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UNIVERSIDAD PRIVADA NOBERT WIENER ESCUELA TECNOLOGIA MDICA LABORATORIO CLINICO Y ANATOMIA PATOLOGICA

CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

MONOGRAFIA PARA LA ASIGNATURA DE MICROBIOLOGIA

BALLARTA RADO CARMEN. ACHULLA CCOYLLO ALFREDO. ALBERCA SANCHEZ KRISIA. MENESES LAZN ALEJANDRO. BAUTISTA HERRERA ROBERTO.

LIMA 2012

CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

DEDICATORIA: Este trabajo est dedicado en primer lugar a Dios por darnos tanta sabidura y regocijo en todo este tiempo, a nuestros queridos padres, que son el ejemplo de lucha y sacrificio, por lo cual daramos todo por ellos

INDICE GENERAL:

ndice general...4 ndice de tablas5 ntroduccin..6 Medios de cultivo: conceptos generales y consideraciones.7 Control de calidad de los medios de cultivo y consideraciones...9 Cepas Control.16 Lectura e interpretacin de los resultados....18 Control de calidad de reactivos...30 Anexos.42

INDICE DE TABLAS

Tabla 1: Procedimiento control de calidad interno analitos cualitativos del rea de bacteriologa........21-29

Tabla 2: Frecuencia de control de los reactivos utilizados con mayor frecuencia en Microbiologa.....33-34

INTRODUCCION: Los medios de cultivo juegan un papel fundamental en cualquier laboratorio de microbiologa. Ellos son ampliamente utilizados para el aislamiento, identificacin en ciertas clases de patologa, pues esto es fundamental para el xito del control de calidad del laboratorio de microbiologa La mayora de los laboratorios suelen preparar sus propios medios,para asegurar que los medios de comunicacin sea de buena calidad y capaz de dar resultados satisfactorios, es indispensable presentar ciertos parmetros de los cuales deben ser cuidadosamente controlados, por eso se debe poner en prctica una serie de acciones que le permitan asegurar una adecuada prctica en el aislamiento, identificacin y caracterizacin de agentes etiolgicos Actualmente el control de calidad forma parte de un programa referente a esta temtica. La calidad incluye calidad total, mejoramiento de la calidad y aseguramiento de la misma, pues en debe ser incluido un Manual de

Procedimientos, una validacin de metodologas y equipos, el desarrollo de ciclos de educacin continua, procesos de bio seguridad y supervisin sobre los reportes generados en el trabajo diario. En este sentido, se debe hacer nfasis en la correcta valoracin de las pruebas de laboratorio. Por ltimo, para que un plan de control de la calidad funcione y para que se logre el objetivo de obtener una mejora continua en la calidad de los servicios brindados por el laboratorio, se debe llegar a la conclusin de que esto tiene que ser un compromiso de todos, desde las autoridades ms altas, hasta los trabajadores con menos responsabilidades La finalidad de esta monografa es conocer y proporcionales informacin acerca de los parmetros a tener en cuenta y las pruebas que se deben realizar para garantizar la calidad de los medios de cultivo y de los reactivos que sern

utilizados en todas las prcticas de laboratorio.

I.

MEDIOS DE CULTIVO: Los medios de cultivo, son necesarios para el aislamiento, la reproduccin y la identificacin de los microorganismos. Estos permiten la existencia de los microorganismos gracias a que poseen sustancias nutritivas, un pH adecuado para el crecimiento de las bacterias y el desarrollo de sus caractersticas , las cuales nos dan la facilidad de diferenciarlas, para lo cual el medio tambin debe estar estril, pues de no ser as, el crecimiento de cepas no correspondientes a la obtenida en la muestra confundir la identificacin del agente por identificar. Son necesarios para el aislamiento, mantenimiento, la reproduccin y la identificacin de los microorganismos. Los medios de cultivo tambin requieren tiempos, temperaturas y atmosferas de incubacin, las cuales permitirn el crecimiento del organismo, dependiendo del tipo de metabolismo que posee; como por ejemplo, una bacteria aerobia o anaerobia en un ambiente con CO2.

Clasificacin de medios de cultivo.

Los medios de cultivo poseen caractersticas que los clasifican en los siguientes criterios:

1. Segn su estado fsico: 1.1. Lquidos. 1.2. Semislidos. 1.3. Slidos.

2. Segn su finalidad en microbiologa:

2.1. No selectivos: contienen suficientes nutrientes como para soportar el crecimiento de gran variedad de microorganismos.

