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UNIVERSIDAD POLITÉCNICA SALESIANA

MANUAL DEL ESTUDIANTE

LABORATORIO MICROBIOLOGÍA II

Periodo 51

DESCRIPCION DEL CURSO

Durante este curso, el estudiante se familiarizará con el manejo de técnicas básicas de


microbiología para el aislamiento e identificación de microorganismos de interés en
microbiología de aguas, alimentos e industrial.

OBJETIVOS GENERALES DEL CURSO

 Incursionar en el campo de la investigación científica.


 Proporcionar herramientas en microbiología que el estudiante podrá aplicar en
su profesión y en su vida diaria.
 Aportar en la formación de profesionales de calidad

OBJETIVOS ESPECÍFICOS DEL CURSO

Destrezas:

 Desarrollar destrezas básicas en técnicas de laboratorio que permitan al


estudiante manejar cultivos microbiológicos.
 Aprender a aplicar los contenidos del curso teórico para analizar muestras
microbiológicas.

Actitudes:

- Aprender a trabajar en equipo durante el desarrollo de las prácticas de


laboratorio.

- Fortalecer la actitud crítica, que sepa formularse preguntas relevantes y buscar


respuestas que tengan soporte científico.

- Desarrollar una actitud proactiva frente al aprendizaje.

FORMATO DE LA CLASE

Los estudiantes asistirán a una sesión de laboratorio de los temas que en la clase teórica
se consideren pertinentes, así como de temas adicionales de interés en la formación
técnico-científica del estudiante, al día siguiente se revisará los resultados de la práctica.
La clase se llevará a cabo de manera interactiva y requerirá de la participación individual
del estudiante. Previo a cada clase los estudiantes deben leer sobre el tema a tratar
durante la sesión de laboratorio.
EVALUACION:

La nota de laboratorio de microbiología será el 10% de la nota de cada parcial de la


asignatura.

Informes 6

Prueba 3

Asistencia 1

TOTAL 10 puntos

*La prueba se tomará en horas de clase.

INSTRUCCIONES PARA REALIZAR EL INFORME DE LABORATORIO

El Informe debe ser concreto y debe contener los puntos que se indican a
continuación.

1. Objetivos de la práctica: los ya planteados en el manual.


2. Resultados: (2.0 puntos)
a. Describir los resultados utilizando tablas, gráficos, cuadros y dibujos
según lo observado.
3. Conclusiones y Discusión: (2.0 puntos) Interpretar los resultados y respaldar
tus conclusiones con los resultados obtenidos.
No volver a escribir los resultados sino interpretarlos y relacionarlos con
bibliografía existente.

Es importante reflexionar que los resultados negativos no son un fracaso dentro


del desarrollo de la práctica, estos resultados también merecen un análisis.

No olvidar que debe haber relación entre los objetivos de la práctica y la


discusión.

4. Preguntas de cada práctica: (2 puntos) Responder puntualmente las preguntas


planteadas para cada práctica.
5. Bibliografía: Esta será la que se ha utilizado para responder las preguntas de la
práctica y si se utilizó alguna fuente bibliográfica al analizar los resultados,
conclusiones o discusión.
Formato de bibliografía para informes de laboratorio

La bibliografía deberá ser actualizada y citar en formato APA.

REQUERIMIENTOS

Es indispensable que cada estudiante tenga su mandil propio, guantes, marcador


para vidrio y manual de la práctica correspondiente.
POLITICAS DE LA CLASE

- Los estudiantes deben acordar una hora al día siguiente de la práctica para
revisar los resultados.
- No se aceptarán informes atrasados. En casos justificados los informes serán
recibidos y calificados sobre un punto menos por cada día de atraso en la
entrega. Si por motivos no justificados algún estudiante no asiste a la práctica,
ésta no podrá ser recuperada y la nota del informe será 0 (cero).

PRACTICA N° 1
TEMA: Método de vertido en placa para conteo de microorganismos.

OBJETIVOS
 Aplicar el método de vertido en placa para el conteo de microorganismos.
 Determinar indirectamente el potencial microbiano en una muestra contaminada.

