MANUAL DE LABORATORIO MICROBIOLOGÍA PATOGÉNICA

Contenido

SÍLABUS ................................................................................................................................................ 1

SEGURIDAD EN EL LABORATORIO .................................................................................................. 11

PRÁCTICA 1: MEDIOS DE CULTIVO Y MÉTODOS DE SIEMBRA ..................................................... 14

PRÁCTICA 2: MANEJO DEL MICROSCOPIO Y TINCIONES.............................................................. 20

PRÁCTICA 3: COCOS GRAM POSITIVOS: GÉNERO STAPHYLOCOCCUS ..................................... 26

PRACTICA 4: COCOS GRAM POSITIVOS: GÉNERO STREPTOCOCCUS Y ENTEROCOCCUS. .... 32

PRÁCTICA 5: IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS DEL TRACTO GASTROINTESTINAL POR

BIOQUÍMICAS CONVENCIONALES ................................................................................................... 36

PRÁCTICA 6: IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS MEDIANTE GALERIA API Y

UROCULTIVOS ................................................................................................................................... 42

PRÁCTICA 7: PRUEBA DE SENSIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS ........................................................... 47

PRÁCTICA 8: APLICACIONES INMUNOLÓGICAS EN EL DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO Y

MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA (DAPI) ................................................................................... 54

PRÁCTICA 9: CONJUGACIÓN, HONGOS Y HELMINTOS.................................................................. 62

PRÁCTICA 10: HEMAGLUTINACIÓN VIRAL ....................................................................................... 71

Misión de la USFQ

La USFQ forma, educa, investiga y sirve a la comunidad dentro de la filosofía de las Artes Liberales, integrando a todos los
sectores de la sociedad.

Visión de la USFQ

La USFQ será una universidad modelo de educación en Artes Liberales, emprendimiento, desarrollo científico, tecnológico y
cultural para América Latina, reconocida por la calidad y liderazgo de sus graduados.

Las Artes Liberales

Una filosofía educativa en la que todas las disciplinas del saber tienen igual importancia y que busca formar individuos libres,
conscientes de su entorno, emprendedores, seguros de sí mismos, creativos y sin condicionamientos.

Misión del Colegio

Liderar programas académicos y de investigación para contribuir al conocimiento de la biodiversidad, resolver problemas
ambientales y aportar al desarrollo sustentable de las poblaciones humanas.

MICROBIOLOGÍA PATÓGENA

UNIVERSIDAD SAN FRANCISCO DE QUITO COLEGIO: CIENCIAS BIOLÓGICAS Y

AMBIENTALES CURSO: MCR 0307L – LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA PATOGÉNICA
Semestre: Primer Semestre 2017/2018

DATOS DEL CURSO:

Créditos: 1

Prerrequisitos: BIO 0140

Correquisitos: MCR 0307

DESCRIPCIÓN DEL CURSO:

Durante este curso, el estudiante se familiarizará con el manejo y la identificación de bacterias

mediante protocolos establecidos. El estudiante desarrollará técnicas de aislamiento y métodos de
diagnóstico de microorganismos potencialmente patógenos y aprenderá a diferenciarlos de los no
patógenos según su lugar de origen.

1
RESULTADOS DE APRENDIZAJE ESPECÍFICOS DEL CURSO:

Nro Resultado de Aprendizaje Nivel

1 Aplica herramientas técnicas de microbiología para la Inicial

identificación y diferenciación de agentes bacterianos
patógenos.

2 Conoce la interacción entre los microorganismos unicelulares y Inicial

multicelulares con el organismo humano.

3 Establece la probabilidad de asociación de los signos y síntomas Medio

de un paciente con infecciones potenciales dados los
mecanismos de virulencia de los agentes patógenos.

4 Desarrolla destrezas básicas en técnicas de laboratorio que Medio

permitan el manejo cultivos microbiológicos bajo las normas de
bioseguridad.

5 Diferencia la microbiota normal y los microorganismos patógenos Final

según el lugar de origen de una muestra clínica humana.

CONTENIDOS DEL CURSO:

Introducción al syllabus, indicaciones generales de manejo de bioseguridad y disciplina dentro del
laboratorio. Indicaciones generales de la estrategia de evaluación a aplicar.
Desarrollo de prácticas de laboratorio:
1. Medios de Cultivo y métodos de siembra
2. Microscopía y Tinciones
3. Identificación de cocos Gram positivos (Staphylococcus sp.)
4. Identificación de cocos Gram positivos (Streptococcus y Enterococcus sp.)
5. Identificación de Enterobacterias del tracto gastrointestinal por bioquímicas convencionales
6. Aplicación de galerías bioquímicas comerciales para identificación fenotípica de Enterobacterias
mediante Galeria API y Urocultivos
7. Prueba de Sensibilidad a antibióticos
8. Aplicaciones Inmunológicas en el diagnóstico microbiológico y Microscopía de Fluorescencia (DAPI)
9. Conjugación, Hongos y Helmintos
10. Hemaglutinación viral

2
 METODOLOGÍA PARA LA INTEGRACIÓN ENTRE LOS CONTENIDOS TEÓRICOS Y PRÁCTICOS:

Las metodologías de enseñanza utilizadas para impartir los cursos de la USFQ, siguiendo la filosofía de
las Artes Liberales, fomentan el diálogo y facilitan la construcción del conocimiento mediante el constante
intercambio de ideas y experiencias entre profesores y estudiantes. Se espera que en todos los cursos
los contenidos teóricos sean vinculados con la práctica profesional y contexto laboral donde se
desempeñarán los estudiantes a futuro, procurando integrar actividades y simulaciones de diversa índole
que fomenten la comprensión de los contenidos contextualizados con la práctica y la realidad. Por lo
tanto, el contenido del curso de Laboratorio de Microbiología Patogénica contempla la inducción a los
fundamentos teóricos y bioquímicos de las reacciones enzimáticas, cromogénicas o inmunológicas a
partir de las cuales se puede identifican los agentes infecciosos y se diferencian de la microbiota normal.

EVALUACIÓN DEL CURSO:

% de la # de elementos Puntos equivalentes a

Tipo de Evaluación Detalle evaluados los 25 puntos de
nota final
laboratorio

Informe de Práctica Informe de Práctica 24 11 6

Participación Intervenciones y aportes en cada 5 5 1.25

clase.

Lecciones Evaluación corta antes de la práctica 6 10 1.5

Manual de laboratorio Asistencia a la revisión de resultados 5 11 1.25

evidenciada con las firmas de los
ayudantes en el registro del manual
correspondiente.

Examen medio semestre Evaluación escrita presencial 24 1 6

acumulativa de medio semestre.

Examen final Evaluación escrita presencial 24 1 6

acumulativa de todo el semestre.

Casos Clínico Presentación de casos clínicos 12 1 3

3
 Descripción de las categorías de evaluación:

Informes de Prácticas:

El Informe debe ser concreto y debe ser redactado en una extensión ideal de 3 carillas y máxima de 4
carillas, en letra Arial 11, con un espacio de 1,5.

El contenido del informe deberá limitarse a los siguientes puntos:

1. Objetivos de la práctica: Transcribir los objetivos planteados en el manual

2. Resultados: (2.0 puntos)

a. Describir los resultados utilizando tablas, gráficos, cuadros y dibujos según lo observado. No
redundar plasmando la misma información en varios esquemas.

Dentro de los resultados se debe resolver los casos clínicos presentados en cada práctica de laboratorio
utilizando el formato establecido por el instructor. Este análisis debe cubrir los siguientes puntos: a)
Microorganismo identificado; b) Interpretación: es o no patógeno de acuerdo al sitio o muestra de la que
ha sido aislado, ¿qué patología podría producir este microorganismo en el paciente?, ¿en dónde puede
encontrarse este microorganismo como microbiota normal?

Ejemplo de Caso Clínico

CASO CLÍNICO

Datos del Paciente

Edad: 30 años Sexo: Femenino

Sintomatología: Disuria, tenesmo vesical, oliguria etc.

Datos de la muestra

Examen: Cultivo Tipo de muestra: Orina

Algoritmo: BG-, Oxidasa -, TSI A/A+G/ U-/C-/S-I-+M-

Microorganismo identificado: E. coli

Interpretación: El microorganismo aislado es patógeno en el sitio aislado? SI

Dónde se encuentra éste microorganismo como microbiota normal? En el intestino

Antibiótico de elección: Nitrofurantoina, Cefalosporinas de I o II generación.

3. Discusión: (1.5 puntos) Interpretar los resultados, explicar con fundamentos las observaciones,
cambios de color, reacciones enzimáticas o inmunológicas. La información deberá respaldarse
con citas y referencias bibliográficas (no incluye análisis de casos). Es importante reflexionar
4
 que los resultados negativos no son un fracaso dentro del desarrollo de la práctica, estos
resultados también merecen un análisis.

4. Conclusiones: (0.5 punto) Redactadas en forma afirmativa, van acorde con los objetivos de cada
práctica y establecen las cláusulas aprendidas en la misma. No volver a escribir los resultados.

5. Preguntas de cada práctica: (1.0 punto) Responder puntualmente las preguntas planteadas para
cada práctica, respaldar las respuestas en la literatura científica citándola. En caso que la práctica
no tenga preguntas, el respectivo punto se añadirá a la calificación de la bibliografía o la discusión.

6. Bibliografía: (1,0 punto) Reporte de la literatura consultada para analizar los resultados, redactar
la discusión y para responder las preguntas de la práctica (no tomar como bibliografía el manual
de Microbiología Patógena – USFQ)

Forma correcta de escribir los nombres científicos

La nomenclatura científica norma la manera en la cual se escriben los nombres científicos de los
organismos vivos. Así, el género lleva siempre la primera letra mayúscula y tanto género como especie
debe ser escrito con letra itálica o subrayado tal como se muestra a continuación.

Staphylococcus (género) aureus (especie)

Streptococcus (género) pyogenes (especie)

Por favor poner atención al escribir los nombres de los microorganismos utilizados en las prácticas. Por
cada nombre mal escrito en el informe se restará 0.15 puntos a la calificación obtenida en el informe.

NOTA: POR FAVOR PONER ATENCIÓN AL ESCRIBIR LOS NOMBRES DE LOS

MICROORGANISMOS UTILIZADOS EN LAS PRÁCTICAS.

Participación en Clases
Durante la explicación de la práctica los estudiantes pueden aportar con comentarios científicos basados
en literatura sugerida, cada participación es calificada, se espera que cada estudiante tenga al menos 5
aportaciones durante todo el semestre.