2.2. Selectivos: permiten el crecimiento de slo un tipo de microrganismo.

2.3. Enriquecido: son medios no selectivos que se le agrega sustancias como ser sangre, suero, albmina, etc... Para microorganismos exigentes.

2.4. Diferenciales: son medios de cultivo que permiten establecer diferencias entre diferentes tipos microorganismos.

Los requerimientos de los medios de cultivo (es decir, los nutrientes que lo componen, su consistencia fsica, la temperatura a la que se incuba o a la que se desnaturalizan los nutrientes, el pH con el que cuenta) son relativos a la muestra que se analiza y a los microorganismos que se esperan detectar. Los medios de cultivo pueden prepararse directamente de sustancias que contengan los nutrientes como la sangre de carnero, o a partir de polvos deshidratados comerciales, como el SIM, a la vez pueden ser adquiridos como medios preparados listos para su utilizacin.

II.

CONTROL DE CALIDAD.

Definicin. Son las tcnicas operativas, que facilitan la realizacin de un monitoreo diario de los procedimientos practicados en el laboratorio, lo que permite detectar errores en la ejecucin de una tcnica e identificar problemas que se presentan. Un programa de control de calidad debe incluir un Manual de Procedimientos, una validacin de metodologas y equipos, el desarrollo de ciclos de educacin continua, procesos de bioseguridad y supervisin sobre los reportes generados en el trabajo diario. Indicaciones generales.

Mantener todas las muestras (procesadas y rechazadas) a temperatura ambiente, refrigeradas o congeladas, segn los protocolos, durante un tiempo que garantice que un problema en el procesamiento

Durante todo el proceso de transporte

tienen que mantenerse las

condiciones de conservacin de la muestra. No se puede exceder el tiempo mximo establecidohasta su recepcin en el Servicio de Microbiologa

Se debe mantener un registro de cada frasco: nombre del producto, de la casa proveedora, fecha de recibo, fecha de expiracin, nmero de lote y fecha en que se abri el frasco

Las pruebas bsicas de control de calidad de los medios preparados deben incluir: medicin del pH, pruebas de esterilidad, capacidad de crecimiento y reaccin, aspecto, dureza

Cada lote preparado de medio de cultivo se debe probar antes de su uso rutinario, mediante la inoculacin de microorganismos cuyo

comportamiento se conoce, tanto para reacciones positivas, como negativas. Para esto pueden utilizarse cepas bacterianas control de la ATCC (American Type Culture Collection)

Todas las fases del proceso han de estar perfectamente documentadas y debe mantenerse un registro detallado de todas las operaciones realizadas. Se anotarn todos los controles realizados, los resultados.

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A. .. Control de los Medios de Cultivo preparados por casas comerciales 1.- Se recomienda que provengan de empresas certificadas segn ISO19011, debiendo asegurarse el laboratorio del certificado y de que la certificacin cumple todas las operaciones relevantes, incluyendo la de suministro y entrega. 2. Los lotes de medios deben estar debidamente identificados. 3.- Los manufacturadores deben aportar, con cada lote suministrado, una evidencia del cumplimiento de las especificacines de calidad que incluya: N de lote Fecha de caducidad del producto Condiciones de conservacin Control de esterilidad y criterios de aceptabilidad Control de crecimiento e inhibicin con cepas seleccionadas para el uso del medio ycriterios de aceptabilidad indicando las cepas utilizadas Fecha de la emisin de la especificacin

4. Se guardar la especificacin enviada por el fabricante para cada lote de medio. 5. Comprobar las caractersticas fsicas (color, precipitados, placas rotas, excesivo n de burbujas, colonias crecidas etc...) de todos los lotes cuando se reciben. 6. Siempre que el fabricante aporte las especificaciones de calidad adecuadas, por su escasa frecuencia de fallos, el usuario no necesitan repetir el control del adecuado funcionamiento, de los siguientes medios: Agar sangre (no selectivo) Agar sangre colistina nalidxico Agar alcohol fenil etlico Agar chocolate Agar CIN Agar CLED
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Agar CYE/BCYE Caldo Selenito o caldo GN Agar Levine o Agar EMB Agar Hektoen Agar XLD Agar MacConkey

Agar Manitol sal Agar Sabouraud dextrose Agar Salmonella- Shigella (SS) Agar selectivos para Enterococo

