveniente es que no permite aumentar el contraste, por la escasa diferencia entre los índices de
refracción del medio y de los microorganismos. Para aumentar el contraste de las células sin afectar su
viabilidad, en las preparaciones en fresco, suele agregárseles colorantes muy diluidos como el cristal violeta.
Otra forma de examinar un microorganismo al microscópico, es mediante una preparación fija y teñida, que
consiste en extender la muestra sobre un portaobjetos, en una capa muy delgada que permita el paso de la luz.
Este extendido llamado “frotis” puede hacerse suspendiendo el desarrollo microbiano en una pequeña gota de
agua mediante el asa y distribuyéndolo en el portaobjetos; colocando en el portaobjetos una gota de crecimiento
microbiano; utilizando hisopo o cinta adhesiva; o bien por impronta, presionando el portaobjetos sobre
muestra. Una vez realizado el frotis, sigue el proceso de fijación, que tiene por objeto adherir la muestra al
portaobjetos y coagular el protoplasma antes de teñir la célula, desnaturalizando las proteínas para facilitar la
acción del colorante. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más usual, aunque también puede fijarse con
sustancias químicas como formaldehido, ácidos, alcoholes o sales metálicas. Después de la fijación le sigue el
proceso de tinción que puede ser positiva (cuando se colorea directamente a los microorganismos o a las
estructuras en estudio; utilizan colorantes) o negativa (cuando se oscurece el fondo de la preparación y se
observa sólo la silueta incolora de los microorganismos). La fijación produce el encogimiento de las células; la
tinción, por el contrario, hace que las células aparezcan mayores de lo que son realmente. Algunas tinciones
requieren la utilización de sustancias químicas denominadas mordientes, como el ácido fénico, ácido tánico y
lugol., que actúan como sustancia puente entre el colorante y la estructura a teñir, permitiendo su
coloración; en otros casos, altera su estructura celular, permitiendo su tinción.
Los colorantes aumentan el contraste y se clasifican como naturales o sintéticos, estos últimos son más
utilizados y tienen afinidad específica por los materiales celulares. Algunos colorantes son cationes (por
ejemplo, azul de metileno, cristal violeta y safranina) que se combinan con los constituyentes celulares cargados
negativamente, como los ácidos nucleicos. Otros colorantes son aniones (por ejemplo, eosina, fucsina ácida y l
rojo Congo) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente como muchas proteínas.
Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles como el negro Sudán, que se combinan con los materiales
lipídicos de la célula. Las tinciones pueden clasificarse en simples, diferenciales y selectivas. La tinción simple
es aquella en la que sólo se utiliza un colorante de tipo básico como la safranina, cristal violeta o azul de
metileno para incrementar el contraste. La tinción diferencial es la que emplea secuencialmente dos o más
colorantes que permiten distinguir tipos de microorganismos en función de diferencias en su estructura y
composición química, por ejemplo la tinción de Gram basada en las propiedades de la pared celular bacteriana.
La tinción selectiva se utiliza para identificar determinadas estructuras, en estas tinciones se colorea
únicamente una parte de la célula. Entre las más usadas están la tinción de esporas de Wirtz-Conklin, la de
flagelos de Leifson, la tinción negativa para cápsulas bacterianas y la tinción de núcleo de Feulgen.

Materiales Equipo
 Bitácora de laboratorio  Cámara fotográfica
 Mecheros Fisher  Gabinete de bioseguridad
 Cronómetro  Microscopio óptico
 Gradilla para tubos  Refrigerador
 Portaobjetos y cubreobjetos  Balanza analítica
 Asa de siembra  Autoclave
 Varilla para coloración
 Pinzas portaobjetos
 Probeta de 100 ml
 Pipetas graduadas de 1 ml
 Dispensadores para pipetas
 Espátulas
 Piseta
 Frascos goteros
 Aplicadores de madera
 Marcador indeleble
 Cubreboca y guantes de latex estériles
 Algodón
 Parafilm
 Papel seda
 Papel secante
 Papel metálico
 Aceite de inmersión
 Bálsamo de Canadá
 Alcohol etílico absoluto y de 96º
 Solución de fenol al 5% o de benzal al 10%
 Solución de cristal violeta
 Solución de lugol
 Solución alcohol-acetona (3:1)
 Solución ácido-alcohol (3% HCl en alcohol 96º)
 Solución safranina al 0,5%
 Solución fuscina fenicada
 Solución nigrosina al 10% o tinta china
 Solución verde de malaquita al 5%
 Solución de azul de metileno de Loeffler
 Solución de extrán al 5%
 Xilol
 Agua destilada
 Material biológico: cultivos en medio líquido y sólido
de E. coli, Sacharomyces cerevisiae, Bacillus
subtilis, B. thuringiensis y Klebsiella sp.
Procedimiento
Fundamento
Las características macroscópicas de las colonias bacterianas, pueden ser diferentes si los microorganismos
crecen en diferentes medios de cultivo.
1. Observación macroscópica del desarrollo bacteriano en un medio de cultivo agarizado
 Inicie desinfectando el área de trabajo con una solución de fenol al 5% o de benzal al 10%.
 A partir del cultivo bacteriano en placa de Petri, obtenido en la práctica anterior, observe y describa las
colonias.
 Utilizando algunos criterios morfológicos como tales como el tamaño (grande 5 mm, mediana 2-3 mm o
pequeña 1-2 mm); aspecto (mucosa, seca, opaca, brillante o transparente) y el color de la colonia en un
medio específico.
 Utilice también los criterios que se marcan en el dibujo que se muestra a continuación.