MARCO TEÓRICO
Introducción
Existen diferentes técnicas para determinar el número de microorganismos en suelos o
aguas, tanto directas como indirectas. Para la determinación de microorganismos
heterótrofos totales aerobios, se puede aplicar la técnica de vertido en placa. Es una
técnica indirecta de cuantificación; sin embargo, provee una medición de la viabilidad
microbiana, es rápida de efectuar y no requiere de mucho material (Lorch et al., 1995;
Bosserty Kosson, 1997).
Fundamento
El método de vertido en placa se fundamenta en que cualquier célula viable inoculada
en un medio de cultivo se multiplica y produce datos de fácil identificación, como la
formación de colonias en placas de agar.
Este método consiste en la preparación de una serie de diluciones de una muestra en
un diluyente apropiado, colocando una alícuota de una dilución en una caja Petri estéril,
sobre la cual se vierte un medio de cultivo adecuado y se incuba la placa de agar bajo
condiciones ambientales apropiadas. La dilución debe permitir generar colonias
separadas, cada colonia puede proceder de una sola célula o de una agrupación (unidad
viable), la cual se contará como una bacteria. Bajo este fundamento, estas placas
pueden ser usadas no sólo para el conteo de poblaciones microbianas, sino también
para el aislamiento de organismos. Un medio selectivo o no selectivo puede ser usado
dependiendo de la naturaleza del microorganismo que se desea contar o aislar (Ramírez
et al., 1992).
Preparación de la muestra
Un aspecto importante de la microbiología de alimentos es que los microorganismos no
se encuentran distribuidos de manera homogénea en la muestra. Por ejemplo, en frutas,
vegetales y carnes la mayor proporción de bacterias se encuentra en la superficie. Lo
mismo puede ocurrir en alimentos procesados. Por lo tanto, el análisis de un gran
número de muestras permitirá establecer la calidad microbiológica del alimento
analizado. Sin embargo, esto no siempre es posible por lo tanto la toma de una muestra
representativa es crucial en el análisis y se la debe realizar con ayuda de instrumentos
estériles y colocarla en recipientes estériles. Luego deben ser transportadas y
conservadas a 4ºC hasta su análisis el cual debe realizarse dentro de las primeras 24
horas desde la toma de la muestra. Las muestras congeladas deben mantenerse
congeladas hasta el análisis.
Una vez en el laboratorio se utiliza 10, 25 ó 50 gramos de la muestra para preparar
diluciones en soluciones isotónicas estériles como: agua de peptona 0,1%. Buffer de
fosfato salino (PBS), solución salina 0,85%.
Con el objetivo de cuantificar el número de microorganismos presentes en una muestra
se recurre a la preparación de diluciones en serie y se comienza con la primera dilución
1/10 o 10-1 hasta obtener el número de diluciones requeridas para el análisis.
La homogeneización de las muestras sólidas se la realiza con ayuda de un Stomacher®
o manualmente. Finalmente, cada dilución se siembra por duplicado en los medios de
cultivo adecuados utilizando la técnica de siembra recomendada.
Es importante tomar en cuenta que las diluciones no deben mantenerse más de 30
minutos antes de la siembra, puesto que los microorganismos pueden comenzar a
replicarse o morir.
Métodos de siembra por vertido en placa
Se coloca de 1 hasta 5 ml de la dilución de la muestra en una caja Petri vacía,
dependiendo si se conoce o no el grado de contaminación de la muestra; y luego se
adiciona entre 20 y 25 ml de medio de cultivo a 45ºC para mantenerlo líquido, se
homogeniza y se deja solidificar.
Guía para el recuento de colonias
Después de la incubación, las colonias que han crecido en cada caja petri deben ser
contadas de acuerdo al siguiente método, el cual ha sido adaptado del libro “The
Compedium of Methods for the Microbiological Examinatin of Foods”. El propósito de
esta guía es asegurar la reproducibilidad de resultados entre diferentes microbiólogos y
laboratorios.
1. Cualquier colonia que esté físicamente distinguible se cuenta como una: Las
colonias de algunas bacterias pueden ser de forma irregular y por esto es difícil
cuantificar las colonias. Este conteo puede ser interpretado de diferente manera por
cada investigador. Para estandarizar el conteo, cualquier colonia distinguible se cuenta
como una. Se debe asegurar que todas las colonias sean contadas incluidas aquellas
colonias que no resaltan. Un aparato para conteo de colonias con iluminación puede ser
de gran ayuda al momento del recuento. Es muy importante diferenciar una colonia de
las partículas de alimento esparcidas en el medio de cultivo.
2. Contar las cajas petri de todas las diluciones que contengan entre 25 y 250
colonias:
Realizar un promedio de las colonias que se hayan contado en las cajas petri de la
misma dilución, y utilizando la ecuación descrita, calcular el número de ufc/g ó ml
del producto inicial.
3. Si sólo una caja petri de las dos contiene de 25 a 250 colonias, se debe contar
ambas cajas petri y realizar un promedio del conteo: Si ninguna otra dilución
contiene entre 25 y 250 colonias, se debe usar ésta para calcular el número de ufc/g ó
ml del producto inicial.
4. Si dos diluciones consecutivas tienen de 25 a 250 colonias (por ejemplo: 10-4 y
10-5): Se debe calcular las ufc/g de cada dilución y reportar el promedio como ufc/g. ó
ml. Pero si el mayor contaje es el doble del menor contaje, se debe reportar el menor
contaje como ufc/g. ó ml.
5. Si todas las cajas petri contienen más de 250 colonias: Seleccione la muestra
más diluida y estime el número contando una porción de la caja. Use un contador de
colonias con una caja guía dividida en cm2 si es posible. Cuando hay menos de 10
colonias/cm, cuente 12 x 1cm2 cuadrados y calcule el promedio/cm2. Cuando hay más
de 10 colonias/cm, cuente solo 4 x 1cm2 y calcule el promedio/cm2. El área de las cajas
petri convencionales (15x100) es aproximadamente 56cm2. Multiplique el número
promedio/cm2 por 56 para determinar el número de colonias /caja petri. Luego calcule
el número de ufc/g ó ml.
6. Si todas las cajas petri contienen menos de 25 colonias: Considere el número de
colonias de la muestra menos diluida y reporte el contaje como un número estimado de
ufc/g ó ml.
7. Si no hay colonias en ninguna de las cajas petri: Reporte el contaje estimado
como menor a uno (< 1) y multiplique por el inverso de la menor dilución. Por ejemplo
si inocula las diluciones de 10-3 a 10-7 y no observa ninguna colonia en ninguna caja,
reporte como <1 x 103 ufc/g ó ml.
8. Colonias extendidas: Hay algunas bacterias que forman colonias grandes en agar.
(Bacterias del género Proteus son invasoras y crecen extensivamente). Cuando se
observan colonias extendidas que pueden ser consideradas como una sola colonia, solo
en caso de que no exceda el 50% del área de la caja petri. Cuando la colonia excede el
50% de la caja petri, reporte esto como una colonia extendida y no pueden ser utilizadas
para calcular el número de ufc/g ó ml.