Lecciones
Las lecciones serán tomadas en los primeros 10 minutos de cada clase, si el estudiante no llega a la
lección, ésta no será tomada nuevamente y su calificación será de 0 (cero puntos).
5
Se permite al estudiante anular 1 informe y una lección con la nota más baja durante todo el
semestre, pero no es permitido no presentarse a rendir una lección o un informe (sin justificación) y
pero aún confiados en esta disposición.

Manual de trabajo
Al final del semestre se revisará el número de firmas de cada una de las prácticas, estas firmas son la
constancia de que el estudiante asistió a la revisión de los resultados de cada práctica.

Examen de medio semestre

De acuerdo al calendario establecido para el laboratorio, se tomará un examen de medio semestre en el
cual será práctico y escrito, se usará la metodología de casos clínicos y estaciones de trabajo, las cuales
se explicará durante las clases.

Examen final
Al final del semestre se realizará una evaluación escrita de todas las prácticas desde la 1 hasta la 10.

Caso Clínico
Se formará grupos de trabajo, los cuales permanecerán fijos durante todo el semestre, al final del
semestre estos grupos presentaran un caso clínico, de acuerdo a los conocimientos adquiridos durante
todo el semestre, se evaluará la capacidad de cada estudiante de identificar bacterias de acuerdo a los
algoritmos estudiados, diferenciar microbiota normal, bacterias patógenas, sintomatología, antibiótico
terapia, factores de virulencia.

BIBLIOGRAFÍA PRINCIPAL

- Patrick Murray, Ken S. Rosenthal, Michael A. Pfaller. 2014. MICROBIOLOGÍA MÉDICA. 10ma
edición. Elsevier- España.

BIBLIOGRAFÍA COMPLEMENTARIA

- SATI. Balasini C, Rosa R, Llerena MC. Infectología crítica (2015). Manejo de la patología infecciosa
en el paciente grave. Editorial médica Panamericana.
- Bonifaz A., (2015). Micología Médica Básica. Mc Graw-Hill Interamericana Editores. México DF
- Farías, Elinos M. (2015). Fundamentos de Bateriología: Atlas a color de las bacterias más comunes.
Editorial Trillas. México.
- Ramirez R. (2015) Técnicas básicas de microbiología y su fundamento. Editorial Trillas Performance
Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing: Twenty - Fifth Information Supplement. January
2015, M100-S25.
- Baron E. et al. A Guide to Utilization of the Microbiology Laboratory for Diagnosis of Infectious
Diseases: 2013 Recommendations by the Infectious Diseases Society of America (IDSA) and the
American Society for Microbiology (ASM), Clinical Infectious Diseases Advance Access published
July 10, 2013.
- Manual of Clinical Microbiology, 10th or 11th Edition, JAMES H. JORGENSEN
6
POLÍTICAS

Todos los cursos se rigen por el Manual del Estudiante USFQ que se puede descargar en Manual del
Estudiante:

- Es indispensable que cada estudiante tenga su mandil propio, guantes, fósforos, marcador de vidrio,
marcador de cera y manual de prácticas (el cual será entregado al profesor al final del semestre).
- Los estudiantes deben acordar una hora al día siguiente de la práctica para revisar los resultados.
- Queda prohibido el uso de celulares durante la práctica.
- El manejo adecuado del microscopio es indispensable para que los estudiantes aprueben el curso,
debido a que éste es un instrumento esencial dentro del análisis de muestras clínicas. Cualquier
mal uso de los instrumentos de laboratorio será sancionado.
- Se debe dar cumplimiento a las normas de bioseguridad en cada práctica (se explicarán en la
primera clase)
- Mantener el orden al finalizar cada práctica.
- Al inicio de cada práctica, los estudiantes deberán entregar el informe de la semana anterior para ser
corregido, no se aceptarán informes atrasados. En casos justificados los informes serán recibidos y
calificados sobre un punto menos por cada día de atraso en la entrega. Si por motivos no justificados
algún estudiante no asiste a la práctica, ésta no podrá ser recuperada y la nota del informe será
0(cero).
- Los informes se elaborar por grupo, si algunos miembros de grupo se quejan de que un miembro no
participa de forma equitativa, el estudiante que no participa tendrá la mitad de la nota que tiene el
grupo.
- Es obligatorio que todos los miembros del grupo observen los resultados, no se permite enviar un
representante.
- El curso estará regido por el código de honor de la USFQ.

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 CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES I SEMESTRE 2017-2018

Semana de laboratorios Tema de clase

28 agosto-01 septiembre Introducción, Syllabus, bioseguridad y sistema de evaluación.

04 septiembre-08 septiembre 1. Medios de Cultivo y métodos de siembra

11 septiembre-15 septiembre 2. Microscopía y Tinciones

18 septiembre-22 septiembre 3. Identificación de cocos Gram positivos (Staphylococcus sp.)

25 septiembre-29 septiembre 4. Identificación de cocos Gram positivos (Streptococcus y Enterococcus sp.)

5. Identificación de Enterobacterias del tracto gastrointestinal por bioquímicas
02 octubre-05 octubre
convencionales
5. Identificación de Enterobacterias del tracto gastrointestinal por bioquímicas
13 octubre
convencionales
6. Aplicación de galerías bioquímicas comerciales para identificación
16 octubre-20 octubre
fenotípica de Enterobacterias mediante Galeria API y Urocultivos

23 octubre-27 octubre 7. Prueba de Sensibilidad a antibióticos

30 octubre-03 noviembre Semana sin laboratorios

06 noviembre-10 noviembre EVALUACIÓN TEÓRICO-PRÁCTICA MEDIO SEMESTRE

8. Aplicaciones Inmunológicas en el diagnóstico microbiológico y
13 noviembre-17 noviembre
Microscopía de Fluorescencia (DAPI)

20 noviembre-24 noviembre 9. Conjugación, Hongos y Helmintos

27 noviembre-01 diciembre 10. Hemaglutinación viral

04 diciembre -08 diciembre
(feriado 06: clase de 11. Casos clínicos
compensación)
Lunes 11 de diciembre EXAMEN TEÓRICO FINAL 18:00

Este programa de estudio (syllabus) fue revisado y aprobado por la coordinación académica de
la carrera, por lo que todos los paralelos que se dicten deben regirse a este programa. En caso de que
sea necesario realizar cambios/ajustes al programa de estudio, debe solicitarlo a la coordinación
académica para que los cambios aprobados se reflejen en el sistema de Diseño Curricular.

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CÓDIGO DE HONOR DE LA USFQ
Es responsabilidad de todos los miembros de la USFQ obedecer y hacer respetar el siguiente Código:
I. Conducirme de tal manera que no debilite en ninguna forma las oportunidades de realización personal y
profesional de otras personas dentro de la Comunidad. Universitaria. Entre otras acciones, evitaré la calumnia, la
mentira, la codicia, la envidia, y promoveré la bondad, el reconocimiento, la felicidad, la amistad, la solidaridad y
la verdad.
II. Ser honesto: no copiar, plagiar, mentir ni robar en ninguna forma. Firmar todo trabajo académico como
constancia de cumplimiento del Código de Honor, de que no he recibido ayuda ni he copiado de fuentes no
permitidas. Mantener en reserva pruebas, exámenes y toda información confidencial, sin divulgarla.
III. Respetar a todos los miembros de la comunidad universitaria y cuidar el campus, su infraestructura y
equipamiento.
IV. No difamar.
V. Denunciar al Decano de Estudiantes toda acción de irrespeto al Código de honor por parte de cualquier
miembro. Cooperar con la Corte de Honor para aclarar cualquier investigación y violación de este Código.
Cualquier infracción a este código por parte de un miembro de la Comunidad USFQ será sancionada por la
autoridad correspondiente de acuerdo con el respectivo procedimiento. Para mayor información, acuda al
Decanato de Estudiantes.

HONESTIDAD ACADÉMICA Y PLAGIO

La copia, plagio o cualquier acción fraudulenta en exámenes o en trabajos asignados resultará en una nota de “0”
para esa tarea los estudiantes involucrados serán procesados conforme a lo establecido en las regulaciones de la
USFQ.
Cometer plagio en los trabajos (es decir, utilizar material que no es suyo sin citar la fuente de dónde lo obtuvieron)
es deshonesto. Además, no es evidencia de su propio pensamiento y aprendizaje. Si usted utiliza ideas o palabras
de otra persona, DEBE CITAR SU FUENTE. En caso de no citar fuentes del Internet, libros, revistas, entrevistas,
artículos, etc., obtendrá por nota una “F” en su trabajo y podrá recibir otros castigos disciplinarios de acuerdo con
las regulaciones de la Universidad.

Este manual fue escrito por varios instructores y profesores del Instituto de
Microbiología de la Universidad San Francisco de Quito.

9
 INTRODUCCIÓN

SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

OBJETIVO:

1. Comprender y aplicar las normas de bioseguridad a tener en cuenta dentro del laboratorio de
microbiología patógena.

NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO

 Está prohibido fumar, comer, beber, aplicarse cosméticos y tener alimentos en el laboratorio.
 El uso de mandil con mangas largas es obligatorio.
 En caso de que el estudiante tenga heridas, éstas deben ser cubiertas con gasa.
 La mayoría de prácticas requieren el uso de guantes.
 NO llevar objetos a la boca.
 En caso de derrame de sustancias contaminantes, notificar de inmediato al instructor responsable.
 Todos los accidentes: heridas, pinchazos o ruptura de recipientes de vidrio deben ser notificados de
inmediato.
 Las puertas y ventanas del laboratorio permanecerán cerradas durante las prácticas.
 Todo material corto-punzante debe ser depositado en el recipiente correspondiente.
 Todo material contaminado debe ser desechado en el sitio destinado para esto.
 El acceso al laboratorio de prácticas sólo está permitido a los alumnos que estén inscritos en el curso. No
se admiten visitas por razones de seguridad.
 Se deben usar los mecheros Bunsen con precaución, no dejando material inflamable cerca y evitando el
posible contacto con cabello y prendas de vestir.
 Comprobar que los mecheros se encuentran apagados y la válvula de gas cerrada al abandonar el
laboratorio.
 Limpiar el área de trabajo con un papel empapado en alcohol antes de abandonar el laboratorio.
 Lavarse las manos con abundante jabón antes de salir del laboratorio.

NORMAS DE SEGURIDAD BÁSICAS PARA USAR EL MECHERO DE BUNSEN

 Antes de usar el mechero verifique que las válvulas 1 y 2 del mechero se encuentran cerradas.
 Si percibe olor a gas informe inmediatamente al instructor
 Antes de encender el mechero verifique que sus guantes y mesón no tengan trazas de alcohol
 El pelo largo se debe recoger.