Caldo BHI o TSB Caldo Thioglycolato Lowestein Mildebrook Jensen y

7.- Por la razn contraria, el usuario debe repetir el control como si fueran medios preparados en el laboratorio de: todos los medios no citados en la lista anterior los medios selectivos de Neisseria spp patgenas los medios de Campylobacter cualquier medio de los listados que demuestren alguna deficiencia en la recepcin o durante su uso hasta que el problema quede resuelto. 8.- A pesar de no ser obligatorio, para sentir ms confianza, el laboratorio puede decidir incluir tambin en el control del funcionamiento a los medios de cultivo que reciba de los citados en elpunto 6. Segn la carga de trabajo, una buena medida intermedia puede ser hacerlo solo en algunos lotes elegidos aleatoriamente. 9.- Si los medios de cultivo provienen de empresas no certificadas por la norma ISO o no cumplen con las especificaciones de calidad recomendadas, el usuario debe realizar control completo como para los medios preparados en el laboratorio de todos los lotes que se reciben. 10.- Cualquier deficiencia en el aspecto fsico, esterilidad, no crecimiento de la cepa deseada, o no inhibicin de la cepa no deseada, ser documentada y notificada a los manufacturadores para que emprendan las medidas correctoras. El laboratorio mantendr el control de calidad de estos medios hasta que el problema quede resuelto.

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B. Control de medio de cultivo preparado.

i.

Se debe verificar (siempre que sea necesario) que los medios de cultivo y diluyentes preparados por el laboratorio tengan las caractersticas adecuadas con respecto a: Caractersticas fsicas (aspecto, color, n excesivo de burbujas, precipitados Esterilidad Funcionamiento para el cual ha sido preparado: propiedades bioqumicas (diferenciales y diagnsticas) Recuperacin o supervivencia de los microorganismos de

inters.(Productividad) Inhibicin o supresin de los microorganismos no deseados.(Selectividad)

ii.

Parmetros a tener en cuenta para obtener un buen resultado:

Agua: recipientes dnde se almacena el agua debe ser inerte. PH: la medida a 25 oC. pH +0.2. ajuste el pH con 1 M NaOH o 1M CLH Fundir en el agua hirviente volmenes <500ml. 15ml de espesor algar en placas petri 90 mm. Secado de placas estufa 25-55 oC (20 min.) o en flujo laminar. Incubacin: las pilas de platos < 6.

C. Control de esterilidad: Tomar una muestra del 5% de los lotes de 100 o menos placas/tubos y una muestra de 10 de los lotes de ms de 100 placas/tubos. Incubar durante 48h a la T a la que va a ser incubado en el uso con muestra clnicas y posteriormente otras 48 h a T ambiente.

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D. Control de funcionamiento: Comprueba el que medio recupera un bajo nmero de los

microorganismos ms sensibles para los que ha sido preparado, y que inhiba un alto nmero de los microorganismos y diferenciar los microorganismos para los que ha sido diseado en el caso de medios selectivos y diferenciales respectivamente.

E. Procedimiento para el control del funcionamiento F. Preparacin del inculo F.1. Mtodo semicuantitativo

Para controlar las propiedades nutritivas: Hacer una suspensin de la cepa al 0,5 Macfarln en solucin salina. Diluir de aqu al 1/100 (0.1 ml de suspensin + 9,9 ml de solucin salina). Inocular el medio con 10 microlitros de esta suspensin.

Para controlar las propiedades selectivas: Hacer una suspensin de la cepa al 0,5 Macfarln en solucin salina. Diluir de aqu al 1/10 (0.1 ml de suspensin + 0,9 ml de solucin salina). Inocular el medio con 10 microlitros de esta suspensin.

Para controlar los medios lquidos: Hacer una suspensin de la cepa al 0,5 Macfarln en solucin salina. Inocular el medio con 10 microlitros de esta suspensin.