2. Observación macroscópica del crecimiento

bacteriano en cultivos líquidos
 A partir del cultivo en medio líquido obtenido en la
práctica anterior, observe y describa el desarrollo
bacteriano utilizando los siguientes criterios:
 Turbidez uniforme
 Formación de película
 Sedimento
3. Observación de características microscópicas
Preparación en fresco
 Anote en un extremo del portaobjetos, el contenido de la
preparación, la fecha y su nombre.
 Tome una asada del cultivo líquido de microorganismos obtenido en la práctica anterior y deposítela
directamente sobre la superficie de un portaobjetos. Deposite suavemente un cubreobjetos sobre la superficie
de la muestra. Observe con el objetivo de menor aumento (10X) y luego con el de mayor (40X) aumento.
 Elabore esquemas de lo observado.
Preparación de frotis
 Rotule el portaobjetos que utilice para hacer el frotis como en el caso anterior. Coloque una pequeña gota de
agua destilada en el centro de un portaobjetos limpio. Flamee el asa de siembra hasta el rojo vivo, deje enfriar
el asa y tome en condiciones asépticas, una pequeña cantidad del cultivo bacteriano en medio sólido, que le
fue asignado y transfiéralo a la gota de agua que se encuentra en el portaobjetos. Remueva la mezcla con el
asa hasta formar una suspensión homogénea que quede extendida en una capa muy delgada.
 Si la muestra se toma de un cultivo en medio líquido, no es necesario realizar los dos primeros pasos ya que
basta con colocar y extender una gota de la suspensión de microorganismos, directamente sobre el
portaobjetos.

Fijación de muestras
 Una vez preparado el frotis, pase el portaobjetos de 3-5 vedes por la periferia de la llama dejando enfriar el
portaobjetos entre cada pase.
 En caso de utilizar metanol (para bacterias
procedentes de medio líquido), añada unas gotas de
metanol sobre la extensión completamente seca.
Golpee el portaobjetos por su canto con cuidado
contra la mesa de trabajo para retirar de inmediato el
exceso de metanol. Espere a que el metanol se
evapore completamente.
 Una vez realizado el frotis y haber realizado la
fijación, continúe con el proceso de tinción.
3.4. Tinción de los frotis o preparaciones
 Realice las diferentes tinciones siguiendo el
procedimiento general para tinciones que se muestra
a continuación:

Tinción simple
Fundamento
La tinción simple se basa en la utilización de un sólo colorante tal como el azul de metileno, para la observación
al microscopio.
Procedimiento
 Una vez que haya preparado y fijado el frotis, colóquelo sobre la varilla de coloración y cubra la preparación
con azul de metileno durante 1 - 2 minutos. Lave la preparación con agua de grifo para eliminar el colorante,
inclinando el portaobjetos y aplicando el chorro de agua en su parte superior de manera que resbale sobre el
frotis, pero sin que vaya dirigido directamente sobre él, pues podría arrastrar parte del frotis consigo. Elimine
 la máxima cantidad de agua de los portaobjetos golpeándolos por su canto con cuidado contra la superficie de
la mesa de trabajo.
 Seque al aire y coloque la preparación al microscopio añadiendo sobre la misma, una gota de aceite de
inmersión. Observe al microscopio con el objetivo de inmersión (100X).
Tinción diferencial de Gram
Fundamento
El cristal violeta penetra la pared celular tanto de bacterias Grampositivas como Gramnegativas; el lugol actúa
como mordiente formando un complejo con el cristal violeta. Al decolorar con una mezcla de alcohol y acetona, la
pared de las Grampositivas, formada por una gruesa capa de peptidoglucano, impide la salida del complejo
cristal violeta-lugol, manteniéndose la coloración violeta. En las Gramnegativos por el contrario, el complejo
cristal violeta-lugol sale por los poros que ha generado el alcohol-acetona en la membrana externa de la pared
celular. La bacteria por lo tanto se decolora y al agregar la safranina se tiñe de rojo.
Procedimiento
 Una vez que haya preparado y fijado el frotis, colóquelo sobre la varilla de coloración y cúbralo con cristal
violeta durante 2 minutos. Retire el cristal violeta NO LAVE CON AGUA.
 Añada inmediatamente lugol durante 1 minuto.
 Decolore con alcohol-acetona 20 segundos.
 Escurra y tiña con safranina durante 30 segundos.
 Lave con bastante agua el exceso de colorante.
 Seque la preparación al aire y observe al microscopio con el objetivo de inmersión.
 En el apartado de observaciones, de esta práctica,
haga esquemas de lo observado y concluya sobre lo
mismo.

Tinción selectiva para esporas (Wirtz-Conklin)

Fundamento
Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas
que las hacen resistentes a los factores ambientales
adversos, estas cubiertas hacen que las esporas
aparezcan en el microscopio óptico como estructuras
refringentes. Las esporas no pierden el colorante verde
de malaquita en el lavado, en tanto que las formas
vegetativas si, quedando teñidas con el colorante de
contraste.
Procedimiento
 Prepare un frotis a partir de Bacillus subtilis y otro de
Bacillus thuringiensis y colóquelos sobre una varilla
de coloración.
 Cubra la preparación con verde de malaquita y caliente a emisión de vapores durante 1 minuto, utilizando
unas pinzas y algodón humedecido con alcohol. EVITE que el colorante hierva y que la muestra se seque,
añada más colorante si este se evapora.
 Lave con abundante agua el exceso de colorante. Agregue safranina como colorante de contraste, durante 1
minuto y después de este tiempo, lave con abundante agua el exceso de colorante.
 Seque la preparación al aire y observe al microscopio con el objetivo de inmersión.
 Anote la morfología y disposición de las endosporas de las dos especies de Bacillus.
 En el apartado de observaciones, de esta práctica, haga esquemas de lo observado y concluya sobre lo
mismo. La posición y la morfología de la endospora en el interior de la bacteria constituyen un carácter
taxonómico útil para diferenciar especies dentro de un mismo género.
Tinción negativa para observación de cápsulas
Fundamento
Las partículas del colorante no pueden penetrar a la cápsula, que se observa como una zona clara y
transparente, alrededor de la célula, que aparece refráctil sobre un fondo oscuro.
Procedimiento
 Coloque una asada de nigrosina al 10% o tinta china en un portaobjetos y mezcle con una asada del cultivo
líquido de Klebsiella sp o de Sacharomyces cerevisiae
 Tome un portaobjetos y con éste, distribuya suavemente la mezcla sobre toda la superficie del portaobjetos,
un hasta obtener una capa fina del material que se va a observar.
 Haga la observación de la muestra con objetivo de 40X o con objetivo de inmersión, utilizando en este caso,

 una gota de aceite de inmersión.
 En el apartado de observaciones, de esta práctica, haga esquemas de lo observado y concluya sobre lo
mismo.
4. Preparación de muestras permanentes
 Anote en un extremo del portaobjetos, el contenido de la preparación, la fecha y su nombre.
 Realice un frotis de la muestra.
 Proceda a realizar la deshidratación de la muestra utilizando una serie de concentraciones de etanol hasta
llegar al absoluto (80%, 90%, 95%, 100%). Preparare cuatro placas de Petri con su correspondiente
concentración de etanol y vaya sumergiendo la muestra entre 10 y 15 minutos en cada una de las
concentraciones, con el objetivo de que la preparación quede totalmente deshidratada.
 Seque el portaobjetos al aire y monte la preparación empleando un agente montante como bálsamo de
Canadá, medio de montaje hidrofóbico constituido por sustancias no miscibles en el agua.
 Una vez montada la muestra, coloque un cubreobjetos y observe al microscopio.
5. Recomendaciones generales
 Después de observar las preparaciones, es necesario sumergir los portaobjetos en una solución sanitizante
durante 10 minutos, lavar con detergente, enjuagarlos y conservarlos en un frasco con alcohol al 95%.
Observaciones y resultados
Se pudo observar bajo microscopio que se presentaron microrganismo gran negativos siendo el único
microorganismo negativo en las practicas realizadas en el laboratorio