11
¿QUÉ HACER EN CASO DE UN INCENDIO?
 En guantes: retirar los guantes inmediatamente y llevar las manos al lavabo más cercano.
 En prendas de vestir: activar la ducha de seguridad y permanecer debajo del flujo de agua hasta comprobar
que la llama se extinguió.
 En el laboratorio en general: Pedir ayuda inmediatamente a instructores, personal de seguridad o de planta
física de la USFQ.
 Incendio con salidas bloqueadas: Usar extintor.

CLASIFICACIÓN DE DESECHOS

Infecciosos Cortopunzantes 1
Comunes Hisopos Cortopunzantes 2 Especiales
Guantes
Material que no haya hecho Palillos agujas, bisturíes, placas Recipientes vacios que hayan
Material que haya hecho contacto con líquidos portaobjetos rotas, placas contenido reactivos,
contacto con líquidos biológicos Puntas plásticas petrirotas medicamentos etc.
biológicos Asas plàsticas

PARA LA PRÓXIMA CLASE TRAER POR GRUPO: 1 CAJA DE LATA Y 1 botella plástica vacía de agua capacidad 5
litros.

PREGUNTAS

1. Razona y explica por qué las siguientes normas de seguridad son importantes durante el trabajo de laboratorio

a. Se prohíbe fumar, comer, beber, aplicarse cosméticos y tener alimentos en el laboratorio

b. El uso de mandil con mangas largas es obligatorio
c. En caso de derrame de sustancias contaminantes, notificar de inmediato
d. Lavar las manos con abundante jabón antes de salir del laboratorio.

12
2. Las siguientes son especies bacterianas que se utilizarán durante las prácticas de laboratorio de microbiología
patógena. Junto a cada especie, escribe las enfermedades que estos microorganismos podrían causarte si no
cumples con las normas de seguridad establecidas para el curso.

Microorganismo Enfermedades que estos microorganismos podrían causarte

Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Streptococcus viridans
Streptococcus agalactiae
Enterococcus faecalis
Klebsiella pneumoniae
Escherichia coli
Proteus miriabilis
Pseudomonas aeruginosa
Citrobacter freundii

3. Elabora una tabla en la que se describa la microbiota comensal en el ser humano (revisar libro de Murray
edición 7)

Notas:
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 PRÁCTICA 1: MEDIOS DE CULTIVO Y MÉTODOS DE SIEMBRA

OBJETIVOS:

1. Aplicar el método aséptico de siembra y comprender la importancia del mismo.

2. Observar las diferencias morfológicas que existen entre las colonias bacterianas de la misma especie, de
diferentes especies y sembradas en diferentes medios de cultivo.
3. Conocer las diferentes condiciones en las que se cultivan las bacterias, dentro de esto, conocer los
diferentes tipos de medios de cultivos que se utilizarán en el transcurso del curso y entender su
aplicabilidad.
4. Conocer el principio de los diferentes medios de cultivo.

PARTE I: MEDIOS DE CULTIVO

La identificación de microorganismos bacterianos patógenos se basa en la asociación de su aislamiento con la

presentación clínica de una enfermedad. El aislamiento consiste en la aplicación de un procedimiento técnico de
laboratorio que facilita el crecimiento de las bacterias. Este procedimiento se denomina “cultivo” requiere la
reproducción de las condiciones ambientales y nutricionales que necesitan las bacterias para crecer. Por ello se
debe identificar los medios apropiados que cumplan con requisitos nutricionales específicos para su desarrollo.
Tipos de medios: Los medios de cultivo utilizados en microbiología se clasifican de acuerdo a las siguientes
características:

1. Consistencia:
 Medios de cultivo sólido: Hechos con una concentración de polisacárido solidificante extraído de algas
rojas al 1.5% (Agar). Ejemplo: Agar Sangre, Agar McConkey, TSI.
 Medios de cultivo semisólido: con una concentración de agar al 0.7%. Ejemplos: Medio SIM.
 Medios de cultivo líquidos: son los llamados caldos nutritivos como Caldo nutritivo, etc.

2. Selectividad de crecimiento:
 Medios selectivos: La adición de compuestos con actividad inhibitoria del crecimiento de un grupo
particular de bacterias en el medio, le confiere esta característica de selectividad sobre un grupo
diferente de bacterias. Ejemplo: Agar McConkey, en el cual la adición de sales biliares y cristal violeta
inhibe el crecimiento de bacterias Gram positivas, haciéndolo selectivo para el aislamiento de
enterobacterias.
 Medios específicos: diseñados para el aislamiento e identificación de un solo tipo de bacterias (gènero
o especie). Ejemplo: Agar TCBS para Vibrio cholerae.
 Medios diferenciales: Diseñados para la identificación de diferentes grupos de bacterias de acuerdo a
sus propiedades metabólicas. Ejemplo: Agar Manitol salado, la fermentación del carbohidrato manitol

14
 se evidenciada a través del cambio de color del indicador rojo fenol, sirve para diferenciar especies
de Staphylococcus.
 Medios enriquecidos: Son capaces de promover el crecimiento de una amplia variedad de
microorganismos. Por ejemplo el agar Sangre humana Medios de transporte: son medios que se usa
para el transporte y preservación de muestras clínicas. Ejemplo: Medio de transporte Cary Blair, es un
medio que contiene baja cantidad de nutrientes, lo cual evita la replicación bacteriana, pero mantiene
la viabilidad bacteriana.

3. Condiciones especiales de incubación

 Disponibilidad de Oxígeno:
 Ambiente aerobio: crecimiento con disponibilidad de oxígeno. La mayoría de bacterias cultivables.
 Ambiente anaerobio: crecimiento con alta disponibilidad de CO2. De gran utilidad en la
identificación de anaerobios estrictos como Clostridum botulinum
 Ambiente microarofílico: Baja concentración de oxígeno y una concentración entre el 5 y 10% de
CO2.
 Temperatura: La temperatura óptima de la mayoría de microorganismos patógenos es 37 oC. Sin embargo
existen bacterias que logran un crecimiento óptimo a temperaturas mayores o menores.

 pH: Controlado en el mismo medio por sistemas tampón. Impide que los productos del metabolismo
bacteriano inhiban el crecimiento de los microorganismos cultivados.

15
PROTOCOLO PARA LA PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

1. Pesar en una balanza la cantidad exacta de Se prepararán 100 ml de

medio de cultivo liofilizado. A parte, medir en una Agar Sangre Humana
probeta el volumen de agua destilada requerido. (ASH)

2. Mezclar en una botella con tapa el agua y el

medio de cultivo liofilizado. Se puede disolver en
microondas a fin de disolver el agar.

3. Enviar al autoclave por 15 minutos a 121°C.

4. Dejar enfriar hasta una temperatura de 45°C, y En el caso del ASH se

añadir los suplementos de acuerdo al medio de deberán adicionar 5% de
cultivo. Mezclar hasta homogenizar y sin formar sangre humana obtenida
burbujas. de manera estéril: 5ml

5. Repartir en cajas Petri estériles. Antes de

Para repartir se deberá
repartir se deberán rotular las bases de las cajas
trabajar en un radio de
con el nombre del medio de cultivo y la fecha de
15cm de un mechero
elaboración.

6. Permitir que el medio de cultivo se solidifique

al ambiente por 12 horas y guardar en
refrigeración hasta su uso.

7. Llevar una de las cajas a incubación a 37°C en

aerobiosis por 24 horas. Observar que no crezcan
colonias bacterianas en la superficie o dentro del
medio de cultivo: Control de esterilidad

Figura 1.1- Preparación de medios de cultivo

RESULTADOS

PARTE I: dibujar y describir el medio realizado por cada grupo (color, contextura, etc.). Si hubo alguna falla explicar
cuáles fueron las razones para que esto suceda.

16
PARTE II: MÉTODOS DE SIEMBRA

Los cultivos bacterianos pueden ser obtenidos por un subcultivo (cuando se transfieren microorganismos de un
medio de cultivo a otro) o por siembra directa de una muestra clínica. Dado que en la mayoría de ambientes
existen microorganismos en el aire y/o en las superficies, es importante utilizar un método aséptico de
transferencia de microorganismos.

MATERIALES:

 Medios de cultivo: Agar McConkey Lactosa (MKL), Agar Sangre Humana (ASH), Agar Nutritivo (AN); asa de
punta circular metálica; cultivos bacterianos de: Staphylococcus aureus, Escherichia coli y un cultivo mixto.

PROCEDIMIENTO:

Figura 1.2- Pasos del método aséptico.

1. Marcar e identificar las cajas/tubos a los que va a transferir, poner el nombre del grupo del laboratorio, la
fecha del pase y el microorganismo.
2. Tomar la caja/tubo con el cultivo bacteriano a utilizar.
3. Esterilizar el asa llevándola al rojo vivo en el calor, y luego enfriar sobre el medio de cultivo (en un lugar
donde no haya crecimiento de colonias).
17
 4. Tomar con la punta del asa una colonia bacteriana aislada y proceder a realizar la siembra del inóculo
primario (inicial) según lo indicado en la figura 1.1
5. Volver a esterilizar el asa, y luego de enfriarla realizar el segundo grupo de estrías, pasando tres veces
dentro del inóculo inicial y tres veces fuera. Repetir este paso para los tercero y cuarto inóculos.
6. Una vez finalizada la transferencia, esterilizar el asa y colocarla en un lugar seguro.
7. Incubar a 37ºC por 18 horas asegurándose que las tapas de las cajas Petri estén hacia abajo. Observar los
resultados al día siguiente y graficar en la tabla.

Resultados parte II:

Realizar una tabla que describa los resultados obtenidos. Esta tabla debe contener un título y una breve
descripción.

HOJA DE TRABAJO EN CLASE

Resultados parte I: dibujar y describir el medio realizado por cada grupo (color, contextura, etc.). Si hubo alguna
falla explicar cuáles fueron las razones para que esto suceda.