Para controlar las propiedades bioqumicas: Hacer como en el uso con muestras clnica

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F.2. Mtodo cuantitativo: Utizado para medios que requieran ms exactitud y para comparar crecimientos en distintos medios. F.2.1.El da anterior al que se va a realizar el control de calidad de los medios, preparar un cultivo del microorganismo control en BHI e incubar 18-24 horas

F.2.2. El da del control: 1.- Sacar las placas de los medios de cultivo que se van a controlar y dejar atemperatura ambiente durante media hora para que pierdan humedad. 2.- Preparar una gradilla con 6 tubos, y rotularlos 1, -2, -3, -4, -5, 6. Sacar de la estufa de CO2el cultivo de la cepa control y colocarlo en el primer lugar de la gradilla Comprobar el crecimientopor la turbidez del caldo). 3.- Con pipeta y punta estril poner 500 l de solucin salina en cada uno de los tubos rotuladosde -1 a -6. 4.- Pasar 50 l del cultivo de BHI de la cepa control al tubo rotulado 1. Desechar la punta de lapipeta. Homogeneizar con el Vortex. 6 .- Con una nueva punta estril pasa 50 l del tubo 1 al tubo 2. Desechar la punta de lapipeta. Homogeneizar con el Vortex. 7.- Continuar haciendo diluciones, de igual forma, en los tubos 3, 4, -5, -6.

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III.

CEPAS CONTROL:

Las cepas de referencia o cepas control se definen como microrganismos procedentes de un cultivo puro, definidos por lo menos al nivel de gnero y especie, catalogados y descritos segn sus caractersticas y preferiblemente de origen conocido. El laboratorio de Microbiologa debe mantener una coleccin de microrganismos de referencia para utilizarlos en la verificacin y validacin de los medios de cultivo, reactivos, colorantes para tincin y otras sustancias bioqumicas y para el control de la exactitud de las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos y de los distintos ensayos microbiolgicos. Las cepas de referencia seleccionadas deben concordar con las

caractersticas tpicas, morfolgicas, bioqumicas, fisiolgicas y serolgicas de las especias que representan. Las cepas deben ser estables para mantener y reproducir estas caractersticas. Control positivo y negativo. Cuidado y mantenimiento a cargo de una persona responsable. Cepas de coleccin como las ATCC u otras fuentes comerciales.

1) Obtencin de cepas de referencia: a) De una coleccin nacional o internacional reconocida, como la Coleccin

Espaola de Cultivos Tipo (CECT), la American Type Culture Collection (ATCC), o la Nacional Collection of Type Cultures (NCTC), entre otras. Estos organismos aportan un certificado de calidad de la cepa de referencia, que se debe conservar para mantener la trazabilidad de la misma. b) De las cepas distribuidas por el Programa de Control de Calidad de la

Sociedad Espaola de Enfermedades Infecciosas y Microbiologa Clnica (SEIMC). c) De casas comerciales, siempre que el laboratorio aporte un certificado que

garantice la autenticidad de la cepa.


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Cada vez que se reciba una cepa de referencia debe quedar registrado: a. Nombre completo y origen de la cepa, b. Organismo suministrador, c. Fecha de recepcin,

d. Nmero de envases recibidos, e. Tipo y lugar de conservacin f. Firma de la persona que recibe la cepa de referencia g. Otros como los controles (pureza, pruebas bioqumicas) realizados.

2) Mantenimiento y utilizacin de las cepas de referencia:

a) Las cepas de referencia: Deben reconstituirse siguiendo las instrucciones del suministrador.

b) Las cepas de reserva: Se obtienen por subcultivo en los medios adecuados de las cepas de referencia. Las cepas de reserva se pueden conservar mediante liofilizacin, en nitrgeno lquido o congeladas a tempe -50C en medios con agentes

estabilizantes para la congelacin, por ejemplo, caldo de soja tripticasa con glicerol al 10-15% v/v o tubos comerciales con 20-30 esferas/tubo (permiten tomar una esfera sin necesidad de descongelar todo el tubo). Segn el documento M22A3 del NCCLS (actualmente CLSI) en estas condiciones pueden mantenerse indefinidamente y a temperaturas entre 50C y 20C se pueden conservar hasta un ao. Todos los viales deben identificarse con el nombre de la cepa, procedencia y fecha de congelacin. Una vez descongeladas las cepas de reserva no se deben volver a congelar ni a reutilizar.

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c) Las cepas de trabajo: Se obtienen por subcultivo de las cepas de reserva, una vez descongeladas, en medios slidos seleccionados segn el microorganismo. Se conservan a 2-8C o a temperatura ambiente durante un mximo de un mes, siempre que se asegure la viabilidad de la cepa. De las cepas de trabajo se pueden realizar como mximo tres subcultivos, siempre que la cepa conserve sus caractersticas.

Posteriormente, deben reemplazarse a partir de la cepa de reserva congelada. Las cepas de trabajo no se deben subcultivar para sustituir a las cepas de reserva. Cada vez que se vaya a hacer uso de una cepa de referencia, cepa de reserva o cepa de trabajo, hay que comprobar, una vez subcultivadas, su pureza, morfologa tpica, y si es necesario, las pruebas bioqumicas caractersticas.