Conclusiones
Seguridad e higiene
 Se siguen los procedimientos de bioseguridad e higiene indicados en el reglamento interno del Laboratorio.
 Al finalizar el experimento, se realiza un proceso de limpieza de material y equipo utilizado, siguiendo las
recomendaciones generales para tal fin.
 Tanto los residuos como los desechos biológicos reciben el tratamiento adecuado para evitar contaminación.
Evaluación
 La evaluación es sistemática con una planeación flexible y criterios definidos. Continua a través de la
observación de los desempeños en los aspectos puntuales relacionados con el trabajo de laboratorio;
formativa y sumativa, considerando que los desempeños logrados abonan a la competencia general del
curso.
 Se centra en recabar evidencias (de conocimiento, producto, desempeño y actitud), de los aprendizajes de
los alumnos, para lograr el desarrollo de las competencias propuestas para esta actividad.
 Se evalúa el reporte de la práctica realizada, trabajo en equipo, valores y actitudes, considerando los criterios
establecidos en las rúbricas diseñadas para cada actividad.
1. ¿Qué características debe tener un colorante para ser empleado en una tinción negativa?
Que las bacterias gram negativas se tiñen de rojo (rojo, anaranjado o rosado).
Colorantes
Fucsina fenicada. Da un color rojizo a las bacterias AAR.
Azul de metileno. Da un color azulado al resto de bacterias que no son AAR.
Tinción negativa
Se usa para detectar las cápsulas que aparecen en algunas bacterias, así que entra en el grupo de las
tinciones selectivas. La tinción negativa se puede usar para el microscopio óptico o para el microscopio
electrónico.

2. ¿En qué consiste una tinción diferencial y para qué se emplea?

Son aquellas tinciones que se usan para diferenciar de manera mas explicita los
microorganismos. Estas tinciones utilizan los colorantes diferenciales, que se componen de más
 de una sustancia tintórea.

3. ¿Qué sucede si a un cultivo envejecido de Bacillus sp. se le realiza una tinción de Gram?
4. un cultivo envejecido de una bacteria G+ puede fácilmente dar lugar a una reacción G-, debido a
encontrarse ya las células .en periodo de autolisis .

5. ¿Podría utilizar un colorante básico como primer colorante en la tinción de esporas?

El verde de malaquita es un colorante débilmente básico (tiene una carga positiva débil) y por
tanto, se une débilmente a la bacteria. Penetra en las células vegetativa . Cuando se calienta
la preparación también penetra las endosporas

6. ¿Cómo se observarán las bacterias después de la tinción de Gram, si se olvida realizar el paso de
decoloración?
Las bacterias que resisten la decoloración (BAAR) aparecerán teñidas de color rosa,
completamente saturadas con la fucsina
7. ¿Qué sucederá si no se calienta el colorante en la tinción de esporas?
Solo se puede teñir el contenido de la espora alterando su envuelta.

8. ¿La disposición de las endosporas en las dos especies de Bacillus, es la misma?

Las endósporas son formas de supervivencia de ciertas bacterias, constituidas por células durmientes
deshidratadas y recubiertas por capas protectoras, que muestran una resistencia extrema al estrés físico y
químico. Son capaces de perdurar por tiempo indefinido en ausencia de nutrientes. Se forman en el interior
de las bacterias.
9. ¿Qué importancia tiene la presencia de la cápsula en las bacterias?
Protegen a las bacterias de la fagocitosis
Participa en la adherencia bacteriana
Protegen a la bacteria frente a distintos agentes nocivos
Protege a las bacterias frente a la desecación
Bibliografía
Harvey R. A.; Champe, Pamela C. y Fischer, Bruce D. 2008. Microbiología. Liippincott Williams & Wilkins Wolters
Kluwer Health. Agapea.
Madigan, M.T., Martinko, J.M., Dunlap, P. V. y Clark, D.P. 2009. Brock Biología de los microorganismos.
12ª edición. Editorial Pearson.
Tortora, Gerard J. Funke, Berdell y Case, C.L. 2007.Introducción a la Microbiología. 9ª ed.Editorial Panamericana