MEDIOS DE CULTIVO Y MÉTODOS DE SIEMBRA

E. coli S. aureus Cultivo mixto

MKL MKL MKL

ASH ASH ASH

Descripción
de morfología
de colonias: AGAR NUTRITIVO AGAR NUTRITIVO AGAR NUTRITIVO
Forma

Color
MANITOL MANITOL MANITOL
Textura

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PREGUNTAS:

1. Explica por qué los siguientes pasos son esenciales para mantener asepsia durante la realización de un
subcultivo.

 Flamear el asa antes y después de la inoculación

 Mantener la tapa del tubo en la mano mientras se toma el inoculo.
 Dejar enfriar el asa antes de tomar el inoculo

2. Los medios de cultivo se clasifican de acuerdo a su composición, ¿Cuál es la particularidad de cada uno de ellos?

 Medios enriquecidos
 Medios diferenciales o de aislamiento
 Medios selectivos e inhibidores
 Medios de transporte

Notas:
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PRÁCTICA 2: MANEJO DEL MICROSCOPIO Y TINCIONES

OBJETIVOS:

1. Desarrollar destrezas para manejar correctamente el microscopio.

2. Entender de manera práctica, el principio de las tinciones Gram y Ziehl Nielsen.

PARTE I: EL MICROSCOPIO

Los microscopios compuestos son instrumentos de precisión que cuentan con dos sistemas de lentes: el ocular y
el objetivo. La imagen del objeto es magnificada gracias a la acción de los dos juegos de lentes. El lente objetivo
proporciona el aumento inicial, mientras que el ocular amplifica la imagen primaria por segunda vez. Cada uno de
los microscopios tiene cuatro lentes objetivos que proporcionan una resolución diferente. Los objetivos de bajo
poder amplifican el objeto 5 y 10 veces respectivamente (5x y 10x); el objetivo de alto poder en seco amplifica el
objeto aproximadamente 40 veces y el objetivo de alto poder en aceite de inmersión amplifica el objeto en
aproximadamente 100 veces. Debido a que el ocular aumenta 10 veces, la resolución total combinada que se
logra con cada objetivo es de 50, 100, 400 y 1000 veces respectivamente.

PARTES DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO

Figura 2.1- Composición estructural de un microscopio óptico.

Sistema óptico:
 OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del objetivo.
 OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta 5x, 10x, 40x y 100x.
 CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación.
 DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.
 FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
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Sistema mecánico:

 SOPORTE: Sostiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.
 PLATINA: Lugar donde se coloca la preparación.
 CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular o binocular.
 REVÓLVER o PORTAOBJETIVOS GIRATORIO: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar,
cambiar los objetivos.
 TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico que consigue el
enfoque correcto gracias a desplazamientos muy pequeños de la platina.

MANEJO Y CUIDADO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO

1. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con el dispositivo móvil. Comprobar previamente que
el objetivo de menor aumento está en posición de empleo. (5x)
2. Colocar el objetivo de 5x y enfocar acercando al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando
el tornillo macrométrico. No hacer esta operación mirando por el ocular. Bajar el tubo lentamente con el
macrométrico observando por el ocular hasta que se observe un enfoque nítido.
3. Pasar al objetivo de 10x. La imagen debe estar casi enfocada: afinar el foco con el micrométrico. Si la
imagen no está ni medianamente enfocada, es preferible volver a un enfoque con el objetivo de 5x.
4. Pasar al objetivo de 40x. La imagen debe estar casi enfocada: afine el foco con el micrométrico. Si la imagen
no está ni medianamente enfocada, es preferible volver a un enfoque con el objetivo de 10x. El objetivo
de 40x trabaja muy cerca de la preparación y por ello es susceptible de dos tipos de accidentes: ser
estrellado en la preparación cuando se descuidan las precauciones descritas para su enfoque (p.ej.
empleando el macrométrico) y resultar manchado con aceite de inmersión si se observa una preparación
ya usada con el objetivo de 100x.

Empleo del objetivo de inmersión:

1. Después del enfoque con el objetivo de 40x, girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a
medio camino entre éste y el de 100x.
2. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el punto de luz.
3. Girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión, asegurándose de que éste no
toca la preparación pero sí la gota de aceite.
4. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. Retirar la preparación y limpiar el objetivo de inmersión
cuidadosamente empleando un algodón con alcohol. Comprobar también que el objetivo de 40x está
perfectamente limpio.

NORMAS QUE SE DEBEN RECORDAR

El buen funcionamiento del microscopio depende del uso correcto y del mantenimiento adecuado. Al respecto de
este último, a continuación se dan algunas normas útiles:

21
  Mantener el microscopio por lo menos a 10 centímetros del borde de la mesa del laboratorio.
 No tocar los lentes con los dedos: el sudor contiene grasa que los puede dañar u opacar. Para limpiarlos
se debe utilizar papel para lentes.
 Limpiar los lentes del microscopio después de usarlo utilizando ÚNICAMENTE los papeles ESPECÍFICOS
para limpieza de lentes de microscopio.
 No permitir que ningún reactivo químico ni agua u otro fluido entre en contacto con alguna parte del
instrumento.
 Al terminar la práctica de laboratorio, asegurarse de que siempre esté el objetivo seco de menor aumento
(5) en posición de trabajo.
 Desconectar el enchufe de luz sujetando firmemente del enchufe, no tirar del alambre.
 Nunca arrastrar el microscopio sobre la mesa.

ERRORES MÁS COMUNES

 Lentes sucios que impiden la correcta observación.

 No centrar bien el objetivo.
 Falta de iluminación apropiada.
 No observar el sitio correcto sobre el portaobjeto, es decir, en el sitio donde se encuentra la muestra. Es
importante trabajar cuidadosamente con los tornillos macrométrico y micrométrico con el fin de lograr
enfocar correctamente: deben moverse lentamente y repetidamente hasta obtener imagen.

Como material de apoyo puedes revisar el siguiente link: http://www.youtube.com/watch?v=LXbWgRwXFPk

PARTE II: TINCIÓN GRAM

Cada grupo realizará, a partir de un cultivo, 4 placas (grupo 1: cocos Gram+, grupo 2: cocos Gram-, grupo 3: bacilos
Gram -, grupo 4 bacilos Gram + y grupo 5 un cultivo mixto: coco Gram+ y un bacilo Gram-).

22
1. Colocar una gota de solución salina 0.9% en un Hacer 4 placas de
cubreobjetos limpio. cada tipo de cultivo

2. Tomar con la punta de un palillo estéril una

colonia bacteriana y disolverla en la gota solución
salina. Dejar secar al ambiente o en la estufa.

3. Fijar el frotis pasándolo por 1 segundo por el

calor de una llama.

4. Añadir Cristal Violeta sobre la placa y dejarlo

actuar por un minuto. Dejar caer el excedente en
la caja de coloración y lavar con agua.
Realizarlo para las placas 1 a 4.

5. Añadir Yodo Gram sobre la placa y dejarlo

actuar por un minuto. Dejar caer el excedente en
la caja de coloración y lavar con agua.
Realizarlo para las placas 2, 3 y 4.

6. Decolorar durante 10 a 30 segundos con una

solución de Alcohol-Cetona (acetona 30ml + 70ml
de alcohol). Dejar caer el excedente en la caja de
coloración y lavar con agua.
Realizarlo para las placas 3 y 4.

7. Añadir Safranina sobre la placa y dejarlo actuar

por 30 segundos. Dejar caer el excedente en la
caja de coloración y lavar con agua.
Realizarlo para la placa 4.

8. Secar las placas al ambiente o en la estufa,

Observar al microscopio.

Figura 2.2 Procedimiento de la coloración de Gram.

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 HOJA DE TRABAJO EN CLASE

Resultados parte II: En la tabla a continuación, describe o grafica lo que observas en cada paso de la tinción.

PROCEDIMIENTO Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Grupo 5

Tinción con Cristal

Violeta

Placa 1

Tratamiento con Yodo

Placa 2

Decoloración con
Alcohol Acetona

Placa 3

Tinción de contraste con

Safranina

Placa 4

PARTE III: TINCIÓN ZIEHL NEELSEN

La tinción de Ziehl Neelsen sirve para identificar al grupo bacteriano de las micobacterias, que debido a su
característica pared celular son capaces de resistir a la decoloración por alcohol-ácido, por lo que se las denomina
Bacilos Alcohol-Ácido Resistentes (BAAR). Normalmente los organismos ácido resistentes no se tiñen bien con la
coloración Gram (aunque eventualmente las micobacterias pueden ser Gram positivas). Se cree que el alto
contenido lipídico (ácidos micólicos) de la pared celular de las micobacterias es responsable del teñido inicial débil
y de la fuerte retención que sigue a una tinción prolongada.

24
Pasos de la coloración Ziehl Neelsen:

1. Fijar el frotis al calor, de igual manera que para el frotis de Gram.

2. Cubrir con carbolfucsina, calentar con cuidado para vaporizar por cinco minutos sobre flama directa.
3. Lavar con agua.
4. Decolorar con alcohol ácido hasta que sólo permanezca un tenue color rosa (3 a 5 minutos).
5. Lavar con agua.
6. Contrateñir por 10 a 30 segundos con azul de metileno de Loffler.
7. Lavar con agua y dejar secar.
8. Observar y graficar las placas positivas entregadas por el instructor.

Resultados parte III: Dibuja como se observan las bacterias con la tinción de Ziehl Neelsen.

PREGUNTAS:

1. Realiza un esquema (o un dibujo) de la pared de bacterias Gram + y Gram – en el cual se explique las
diferencias que se observan en la tinción Gram.
2. Indica la importancia del manejo apropiado de un microscopio.
3. ¿Cuál es el principio de la tinción Ziehl Neelsen?¿Cuál es su utilidad (sensibilidad- especificidad) para el
diagnóstico de M. tuberculosis?

NOTAS:
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PRÁCTICA 3: COCOS GRAM POSITIVOS: GÉNERO STAPHYLOCOCCUS

OBJETIVOS:

1. Aprender a utilizar los medios de cultivo y pruebas de laboratorio requeridas para aislar e identificar las
especies más comunes de Staphylococcus sp. aislados de muestras clínicas.
2. Diferenciar dónde Staphylococcus spp. es microbiota normal o es responsable de una infección.

INTRODUCCIÓN

Los cocos Gram positivos (CG+) son bacterias aisladas rutinariamente a nivel clínico, son agentes etiológicos
frecuentes de infecciones humanas. La composición bioquímica de la pared de las bacterias Gram positivas (mayor
proporción de peptidoglicano), que les confiere resistencia a detergentes, calor y luz solar.

Morfológicamente al microscopio pueden sugerir la presencia de los siguientes géneros:

 Forma en racimos de uvas: sugerentes de Staphylococcus spp., cuya infección tiende a ser localizada
(pústulas).

 Forma de cordones o rosarios: sugerentes de Streptococcus spp. o Enterococcus spp, frecuentemente

asociados a faringitis.

La acumulación de pus es típica de la infección CG+ de ahí su denominación de “cocos piógenos”. La identificación
en laboratorio de CG+ se basa fundamentalmente en su excelente crecimiento en agar sangre, el color y forma de
las colonias debe también ser observado.