IV.

LECTURA E INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS:

Para cada medio/microrganismo, observar y registrar: Cantidad de crecimiento: cuadrante al que llega el crecimiento en el mtodo semicuantitativo o dilucin en el mtodo cuantitativo. Caractersticas de las colonias (tamao, morfologa, hemlisis etc.) Reacciones caractersticas en medios para identificacin

Un medio es considerado que tiene un funcionamiento adecuado cuando: se observa en l suficiente colonias con morfologa tpica de todas las cepas ensayadas. se observa suficiente inhibicin del crecimiento del microorganismo .En el control de las propiedades nutritivas y selectivas puede ser til comparar cantidad de crecimiento, tamao colonial y aspecto con lotes anteriores de medios ya controlados. se observan las reacciones tpicas y las morfologas tpicas de los microorganismos ensayados.

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V.

SIEMBRA DE LOS MEDIOS:

1.1

Medios en tubo:

Se inocularn con la tcnica habitual utilizada en la prctica con muestras clnicas

1.2.

Medios en placa:

1.2.1. Mtodo semicuantitativo: Se sembrarn con asa calibrada (10 microlitros) en estra

1.2.2. Mtodo cuantitativo (de Miles y Misra): Dividir la tapa de la placa con rotulador en seis porciones y rotular cada una indicando las correspondientes diluciones: 106, 10-5,10-4,10-3,10-2,10-1. Agregar 10ul de las diluciones, dejarlas sin invertir una media hora hasta que se hayan secado las gotas

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1.3

Agar sangre de cordero y de chocolate

1.3.1 Control de esterilidad De cada lote producido se toma un 2% del total y se incuba durante 72 horas. Los que se aceptan son los que no han producido crecimiento microbiano. Son

rechazados lo que tienen ms del 10% de contaminacin

1.3.2 Control de pH: Se realiza mediciones de pH a muestras seleccionadas al azarcn una

ponteciometria, se recomienda que este a una temperatura de 7.3 +/- 0.2C

1.3.3 Aspecto fsico: Se evala el lote dependiendo de l total de la produccin, si son menos de

200 se revisa el 5%, pero si son mas se har en un 10% Si mas del 50% de total revisado es inadecuado, se revisara el tote completo; de manera que si mas de la mitad del lote total es inadecuado se rechazara

1.3.4 Control microbiolgico De cada lote producido se tomara al azar, en donde se evala con el mtodo ecometrico utilizando cepas de referencia ATCC, con el fin de evaluar la productividad del medio del cultivo Staphylococcus aureus ATCC 25923, crecimiento abundante beta Staphylococcu pyogeness ATCC 19615 crecimiento abundante beta

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VI

Control de Calidad de reactivos

Un elemento fundamental en el trabajo diario del laboratorio de microbiologa lo constituyen los reactivos, tanto comerciales como de preparacin domstica, que son utilizados en la caracterizacin de microrganismos. Por ello, deben efectuarse controles diarios con las bacterias tipo y seguir estrictamente las indicaciones en cuanto a almacenamiento de los reactivos, metodologa de la prueba y tiempo de lectura. Reactivos: Se consideran como tales, entre otros, los colorantes para tinciones, discos con reactivos o con antimicrobianos, y los kits o sistemas comerciales que incorporan una variedad de medios, sustancias bioqumicas y reactivos o cualquier combinacin de los mismos.

a) Para los reactivos preparados en el laboratorio: Debe existir una ficha tcnica de elaboracin que incluya el control de esterilidad y de funcionamiento adecuado y un registro en el que se indique la fecha de preparacin, la validacin realizada y las personas responsables. b) En el caso de preparados comerciales: Deben solicitarse al fabricante evidencias de que cumplen criterios de calidad. Todos los reactivos deben estar etiquetados con su contenido,

concentracin, condiciones de conservacin, fecha de preparacin o de reconstitucin, y fecha de caducidad o periodo recomendado de almacenamiento, y se deben conservar siguiendo las recomendaciones de los fabricantes. Debe existir un documento o ficha para cada reactivo o kit donde se detallen sus componentes y proporcin, la indicacin (ensayo

microbiolgico para el que se utiliza), los controles que deben utilizarse y los criterios de aceptabilidad, el plan y frecuencia de control, las condiciones
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de conservacin, limitaciones de su uso o de interpretacin, descripcin del tipo de lectura de los resultados y mtodo de lectura.