Figura 1 Preparación de diluciones

Fuente: Fuente: González, 2004.

Figura 2 Técnica de Vertido en placa

Fuente: González, 2004.

PROCEDIMIENTO
Preparación de la muestra
De manera aséptica con instrumentos estériles y junto al mechero, pesar 10 gramos de
una muestra de alimentos en una funda estéril y resuspender en 90 ml de agua
peptonada.
Homogenizar la muestra. De esta manera se ha preparado la primera dilución 1/10 ó 10-
1
. La dilución 10-2 resulta de transferir 1 ml de la dilución anterior a 9 ml de agua
peptonada y así sucesivamente hasta la dilución 10-3.
El número de diluciones se establece de acuerdo al grado de contaminación de la
muestra. En este caso suponemos que la muestra tiene un elevado número de bacterias
por lo tanto el número de diluciones recomendada es de 10-1 a 10-4.
Método de Vertido en placa
a) Rotular la base de 5 cajas petri estériles vacías (dilución, grupo, muestra, fecha)
tomando en cuenta de no abrir las cajas.
b) Tomar 1 ml de cada dilución con una pipeta de vidrio estéril o micropipeta y colocar
en el interior de la placa petri.
c) Sacar el agar nutritivo del baño maría a 45ºC y verificar que esté completamente
líquido.
d) Verter el medio de cultivo lentamente sobre la placa hasta que el medio cubra la
placa.
e) Suavemente homogenizar la mezcla con movimientos circulares sin permitir que el
medio se derrame fuera de la caja.
f) Realizar un control de contaminación del medio, colocando solamente medio de cultivo
en una caja petri.
g) Dejar reposar hasta que el medio solidifique completamente.
h) Colocar las placas en la estufa e incubar por 24 horas a 35°C±2.
Recuento de colonias
a) Efectuar los contajes respectivos a las 24 y 48 horas.
b) Elegir las placas cuyos contajes se encuentren entre 25 y 250 ufc y seguir la guía
para recuento microbiano.
c) Expresar los resultados como UFC/gramo ó ml de muestra aplicando la siguiente
ecuación:
𝑈𝐹𝐶 # 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎 𝑥 𝑒𝑙 𝑖𝑛𝑣𝑒𝑟𝑠𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑜𝑟𝑖𝑔𝑖𝑛𝑎𝑙
=
𝑔 𝑜 𝑚𝐿 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑖𝑛𝑜𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑎 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 (𝑚𝐿) ∗