Staphylococcus son cocos Gram positivos, la mayor parte de los cuales constituyen la flora comensal del ser
humano de piel y mucosas. Las especies que se asocian con mayor frecuencia a infecciones son: Staphylococcus
aureus, Staphylococcus saprophyticus* y Staphylcococcus coagulasa negativo (ConS*)

* Nota: Con las pruebas de esta práctica solo podemos determinar Staphylcococcus coagulasa negativo o en el
caso de realizarse la prueba de novobiocina se puede determinar un Staphylococcus saprophyticus.

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 PRUEBAS PARA IDENTIFICAR ESPECIES DE Staphylococcus

PRUEBA DE CATALASA: La catalasa es una enzima que rompe el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno, se
emplea para diferenciar los Staphylococcus spp. de Streptococcus spp. y Enterococcus spp.

2H2O 2H2O+O2
Catalasa

PRUEBA DE COAGULASA: Ésta prueba sirve para diferenciar S. aureus (interés clínico) del resto de Staphylococcus,
la coagulasa es una enzima termoestable similar a la trombina que transforma el fibrinogeno en fibrina, para
realizar ésta prueba se usa plasma de conejo, la prueba se visualiza a las 4 horas, si existe presencia de coágulo la
prueba se considera positiva si es negativa, se debe espera 18 horas más, para confirmar.

PRUEBA DE NOVOBIOCINA: Sirve para diferenciar S. saprophyticus de otros Staphylococcus coagulasa negativos,
se debe realizar una escala Macfaland 0.5 con la bacteria sospechosa, realizar una siembra en un medio Muller
Hinton, colocar un disco de Novobiocina de 5ug en el centro del agar e incubar la caja por 24h a 37oC, al siguiente
día medir el halo de inhibición, un halo superior o igual a 16mm se considera sensible, halo menor a 16mm se
considera resistente.

PRUEBA MANITOL SALADO: Es un medio selectivo diferencial, selectivo por su alta concentranción de cloruro
sódico 7.5%, el cual permite la inhibición de una gran cantidad de bacterias excepto Staphylococcus spp. el manitol
es un medio diferencial por el carbohidrato manitol, el cual puede ser fermentado por S. aureus y algunas cepas
de S. saprophyticus, cuando un Staphylococcus consume el manitol, produce una acidificación del medio, la cual
se detecta por el indicador rojo fenol, el cual provoca un cambio del medio de rojo a amarillo. La mayoría de
Staphylococcus coagulasa negativos no pueden consumir el manitol y conservan el color original del medio.

27
 Tabla 3.1- Pruebas bioquímicas para diagnóstico de Staphylococcus spp.

Prueba Reactivo o medio Técnica Resultado

Catalasa Colocar una gota Con un palillo tomar 1 colonia La presencia de burbujas
de peróxido de bacteriana y hacer contacto indica que la bacterias son
hidrógeno (H2O2) con la gota de H2O2 productora de catalasa
en una placa
portaobjetos

Coagulasa en 500 ul de plasma Con un palillo o con un asa Incubar a 37oC, por 4h ver
tubo de conejo metálica tomar de 2 a 3 resultados, formación de
colonias bacterianas e inocular coagulo reacción positiva, si
en el tubo que contiene el a las 4h no se observa
plasma. coagulo confirmar a las 18
horas.

Novobiocina Macfarland 0.5, Realizar una suspensión 0.5 Halo ≥ 16mm Sensible
caja de Muller MacFarland e inocular en una Halo < 16mm Resistente
Hinton y Disco de caja de Muller Hinton en 4
Novobiocina 5ug direcciones, en el centro
colocar un disco de
Novobiocina

Manitol salado Caja de agar Inocular bacteria con hisopo. Colonias amarillas fermenta
manitol salado el manitol
Colonias rosadas o rojas no
fermenta el manitol

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 Colonias: grandes (2-3 mm), convexas, cremosas y pigmentadas.  Coloración amarilla: Staphylococcus aureus
1. Observación de las colonias en ASH
Observar presencia o no de hemólisis en agar sangre.  Coloración blanca: Staphylococcus epidermidis

Poner en un portaobjetos una gota de peróxido de hidrogeno a 3%

e introducir el asa con bacterias. En caso de ser positivo, se  Catalasa (+): Staphylococcus
2. Prueba de la Catalasa
desprenderán burbujas. Esta reacción se da debido a la presencia  Catalasa (-): Streptococcus
de la catalasa, la cual reduce el H2O2 en 2H2O + O2

En 300 μl de plasma, colocar de 1 a 3 colonias bacterianas. Incubar

3. Prueba de la Coagulasa en tubo  Coagulasa (+): Staphylococcus aureus
por 18 a 24 horas a 37°C y observar la formación de un coágulo.

Sembrar una colonia bacteriana en Agar Manitol Salado . La  Manitol (+) y Coagulasa (+): S. aureus
4. Prueba del Manitol Salado fermentación del manitol (colonias de color amarillo) se considera  Manitol (+) Coagulasa (-): S. saprophyticus y S.
como una prueba positiva. epidermidis

1. Suspender las colonias sospechosas en solución salina (turbidez

McFarland 0.5) y con un hisopo sembrarla de manera tupida en un
medio de Muller Hinton.
5. Prueba de la Sensibilidad a la  Novobiocina Resistente: S. saprophyticus
2. Colocar un disco de Novobiocina en el centro del estriado,
Novobiocina  Novobiocina Sensible: S. epidermidis
incubar por 24 horas a 37°C y observar la sensibilidad. La
resistencia a la Novobiocina está indicada por una zona de
inhibición menor o igual a 16 mm.

Figura 3.1- Pruebas para la identificación bioquímica de Staphylococcus sp.

29
 Tabla de resultados esperados de acuerdo a las especies de Staphylococcus

Bacteria GRAM Catalasa Manitol Coagulasa Novobiocina

Staphylococcus aureus CG+ positivo Positivo Positivo Sensible

Staphylococcus coagulasa negativo

CG+ positivo Negativo Negativo Sensible
(ConS)

Staphylococcus saprophyticcus CG+ positivo Variable Negativo Resistente

HOJA DE TRABAJO EN CLASE

Observaciones en: Caso 1 Caso 2 Caso 3

GRAM

CATALASA

COAGULASA

NOVOBIOCINA

MANITOL SALADO

MORFOLOGÍA COLONIAS

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Ejercicio 1:

Resolver los casos planteados en clase. Realizar el informe microbiológico de la muestra clínica
con el formato indicado: no olvidar utilizar las instrucciones del sílabo para el desarrollo y análisis
del mismo. Graficar el algoritmo utilizado para resolver cada caso.

PREGUNTAS:

1. Llena la información solicitada en el cuadro que se muestra a continuación

Enfermedad que Lugares del cuerpo humano en los que se

Microorganismo puede causar encuentran como microbiota normal

Staphylococcus aureus

Stapylococcus lugdunensis

Staphylococcus saprophyticcus

2. ¿A qué se conoce como Staphylococcus aureus meticilino resistente (MRSA) y

cuál es su importancia epidemiológica? (máximo 5 líneas)

3. Enumera 4 factores de patogenicidad de Staphylococcus aureus

NOTAS:
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PRACTICA 4: COCOS GRAM POSITIVOS: GÉNERO
STREPTOCOCCUS Y ENTEROCOCCUS

OBJETIVOS:

1. Diferenciar los medios de cultivo y pruebas de laboratorio requeridas para aislar e

identificar las especies más comunes de Streptococcus sp. a partir de muestras clínicas.
2. Reconocer y diferenciar donde las especies de Streptococcus y género Enterococcus son
microbiota normal o son responsables de infecciones.

INTRODUCCIÓN

Streptococcus sp. son cocos Gram positivos, catalasa negativos, aerobios facultativos, aunque
hay cepas que crecen mejor en condiciones reducidas de oxígeno. Este grupo está ampliamente
distribuido en la naturaleza, y algunos de ellos forman parte de la microbiota normal del ser
humano, mientras que otros se asocian a infecciones.

Los Streptococcus sp. de importancia médica son clasificados en base a la hemólisis que
producen en agar sangre y por la presencia o ausencia de los grupos específicos de carbohidratos
localizados en su pared celular (grupos de Lancefield).

La hemólisis en agar sangre se produce por la capacidad de las bacterias de hidrolizar los
eritrocitos en grado variable gracias a la producción de enzimas hemolíticas. La estreptolisina O
y estreptolisina S son ejemplos de estas enzimas. Si la lisis es completa, se habla de β hemólisis.
Si la lisis es incompleta se conoce como α hemólisis y da lugar a una pigmentación verdosa
alrededor de la colonia de la bacteria, y es una característica típica del grupo de S. viridans y la
ausencia de hemólisis se conoce como gama hemólisis.

Enterococcus sp. son cocos Gram positivos, catalasa negativos, aerobios y anaerobios
facultativos, son parte de la microbiota normal de intestino, toleran temperaturas entre 10 a
450C. y se distinguen por tener genes que les otorgan resistencia a agentes químicos y físicos.
Son bacterias con escasos factores de virulencia, oportunistas en pacientes
inmunocomprometidos y el principal problema de éste género es una elevada resistencia
intrínseca a una gran cantidad de antibióticos empleados normalmente.

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 TÉCNICAS PARA IDENTIFICAR Streptococcus spp. y Enterococcus spp.

BACITRACINA

Procedimiento:

1. Tomar con un hisopo de 3 a 4 colonias bacterianas y sembrar en la superficie de una

placa de agar sangre, como indica el gráfico

2. Colocar en el centro un disco de bacitracina de 0.04 U.

3. Incubar por 24 horas a 37°C en ambiente microaerofílico.

4. Al siguiente día cualquier halo de inhibición alrededor del disco de bacitracina.

Interpretación:

 Cualquier halo de inhibición alrededor del disco de bacitracina se considera sensible.

OPTOQUINA

Se usa para diferenciar entre Streptococcus pneumoniae y Streptococcus Grupo viridans

Procedimiento:

5. Con el mismo procedimiento anterior se siembra el microrganismo de prueba en la

superficie de una agar sangre y se deposita en el centro un disco de optoquina de 5ug
incubar por 24 horas a 37°C en en ambiente microaerofílico.
6. Al siguiente día medir con una regla el halo de inhibición.

Interpretación: Si se obtiene un halo ≥ 14mm se considera sensible, el Streptococcus

pneumoniae es sensible a este antibiótico (S), a diferencia de los otros Streptococcus Grupo
viridans que son resistentes.