c) En el caso de los kits comerciales: Solamente se podrn utilizar los componentes de uno con otros si pertenecen al mismo nmero de lote, salvo especificaciones concretas del fabricante. Se deben utilizar cepas de referencia para el control de todos los reactivos, colorantes para tinciones y discos. Al menos se debe incluir un microorganismo que produzca una reaccin positiva y otra negativa con cada control. En el caso de kits comerciales proporcionados por fabricantes que siguen sistemas de calidad se recomienda al menos un control en la validacin inicial. Nuevamente, en el documento de la SEIMC anteriormente referido (www.seimc.org/grupos/gegmic) se indican las cepas de referencia que se deben utilizar para el control de los reactivos La frecuencia de control con cepas de referencia depende del tipo de reactivo, de su estabilidad y de las caractersticas intrnsecas de la reaccin. En la tabla 1 se resumen las frecuencias de control requeridas para algunos de los reactivos ms utilizados.

1. REQUISITOS

INDESPENSABLES

QUE

DEBE

CUMPLIR

LOS

REACTIVOS QUMICOS Y COLORANTES: Verificar la calidad de los reactivos. Seguir indicaciones del fabricante para su conservacin y uso Preparar los reactivos de acuerdo a los procedimientos establecidos e identificarlos correctamente. Comprobar su estabilidad y reactividad durante perodo de vigencia. Utilizar agua destilada en su preparacin y material volumtrico de buena calidad.

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Mantener los reactivos y soluciones en recipiente de material inerte apropiado. Seleccin y adquisicin de los reactivos y Colorantes. Almacenamiento. Pruebas de aceptacin. Manipulacin de los reactivos. Preparacin de los reactivos en el laboratorio. Pruebas de evaluacin. Uno de los factores ms importantes de la preparacin de medios y reactivos microbiolgicos es la calidad del agua utilizada. Se debe emplear agua destilada o desionizada, salvo que se indique otra cosa como, por ejemplo en algunos medios micolgicos. Los fluoruros no se eliminan con la destilacin

2. Control de calidad de las tinciones: La concentracin de las soluciones de tincin, por efecto de la evaporacin de los solventes o las variaciones introducidas en los mtodos recomendados, pueden afectar los resultados de las tincin es para diferenciar microorganismos por su reaccin a la tincin de Gram y la morfologa, tintes para cpsulas, esporas, etc. El control de calidad de estos tintes debe realizarse primero con cada nuevo lote, luego basta con un control semanal para mantener un grado de seguridad apropiado en su uso. Para facilitar el control de los tintes, se recomienda preparar placas con microorganismos aislados en el trabajo rutinario o cepas de la ATCC frescas, tomado en cuenta aquellos que pudieran ser ms tiles segn la tincin a evaluar. Para el control diario de la tincin de Gram, se recomienda el uso de una cepa ATCC de Staphylococcus aureus y de Escherichia coli Es necesario llevar un registro de estos controles

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3. Reactivos de identificacin comerciales o preparados Deben etiquetarse en el primer uso, poner la fecha de preparacin y la caducidad. La frecuencia de los controles es lo siguiente: Catalasa, oxidasa, coagulasa: Siempre que se empieza o prepara un nuevo lote y semanalmente. Debe hacerse un control positivo y otro negativo.

Tabla 2. Frecuencia de control de los reactivos utilizados con mayor frecuencia en Microbiologa

Reactivos Colorantes de tincin Gram cido-alcohol resistencia Tinciones fluorescentes Azul de lactofenol

Frecuencia

Nuevo lote + semanal Nuevo lote + cada da de uso Nuevo lote + cada da de uso Nuevo lote o cuando se prepare Nuevo lote + una vez cada mes de uso

Tinciones de parasitologa

Reactivos, discos y tiras Nuevo lote o vial + cada da de uso Nuevo lote o vial + cada da de uso

Catalasa

Oxidasa

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Coagulasa

Nuevo lote o vial + cada da de uso Nuevo lote + una vez cada semana de uso Nuevo lote + una vez cada semana de uso Nuevo lote + una vez cada semana de uso Nuevo lote + una vez cada semana de uso Nuevo vial + una vez cada mes de uso Nuevo lote o vial + cada da de uso