RESULTADOS ESPERADOS

Luego de realizar los cálculos respectivos, los resultados deben ser reproducibles es
decir no debe existir un error mayor al 5% entre duplicados. Además el resultado se
calculará tomando la media de los resultados de cada dilución y no debe existir un error
mayor al 10% entre diluciones.

Además se debe comparar los resultados con la normativa vigente del INEN, de acuerdo
al alimento elegido por cada grupo, para determinar si cumple o no con la normativa
establecida para aerobios totales.
Ejemplo de recuento total

Ejemplo de cálculo: 135*102=13500=1,35*104

Resultado final del recuento: Para expresar el resultado final se debe sacar una media
de las ufc/g ó ml calculada para cada dilución. En este caso tenemos tres datos:

1) 1.35 x 104

2) 1.25 x 104

3) 5 x 103

Al observar estos resultados podemos darnos cuenta que los valores A y B son
parecidos (error < 10%) y el valor C tiene un error mayor comparado con los valores A
y B. El resultado C, al provenir de la dilución 10-4, la justificación podría ser que la
probabilidad de acumular errores en la elaboración de esta dilución es mayor. En este
caso se puede eliminar el resultado discrepante y se calcula la media entre las otras
diluciones. Ufc/ml = (1.35 x 104+ 1.25 x 104)/2 Ufc/ml = 1.3 x 104.

Recuento total: 1.3 x 104 UFC/mL

RESULTADOS

Técnica de vertido en placa

Dilución Placa 1 Placa 2 Promedio UFC/mL o g Observaciones

10-1

10-2

10-3

Recuento total

Añadir los cálculos realizados para cada dilución (5% entre duplicados y 10%
entre diluciones).
Preguntas

1. ¿Cuál es el objetivo de la técnica de vertido en placa?.


2. La técnica de vertido en placa a qué tipo de conteo de microorganismos
corresponde. Explique.
3. En el procedimiento de la técnica descrita en el manual, se menciona que
se debería colocar solamente medio de cultivo en una caja Petri sin
muestra. ¿Cuál es el objetivo de realizar este proceso, y que nos indicarían
los resultados obtenidos?

BIBLIOGRAFÍA

 Madigan M., Martinko, J. Parker J. (2007). Brock Biología de los


Microorganismos. ISBN: 84-486-0261-7. Pentice-Hall. Madrid. España.

 Leboffe.J y Pierce.E. (2011). A photographic Atlas for the Microbiology


Laboratory. 4th edition. MORTON. USA.

 Lorch H. J., Benckiesser G. and Ottow J. C. G. 1995. Basic methods for


counting microorganisms in soil and water. In: Methods in applied soil
microbiology and biochemistry. K. Alef and P. Nannipieri (Eds). Academia
Press, pp.146-161.

 Ramírez G. R. M., Luna M. B., Mejía Ch. A., Velázquez M. O., Tsuzuki R. G.,
Vierna G. L., Müggenburg I. 1992. En: Manual de prácticas de microbiología
general. Laboratorio de microbiología experimental. Facultad de Química,
UNAM.