PRUEBA DE BILIS ESCULINA

Principio:

Los Enterococcus y algunos Streptococcus hidrolizan la esculina para producir esculetina y

dextrosa, la esculetina reacciona con la sal férrica del medio para formar un complejo llamado
citrato férrico el cual forma un precipitado negro o marrón por cambio del indicador.

EL medio además contiene bilis de buey para inhibir las bacterias Gram positivas diferentes de
los Enterococcus.

33
Procedimiento:

Tomar 1 a 2 colonias bacterianas con una asa de estocada e inocular en un tubo de bilis esculina,
incubar por 24 horas a 37oC en ambiente microaerofílico.

Interpretación: Una prueba positiva se considera cuando el medio cambia a color negro y se
considera negativo cuando el medio conserva su color original.

PRUEBA DE CAMP: (Christie, Atkins and Much-Petersen)

Consiste en sembrar sobre una placa de agar sangre cordero una línea de Streptococcus (β
hemolítico) perpendicular a otra, pero sin tocarla de Staphylococcus aureus productor de β
lisina. La placa es luego incubada en atmósfera microarofílica.

 Fundamento: Esta prueba diferencia a los Streptococcus β hemolíticos del grupo B

(Streptococcus agalactiae) los cuales se caracterizan por producir el factor denominado
factor CAMP el cual va provocar un sinergismo de la lisis de los eritrocitos al unirse con
la β-lisina de S. aureus, produciendo en consecuencia una zona de lisis en forma de
punta de flecha en la intersección de las dos especies.

 Interpretación: la presencia del sinergismo en forma de flecha se considera positivo

para S. agalactie o Streptococcus del grupo B, la ausencia de flecha puede indicar otros
Streptococcus beta-hemoíticos.

34
MATERIALES REQUERIDOS:

 Cultivos de Streptococcus sp.

 Discos de bacitracina y optoquina
 Agar bilis esculina
 Agar Sangre cordero
 Tubos de bilis esculina

PROCEDIMIENTO

1. Realizar una tinción Gram de los cultivos de Streptococcus sp.

2. Realizar la prueba de la Catalasa

3. Observar el tipo de hemólisis

4. Realizar las pruebas de optoquina y bacitracina

5. Sembrar en bilis esculina

Resolver los casos planteados en clase. Realizar el informe microbiológico de la muestra clínica
con el formato indicado: no olvidar utilizar las instrucciones del sílabo para el desarrollo y análisis
del mismo. Graficar el algoritmo utilizado para resolver cada caso.

CASO 1: Streptococus sp., CASO 2: Streptococcus sp., CASO 3: Streptococcus sp., CASOS 4
Streptococcus sp. y 5: MUESTRA DE SECRECIÓN FARINGEA

HOJA DE TRABAJO EN CLASE:

Durante la clase, llenar el cuadro que se muestra a continuación según las pruebas realizadas a
cada especie bacteriana.

Observaciones Caso 1 Caso 2 Caso 3 Caso 4 Caso 5

HEMOLISIS
BACITRACINA
Si es β hemolítico
OPTOQUINA
Si es α hemolítico
BILIS ESCULINA
Si sospechas de
Enterococcus spp.
Prueba CAMP
Si es β hemolítico
CATALASA

35
PREGUNTAS

1. Cuál es la razón por la cual se incuba a los géneros Staphylococcus y Streptococcus en

ambiente microaerofílico?

2. Llena la información solicitada en el cuadro que se muestra a continuación

Microorganismo Enfermedad que puede Lugares del cuerpo humano en los que se
causar encuentran como microbiota normal
S. pyogenes

S. pneumoniae

S. agalactiae

OJO: Para la siguiente clase (Práctica: bacilos Gram negativos) traer una muestra de
heces fecales de humanos, de preferencia una muestra diarreica, la muestra tiene que
ser colectada el día anterior a la práctica.

Notas:
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PRÁCTICA 5: IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS DEL
TRACTO GASTROINTESTINAL POR BIOQUÍMICAS
CONVENCIONALES

OBJETIVOS:

1. Conocer los diferentes tipos de bacilos Gram negativos de interés médico y la

metodología convencional utilizada para identificarlos en el laboratorio.
2. Comprender las diferencias metabólicas que existen entre ellos.
3. Diferenciar la microbiota normal y la patógena de las Enterobacteriaceae según su sitio
de aislamiento.

INTRODUCCIÓN

Las bacterias tipo bacilos Gram negativos suelen agruparse en dos grandes familias: la
Enterobacteriaceae y la No Enterobacteriaceae. Ambos grupos se diferencian en que las
Enterobacteriaceae suelen oxidasa negativas (ausencia de la actividad de la citocromo oxidasa),
y fermentadoras de glucosa; mientras que las No Enterobacteriaceae suelen ser no
fermentadoras y oxidasa positivas.

La familia Enterobacteriaceae se encuentra ampliamente distribuida en la naturaleza. Sus

miembros habitan plantas, suelos y animales, incluyendo el ser humano en el cual forman parte
de la microbiota normal del tracto gastrointestinal. Los miembros más comúnmente asociados
a infecciones del tracto gastrointestinal son: Salmonella spp., Escherichia coli (patogénicas), y
Yersinia enterocolitica.

La familia No Enterobacteriaceae también está distribuida ampliamente en la naturaleza, sin

embargo no suelen relacionarse con enfermedades en humanos sino solamente de manera
oportunista. Uno de sus miembros más importantes es la Pseudomonas aeruginosa que se
encuentra en la tierra, en la materia orgánica en descomposición, en la vegetación y en el agua;
y posee una gran versatilidad en sus necesidades nutricionales, lo que amplía aún más su
distribución ambiental.

Identificación de los bacilos Gram negativos en el laboratorio:

Para el análisis microbiológico de los géneros bacterianos patógenos y no patógenos se utilizan

las diferencias metabólicas que existen entre una y otra especie.

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PARTE I

SIEMBRA DE MUESTRAS DE HECES EN MEDIOS SELECTIVOS PARA ENTEROBACTERIAS

MATERIALES:

Muestra de heces fecales, hisopos estériles, medios de cultivo McConkey Lactosa (MKL) y Agar
Salmonella-Shigella (SS).

PROCEDIMIENTO:

1. Tomar con un hisopo una parte de la muestra y realizar un inóculo primario en los
medios de cultivo MKL Y SS.
2. Realizar la siembra por estriación usando un asa bacteriológica.
3. Incubar las placas a 37°C por 18 horas y analizar las reacciones bioquímicas en las
mismas:
 Agar MacConkey: contiene sales biliares y cristal violeta que inhiben el crecimiento
de la mayoría de las bacterias Gram-positivas y algunas Gram-negativas. La
fermentación de lactosa hace virar el indicador a rojo. Aspecto de las colonias: Los
fermentadores típicos de lactosa (E. coli, Klebsiella spp. y Enterobacter spp.) dan
colonias rosas o rojas rodeadas de un halo de sales biliares precipitadas. Los
fermentadores débiles o lentos de lactosa (Citrobacter spp., Serratia spp.) pueden
dar colonias incoloras a las 24 h y rosadas a las 48 h. Proteus spp., Salmonella spp.,
Shigella spp. y Yersinia spp. dan colonias incoloras. Enterococcus spp. forma
pequeñas colonias.
 Agar Salmonella y Shigella: La diferenciación de los organismos entéricos se logra
mediante la incorporación de lactosa en el medio. Los organismos que fermentan
lactosa producen ácido que, en presencia del indicador rojo neutro, propicia la
formación de colonias de color rojo. Los organismos no fermentadores de lactosa
forman colonias incoloras. Este último grupo incluye la mayoría de los patógenos
intestinales, incluidos Salmonella y Shigella. El tiosulfato sódico y el citrato férrico
permiten la detección de producción de ácido sulfhídrico, como lo demuestran las
colonias con centros de color negro. Este medio se utiliza para el aislamiento
primario de Salmonella a partir de muestras fecales humanas. Dado que existen
medios más eficaces para el aislamiento de Shigella, no debe utilizarse para el
aislamiento de este organismo.

PARTE II: PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA IDENTIFICAR BACILOS GRAM NEGATIVOS

Antes de iniciar esta parte, realizar una placa y realiza una tinción Gram y observar al
microscopio.

MATERIALES:

Tubos de medio Triple Sugar Iron (TSI), tubos con agar citrato de Simmons (revisar
especificaciones del medio), tubos de medio SIM (revisar especificaciones del medio), tubo de
agar urea Christensen (revisar especificaciones del medio), tiras de papel con reactivo de
oxidasa (revisar especificaciones del reactivo), asa de estocada.

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PRUEBA DE LA OXIDASA

1. Tomar una colonia de un medio de cultivo que no de reacción de color (ej. Agar nutritivo,
Agar Sangre, etc.) con un palillo estéril y trazar rayas sobre la tira de papel. En caso de
ser positivo, el papel cambia de color pasando a azul obscuro o negro.
2. Realizar la prueba de oxidasa a una especie de Pseudomonas sp. (control positivo)

PRUEBA DE SIM (Sulfito, Indol, Movimiento)

1. Llevar el asa de estocada al fuego vivo para esterilizarla. Tomar con la punta una colonia
bacteriana e introducir en el medio de cultivo semisólido en línea recta hasta el fondo
del tubo. Retirar el asa.
2. Incubar a 37°C por 24 horas.
3. Luego de la incubación añadir una gota de Reactivo de Kovac al tubo. Este reactivo se
combina con el indol y forma un color rojo (positivo = formación de anillo rojo en la
superficie). Las bacterias que producen triptofanasa llevan a cabo la siguiente reacción:

Figura 5.1 – Reacción de la enzima Triptofanasa con triptófano.

4. Para determinar si hay motilidad observar si el crecimiento está solo en la línea de

picadura o si se extiende hacia los lados de ella. Esto puede observarse debido a que el
medio contiene baja concentración de agar.
5. Observar la presencia de H2S por la presencia de color negro en la línea de picadura.

PRUEBA DE CITRATO DE SIMMONS

1. Llevar el asa de estocada al fuego vivo para esterilizarla. Tomar con la punta una colonia
bacteriana y sembrar en la superficie inclinada del medio de cultivo. Retirar el asa.
2. Incubar a 37°C por 24 horas.
3. Luego de la incubación, observar la coloración del medio. El crecimiento de
microorganismos en este medio se debe a que son capaces de utilizar citrato como única
fuente de carbono y sales de amonio como única fuente de nitrógeno. El metabolismo
del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a través del
ciclo del ácido tricarboxílico. El medio entonces se alcaliniza, vira al azul y esto es
indicativo de la producción de citrato permeasa.