Bacitracina

Optoquina

ONPG

Factores X, V y XV

Antisueros

Deteccin de antgenos bacterianos Kits comerciales de identificacin

Validacin inicial

Sondas de ADN

Nuevo lote o vial + cada da de uso

4. Antibiograma: El aseguramiento de la calidad del antibiograma es una de las tareas de mayor importancia en el laboratorio de Microbiologa Clnica, ya que existen multitud de factores que pueden afectar a los resultados de un antibiograma.
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Por ello, es obligatorio realizar estas pruebas siguiendo mtodos normalizados y controlar los siguientes aspectos: o Control de calidad interno: precisin del procedimiento. o Calidad de los medios de cultivo. o Calidad de los reactivos (discos, tiras y antibiticos). o Control del inculo. o Lectura interpretada del antibiograma

a) Control de calidad interno:

El control de calidad rutinario del antibiograma sea por difusin con discos o por clculo de la concentracin mnima inhibitoria (CMI) est basado en la realizacin de estas pruebas en unas condiciones estndar y con la inclusin de cepas de referencia que, lgicamente, sean genticamente estables. Los resultados que se deben esperar en estas pruebas realizadas con cepas de referencia son conocidos, siendo los ms utilizados los publicados por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Las cepas que se utilizan con mayor frecuencia, recomendadas por organismos internacionales como el CLSI, son cepas sensibles. Sin embargo, con frecuencia hay que utilizar cepas resistentes que pueden ser genticamente menos estables. En estos casos es necesario controlar sus mecanismos de resistencia con periodicidad. La frecuencia recomendada para realizar las pruebas de control de calidad es muy alta. De hecho, cuando se pone en marcha la tcnica o si se produce cualquier cambio del procedimiento, la frecuencia debe ser diaria. Una vez que la tcnica es absolutamente exacta y reproducible, se puede pasar a frecuencia semanal. El CLSI sugiere pasar a frecuencia semanal solo si no se sobrepasa la cifra de 3 dimetros de inhibicin o de tres valores de CMI incorrectos de cada 30 ensayados. Hay que dejar constancia de estos controles con sus resultados en un formulario preparado con esa finalidad.

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Cualquier dimetro de inhibicin o CMI diferente al valor esperado debe hacer sospechar de una contaminacin o de una mutacin. En este ltimo caso se debe reemplazar la cepa de trabajo por un nuevo subcultivo de la cepa de reserva o de referencia, o incluso, obtener una nueva cepa de referencia de las colecciones indicadas en el apartado 5.1.3. Cepas de referencia.

b) Calidad de los medios de cultivo: Los medios utilizados para realizar antibiograma, agar Mueller-

Hinton, Haemophillus Test Medium, etc., son medios no exentos segn el documento M22-A3 del CLSI, por lo tanto, es necesario controlar cada nuevo lote recibido en el laboratorio con las cepas de referencia (caractersticas fsicas, esterilidad, funcionamiento). Estos ensayos deben incluir los antibiticos que se utilizan con cada medio. Si los valores obtenidos no son los esperados hay que revisar los siguientes aspectos: Verificar que el resto de los reactivos utilizados (discos y antibiticos) ya han sido sometidos al correspondiente control de calidad. Revisar las caractersticas fsicas del medio, por ejemplo, las placas con poco agar, por debajo de 15 ml por placa, es fcil que provoquen que los halos sean mayores de los debidos, lo contrario puede suceder con placas de mayor espesor.

c) Control de los discos, tiras y antibiticos: Es necesario controlar cada nuevo lote que se reciba en el laboratorio. Adems, se debe estar alerta a la disminucin de los valores de un nico antibitico incluido en el antibiograma, ya que indicara un probable deterioro de un disco o antibitico concreto. Otros aspectos que se deben controlar son los siguientes: Temperatura de almacenamiento: debe ser preferentemente a -20C, salvo el cartucho en uso que se almacenar a temperatura de refrigeracin o si as lo aconseja el fabricante.
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Deben estar protegidos de la luz. Es recomendable permitir que los reactivos alcancen la temperatura ambiente antes de utilizarse para evitar condensaciones. La fecha de caducidad. Un caso aparte es el de los discos con inhibidores de beta-lactamasa que requieren un control especfico para detectar el deterioro del inhibidor. Este deterioro se puede poner de manifiesto utilizando una cepa patrn de E. coli productora de beta-lactamasa.

d) Control del inculo:

La densidad del inculo tambin afecta al rendimiento del antibiograma. De hecho, los inculos con mayor carga bacteriana de la normalizada provocan dimetros de inhibicin menores o CMIs ms elevadas de las debidas, ocurriendo lo contrario cuando el inculo es demasiado bajo. En los documentos del CLSI y de otros organismos habitualmente aparece como inculo normalizado el equivalente al 0,5 de la escala de McFarland. Para preparar este inculo se deben utilizar en la medida de lo posible mtodos perfectamente reproducibles; el ms utilizado es la comparacin visual con la escala de turbidez de McFarland. Sin embargo, existen mtodos mucho ms exactos como los basados en la determinacin de la absorbancia de la suspensin bacteriana mediante un espectrofotmetro que, con un mnimo de entrenamiento, se realiza en poco tiempo y permite obtener resultados mucho ms exactos. Es recomendable realizar peridicamente, con la frecuencia que el laboratorio establezca, controles de los inculos preparados para llevar a cabo las distintas tcnicas de antibiograma; para ello, se puede realizar un cultivo cuantitativo a partir de la suspensin bacteriana empleada, y comprobar que el recuento obtenido est dentro de lo esperado segn el microorganismo ensayado y tcnica empleada (normalmente entre 105-108 UFC/ml).

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e) Lectura interpretada del antibiograma:

La lectura interpretada del antibiograma es una herramienta extraordinaria para el control de calidad del antibiograma. El establecimiento de reglas "expertas" para la lectura del antibiograma no solo permite predecir el fracaso teraputico en base a la caracterizacin de los mecanismos de resistencia sino que tambin nos permite detectar la presencia de resultados atpicos. Estas reglas expertas deben estar recogidas en el procedimiento de trabajo utilizado para realizar los antibiogramas de modo que se pueda verificar ante cualquier regla "experta" aplicada en un informe si procede realmente utilizarla. Asimismo, estas reglas deben someterse a revisiones peridicas con objeto de que estn permanentemente actualizadas. Estas actividades de revisin deben quedar registradas. Para ello, la validacin facultativa de los resultados del antibiograma est basada, en gran parte, en la ausencia de resultados atpicos, por ejemplo, no puede ser posible informar una cepa de S. pyogenes como resistente a la penicilina, ya que hasta el momento actual esta resistencia no ha sido descrita. La sola presencia de este fenotipo obligara a repetir el ensayo y verificar los controles de calidad realizados a los discos de penicilina.

5. Control de calidad de la prueba de sensibilidad: Se debe monitorear la precisin y exactitud del procedimiento de la prueba de susceptibilidad, el comportamiento de los reactivos utilizados en la prueba y el desempeo de las personas que llevan a cabo las pruebas y sus resultados. Al hacer el control de calidad de discos, tiras de E-test o mtodos de sensibilidad para sistemas automatizados o semi

automatizados, se recomienda utilizar cepas ATCC. Cada nuevo lote de estos insumos debe evaluarse antes de su uso rutinario y luego una vez al mes, si no existe cambio de lote en ese periodo.

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6. Sistemas automatizados: sistemas de identificacin y antibiograma:

En los ltimos aos, la automatizacin ha irrumpido en los laboratorios de microbiologa simplificando el procesamiento del elevado nmero de muestras que se estudian en muchos laboratorios. Al mismo tiempo, se plantean nuevos retos como el control de calidad de estos equipos. El control de calidad de los sistemas de identificacin y antibiograma automatizado est basado, como el control de calidad del antibiograma, en la inclusin de cepas de referencia. Los aspectos a controlar son muy similares a los ya tratados en el punto anterior como la precisin del procedimiento, el control del inculo y por supuesto la lectura interpretada del antibiograma. El programa de control es similar al utilizado en el control de calidad de los antibiogramas. Es decir, con una frecuencia determinada se inoculan en estos equipos cepas de referencia con perfiles de sensibilidad conocidos. Como los reactivos (paneles) suelen incluir pocillos para identificacin y pocillos para antibiograma, los controles se pueden realizar

simultneamente. Inicialmente, es recomendable realizar controles diarios inoculando en paralelo las cepas problema y las cepas control. Posteriormente, una vez demostrada la fiabilidad de los equipos y reactivos (validacin inicial), se podr optar por realizar controles con una periodicidad fija o para cada lote nuevo de reactivos. Cuando cambie el procedimiento, el equipo o el tipo de paneles utilizados, habr que realizar una nueva validacin.

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ANEXOS:

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