PRODUCCIÓN DE UREASA (UREA DE CHRISTENSEN)

1. Llevar el asa de estocada al fuego vivo para esterilizarla. Tomar con la punta una colonia
bacteriana y sembrar en la superficie inclinada del medio de cultivo. Retirar el asa.
2. Incubar a 37°C por 24 horas.

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 3. Observar el cambio en la coloración del medio. Cuando el microorganismo usa la urea
contenida en el medio de cultivo, lo transforma a amonio. La producción de amonio
produce una alcalinización del medio haciendo que el medio cambie de color
tornándose rosado fuerte por la presencia del indicador de pH rojo fenol.

FERMENTACIÓN DE GLUCOSA, LACTOSA Y SACAROSA (MEDIO TSI)

1. Llevar el asa de estocada al fuego vivo para esterilizarla. Tomar con la punta una colonia
bacteriana e introducir en el fondo del agar y luego sembrar en la superficie inclinada
del medio de cultivo. Retirar el asa.
2. Incubar a 37°C por 24 horas.
3. Observar la fermentación de los azúcares contenidos en el medio TSI (10 partes de
lactosa, 10 partes de sacarosa y 1 parte de glucosa). Si la bacteria fermenta los azúcares
un indicador de pH realiza el viraje de rojo a amarillo. La reacción alcalina (rojo) se
describe por la letra K, y la reacción ácida (amarilla) por la letra A. Se debe dar una
denominación K ó A a la parte del tubo inclinada sobre la parte del fondo del tubo.
4. Observar la producción de ácido sulfhídrico (precipitado negro) y gas (burbujas de aire
en el fundo del tubo).

HOJA DE TRABAJO EN CLASE

Bacteria SIM CITRATO UREA TSI

Caso 1

Caso 2

Caso 3

Caso 4

Caso 5

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Notas:
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 PRÁCTICA 6: APLICACIÓN DE GALERÍAS BIOQUÍMICAS
COMERCIALES PARA IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA DE
ENTEROBACTERIAS MEDIANTE GALERIA API Y UROCULTIVOS
OBJETIVOS

1. Aprender a utilizar este sistema de identificación como herramienta de microbiología

clínica.
2. Aprender a realizar un urocultivo.
3. Interpretar los resultados de un urocultivo.
4. Conocer los microorganismos que se aíslan frecuentemente en urocultivos positivos

INTRODUCCIÓN

Las galerías API son sistemas múltiples para diferenciar e identificar microorganismos mediante
el uso de pruebas bioquímicas. En esta práctica utilizaremos las Galerías del tipo API-20E para la
identificación de enterobacterias y otros bacilos Gram negativos no exigentes. La prueba consta
de 20 microtubos que contienen dentro de ellos sustratos deshidratados. Durante el periodo de
incubación (18-24 horas) el metabolismo de la bacteria actúa sobre los sustratos. Las veinte
reacciones son realizadas y leídas simultáneamente.
Mientras que el urocultivo o el cultivo de una muestra de orina, es uno de los procedimientos
más comúnmente solicitados en los laboratorios de microbiología. Como parámetro general, un
cultivo es considerado positivo para infección de vías urinarias cuando el crecimiento es mayor
a 100.000 (>105) unidades formadoras de colonias (UFC). Sin embargo hay varios factores que
beben tomarse en cuenta para determinar la positividad de un urocultivo, la siguiente tabla
muestra algunos de estos parámetros.

Tabla de interpretación de resultados de urocultivos (James Versalovic. Manual of Clinical

Microbiology. 10th Edition. ASM Press).
Tipo de espécimen y características de pacientes Número estimado de UFC que indican infección
Chorro medio, mujer con cistitis >102

Chorro medio, mujer con pielonefritis >105

Chorro medio, mujer con bacteriuria asintomática
>105
Chorro medio, hombre con infección del tracto urinario >103
Catéter recto, todos los pacientes >102
Aspiración Suprapúbica <102

Un recuento menor a 10.000 UFC/ml hace sospechar de una contaminación de la muestra,

especialmente si hay varios tipos de colonias, pues las infecciones urinarias son casi siempre
debidas a un sólo microorganismo. Las cifras intermedias son dudosas, y requieren la consulta
al médico y la repetición del análisis. Hay que tener presente que las muestras obtenidas por
punción suprapúbica o cateterismo aséptico no llevan contaminación, y debe considerarse
positivo cualquier recuento. La obtención y el transporte de las muestras deberán cumplir

42
condiciones de asepsia, antisepsia, y conservación rápidas para su análisis (máximo hasta dos
horas luego de su recolección).

Una vez que se ha determinado la positividad del cultivo, se deberá identificar el

microorganismo causante de la infección así como determinar su suceptibilidad a antibióticos.

PARTE I: APLICACIÓN DE GALERÍAS BIOQUÍMICAS COMERCIALES PARA IDENTIFICACIÓN

FENOTÍPICA DE ENTEROBACTERIAS MEDIANTE GALERIA API

MATERIALES

 Galerias API-20 E para el grupo de laboratorio

 Cultivos de bacilos Gram negativos aislados de diferentes muestras microbiológicas
 Tubos de solución salina
 Reactivos adicionales requeridos para el API: TDA, VP1, VP2, oxidasa, aceite de parafina.
 Agua destilada
 Pipetas Pasteur

PROCEDIMIENTO

1. Tomar con un hisopo 4 colonias bacterianas y suspenderlas en un tubo con Solución

Salina al 0.9% hasta obtener una turbidez McFarland de 0.5.
2. En el estuche de la galería añadir agua destilada a los receptáculos a fin de obtener
una atmósfera húmeda.
3. Colocar la Galería API-20E en el estuche.
4. Tomar con una pipeta Pasteur la suspensión bacteriana y repartirla en cada pocillo de
la siguiente manera:
 En los pocillos de CIT, VP y GEL llenar con el inóculo hasta la cúpula.
 En los pocillos para ADH, LDC, ODC, H2S, URE requieren atmósfera anaerobia
por lo cual el inóculo debe llenarse antes de la cúpula para luego poner aceite
mineral y crear la atmósfera necesaria.
 Los demás pocillos deben llenarse únicamente los tubos, no las cúpulas.
5. Incubar por 18 a 24horas a 37°C.
6. La interpretación de los resultados debe hacerse utilizando la Tabla de lectura para
luego llenar la hoja de identificación. Cada conjunto de reacciones tiene un valor, el cual
debe obtenerse con la guía de la hoja de lectura, para finalmente obtener un perfil
numérico del microorganismo a identificar. Este perfil numérico debe confrontarse al
catálogo analítico en donde obtendremos la identificación del microorganismo.

Resolver los casos planteados en clase. Realizar el informe microbiológico de cada uno de los
casos con el formato indicado: no olvidar utilizar las instrucciones del sílabo para el desarrollo y
análisis del mismo.

43
HOJA DE TRABAJO EN CLASE

44
PARTE II: UROCULTIVOS

MATERIALES

Medio de cultivo CLED, asas calibradas de 10 ul, muestra de orina.

PROCEDIMIENTO

1. Abrir el frasco con la muestra de orina e introducir el

asa calibrada en él. Realizar una pequeña agitación (sin
formar burbujas) y extraer el asa de manera
perpendicular. Observar que en el orificio del asa se haya
«cargado» con un poco de orina.

2. Estriar el asa cargada en el medio de cultivo CLED. Para

ello se realiza una inoculación primaria en el centro del
agar en forma longitudinal, luego se comienza a estriar en
forma perpendicular a la inoculación primaria hasta
cubrir todo el medio, las estriaciones deben estar
separadas una de la otra para poder aislar las colonias.

A. Usando la misma asa cargar una nueva gota y

colocarla sobre una placa portaobjetos. Secar al
3. Incubar a 37°C por 18 horas.
ambiente o en la estufa. Fijar con calor y realizar la
tinción Gram.

4. Retirar el cultivo de la incubadora y realizar un conteo B. Observar la placa en el microscopio e indicar los
de las UFC así como la reacción de fermentación de la elementos que se encuentren en la muestra tales
Lactosa. Extrapolar el valor obtenido a mililitros como bacterias, células epiteliales, o
multiplicándolo por 100. polimorfonucleares, etc.

5. Interpretar el resultado obtenido correlacionándolo Cada Grupo obtendrá un caso clínico que
con el resultado del Gram de gota fresca y los síntomas deberá resolver y compartir sus resultados con
del paciente. el resto de la clase.

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PREGUNTAS

1. ¿Cuál es la importancia de realizar un Gram de gota fresca?

2. Enumere 10 microorganismos que pueden ser causantes de IVU.
3. Enumere 2 factores de patogenicidad de E. coli uropatogénico.

HOJA DE TRABAJO EN CLASES

Resolver los casos planteados en clase y realizar el informe microbiológico de cada uno.

CASOS UFC/mL CONSUMO DE LACTOSA INTERPRETACIÓN

CASO 1

CASO 2

CASO 3

CASO 4

CASO 5

Notas:
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PRÁCTICA 7: PRUEBA DE SENSIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS

OBJETIVOS

1. Comprender la aplicabilidad de las pruebas de sensibilidad antimicrobiana.

2. Aplicar la técnica de antibiogramas por difusión en agar y aprender a leer e interpretar los
resultados.
3. Aplicar la técnica de antibiogramas por Epsilometría y aprender a leer e interpretar los
resultados.

INTRODUCCIÓN

El tratamiento adecuado de un proceso infeccioso está relacionado con 3 aspectos: 1) el sitio de

localización de la infección. 2) El conocimiento del agente etiológico de la enfermedad. 3) la
susceptibilidad del agente infeccioso a las drogas antimicrobianas.

Es por esto que la prueba de sensibilidad de los microorganismos a los antibióticos es una de las más
importantes de los laboratorios de microbiología clínica. El antibiograma define la capacidad in vitro de
un antibiótico de inhibir el crecimiento de una bacteria.

Los métodos más usados para determinar la susceptibilidad son:

 Difusión en disco o Kirby Bauer

 Concentración mínima inhibitoria
- Microdilución en caldo: automatizado y manual
- Gradiente de antibióticos: Epsilometría

Difusión en disco o Kirby Bauer

El medio de cultivo que se utiliza para las pruebas de sensibilidad por difusión en disco y gradiente es
el Muller Hinton porque en él crecen bien la mayor parte de las bacterias patógenas, y además no
contiene timina o timidina, que son inhibidores de sulfamidas y del trimetoprim (dos agentes
antimicrobianos muy utilizados).

Los antibióticos que se utilizan para este método están impregnados en un papel filtro en
concentraciones relacionadas con las que puede alcanzar dicho antibiótico en los líquidos orgánicos
(sangre, orina, etc.). El antibiótico se difunde radialmente a través de la superficie del agar a partir del
disco formándose un gradiente de concentración.

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Transcurridas 18 a 24 horas de incubación, los discos aparecen rodeados por una zona de inhibición.
Los halos de estas zonas de inhibición deben ser medidos con una regla por observación visual. Una vez
medidos los tamaños de las zonas de inhibición para cada antibiótico, se debe utilizar los valores de
referencia del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) y determinar si es sensible, resistente
o de sensibilidad intermedia.

Para la elección de los discos de sensibilidad, se debe tomar en cuenta el microorganismo aislado y el
proceso infeccioso en estudio.

MATERIALES

Tubos con solución salina al 0.9%, hisopos estériles, Agar Mueller-Hinton, regla.

PROCEDIMIENTO

1. A partir de una placa de cultivo de 18 a 24 horas tomar varias colonias con un hisopo,
introducirlo en el tubo con solución salina al 0.9%, agitar y ajustar el inóculo a una turbidez
equivalente al 0.5 de la escala de McFarland (equivalente a una concentración de bacterias de
(1.5 x108 UFC/ml). No hacer antibiograma de colonias no aisladas.

Figura 8.1- Ilustración de la preparación del inóculo.

2. Inmediatamente, introducir un nuevo hisopo dentro de la suspensión y al retirarlo rotar varias veces
contra la pared del tubo por encima del nivel del líquido con la finalidad de eliminar el exceso de líquido
en el hisopo.
3. Inocular las placas de Mueller-Hinton completamente, sin dejar ninguna zona libre. Esto se
consigue deslizando el hisopo por la superficie del agar dos veces, rotando la placa unos 90º
cada vez y pasándola por último por la periferia del agar para conseguir una siembra uniforme.

49
 4. Tomar los discos con pinzas estériles y colocarlos sobre la superficie del agar. Los discos no deben
situarse a menos de 15 mm del borde de la placa, y han de estar distribuidos de forma que no se produzca
superposición de los halos de inhibición. No se recomienda colocar más de 6 discos por caja Petri.
5. Incubar las placas invertidas (agar en la parte superior), en grupos no superiores a 5 placas, a
37°C en atmósfera aeróbica por 16-18 horas.
6. Retirar las cajas de la incubadora y medir el diámetro de las zonas de completa inhibición con
una regla sobre el reverso de la placa. Determinar la sensibilidad utilizando la tabla de Bauer
adjunta a la guía de laboratorio. Realizar una tabla con los resultados obtenidos incluyendo la
identificación del microorganismo, el tamaño de los halos de inhibición y si es sensible,
resistente o con sensibilidad intermedia a los antibióticos probados.

Gradiente de antibiótico: Epsilometría

E-test Vancomicina

Es un sistema que permite determinar cuantitativamente la concentración mínima inhibitoria de un

antibiótico frente a un microorganismo problema, el gradiente del antibiótico se encuentra
impregnado en una tirilla de plástico con 30 graduaciones, el intervalo es de 256-0.015 ug/ml.

Fundamento:

La tirilla que hace contacto con el agar previamente inoculado con la bacteria problema, el antibiótico
comienza a liberarse del plástico formando un gradiente de concentraciones definido en la zona
alrededor de la tirilla, tras una incubación adecuada de la prueba se habrá formado una zona de
inhibición en el centro, la concentración mínima inhibitoria se puede medir con facilidad usando la
escala graduada, en el punto donde la elipse converge.

50
Procedimiento:

En un agar Muller Hinton inocular la bacteria problema en una escala 0.5 MacFarland, la t{ecnica de
siembra es la misma que se usa en la técnica de Kirby Bauer sacar la tirilla del sobre y aplicar la misma
sobre el agar, usando una pinza estéril, aplicar la tirilla desde la concentración menor e ir asentando
progresivamente y cuidadosamente para evitar la formación de burbujas.

Interpretación: De acuerdo a los valores del CLSI se determina si el punto de corte determina
suceptibilidad, resistencia o suceptibilidad intermedia.

Valores Concentración mínima inhibitoria para vancomicina en Staphylococcus aureus. CLSI 2017

Vancomicina CIM ≤2 ug/ml Sensible Si la elipse converge en un

4-8 ug/ml Intermedio número determinado, ese
número corresponde al CIM y si
≥16 ug/ml Resitente la elipse converge en una zona
negra el número superior a éste
se considera la CIM.

RESULTADOS

Resolver los casos planteados en clase.

1. Llenar la siguiente tabla con los antibióticos utilizados en el laboratorio

Antibiótico Modo de acción Contraindicaciones (niños, Observaciones
adultos, mujeres embarazadas)
(en el caso de ser
requeridas)

2. Realizar el informe microbiológico de la muestra clínica con el formato indicado: no olvidar

utilizar las instrucciones del sílabo para el desarrollo y análisis del mismo.

51
 PRUEBAS PARA DETERMINAR BLEE (Positivo caso la diferencia sea ≥ 5 mm)
CAZ (Ceftazidime) CTX (Cefotaxime) CAZ+Acido Clavulanico CTX+Acido clavulonico INTERPRETACION

Escherichia coli
Proteus sp.

HOJA DE RESULTADOS PRACTICA DE ANTIBIOGRAMAS

PARAMETROS DE ACUERDO AL CLSI
Halo
BACTERIA ANTIBIOTICOS ABREVIATURAS diámetro SENSIBLE INTERMEDIO RESISTENTE INTERPRETACION
Enterococcus sp.
Ampicilina AM ≥ 17 ----- ≤ 16
Vancomicina VA ≥ 17 15-16 ≤ 14
S. aureus
Trimetoprim
sulfametoxazol SXT ≥ 16 11-15. ≤ 10
Tetraciclina TE ≥ 19 15-18. ≤ 14
Azitromicina AZM ≥ 18 14-17. ≤ 13
Cefoxitin FOX ≥ 22 ------ ≤ 21
Escherichia coli
Nitrofurantoina FM/ ≥ 17 15-16. ≤ 14
Ciprofloxacina CIP ≥ 21 16-20. ≤ 15
Trimetoprim
sulfametoxazol SXT ≥ 16 11-15. ≤ 10
Proteus mirabilis
Cefuroxime CXM ≥ 18 15-17 ≤ 14
Ampicilina+Sulbactam SAM ≥ 15 12-14. ≤ 11
Ampicilina AM ≥ 17 14-16 ≥ 13

PREGUNTAS

 Qué es un bacteriostático y bactericida?

 Que es MRSA y su importancia clínica?

Notas:
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 PRÁCTICA 8: APLICACIONES INMUNOLÓGICAS EN EL DIAGNÓSTICO
MICROBIOLÓGICO Y MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA (DAPI)
OBJETIVO:

1. Comprender el principio inmunogénico de la prueba de ELISA y la prueba DAPI

2. Entender la sensibilidad y la especificidad de estas pruebas y su utilidad dentro del diagnóstico.

INTRODUCCIÓN

En la actualidad el uso de las pruebas de ELISA ha revolucionado el diagnóstico de diversas

enfermedades incluyendo un amplio grupo de las de etiología microbiana. El principio de estas pruebas
aprovecha la especificidad de los anticuerpos para la detección de antígenos que pueden estar
contenidos en una muestra. La prueba de ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) es una prueba
sensible y confiable, ampliamente utilizada para el análisis de la presencia de anticuerpos y/o antígenos
de un muestra, así como para su titulación.

Existen diversos sistemas de ELISA pero todos utilizan como base una fase sólida que es la placa de
ELISA recubierta con el antígeno o anticuerpo, de una concentración desconocida donde se le colocará
un segundo anticuerpo conjugado con una enzima, capaz de dar una reacción colorimétrica en
presencia de un substrato específico.

Los tipos más comunes de ELISA son indirecto y sándwich. En el primer caso sirve para investigar
presencia de anticuerpos, se utiliza placas en las que se ha adherido un antígeno (fase sólida). Estas
placas reciben luego una solución de suero sanguíneo en el cual se investiga la presencia de
anticuerpos, si los anticuerpos reconocen el antígeno entonces estos se quedan adheridos a la placa.
El paso final constituye la aplicación de anticuerpos marcados que reconocen los anticuerpos adheridos
a la placa. Los anticuerpos marcados contienen enzimas que producen reacciones de color.

El ELISA sandwich tiene como propósito reconocer antígenos (virus, bacterias, protozoarios) en una
solución. En la ELISA sandwich los anticuerpos específicos para el antígeno recubren la placa, el
antígeno afín al anticuerpo es añadido y un segundo anticuerpo, que reconoce al antígeno, será
agregado el cual es conjugado con la enzima que desarrollará la reacción colorimétrica (Figura 8.1).

54
 Figura 8.1: Prueba de ELISA. a. Tipo Sándwich. b. Indirecta. c. Placa de ELISA con reacciones
colorimétricas positivas.

Existen muchos tipos de aplicaciones de esta tecnología, tales como el ELISA indirecto (para detectar
anticuerpos), ELISA sándwich directo (para la detección de antígenos), el ELISA competitivo (para
detección cuantitativa), Ensayo Inmuno-Enzimático (para pruebas de detección rápidas),
Inmunofluorescencia indirecta (para observación microscópica de estructuras específicas), entre otros.

ELISA Directo: ELISA Indirecto:

Figura 8.2: Prueba de ELISA directo e indirecta.

MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA (DAPI)

DAPI ó (4 ',6-diamino-2-fenilindol) es un marcador fluorescente que se une fuertemente a regiones

enriquecidas en adenina y timina en secuencias de ADN. Es utilizado ampliamente en la microscopía de
fluorescencia. DAPI puede pasar a través de la membrana celular, debido a eso, se utiliza para teñir

55
células vivas y también células fijadas, a pesar de que pasa a través de la membrana celular, lo hace de
una manera poco eficiente en células vivas y debido a eso la eficacia de la señal fluorescente es menor.

Cuando DAPI se une a ADN bicatenario su máximo de absorción es a una longitud de onda de 358 nm
(ultravioleta) y de su máximo de emisión es a 461 nm (azul). Por lo tanto en la microscopía de
fluorescencia DAPI es excitado con luz ultravioleta para después ser detectado a través de un filtro azul.
DAPI también puede unirse a RNA, Sin embargo, aunque su pico de emisión es bastante amplio no es
tan fluorescente. Su emisión se desplaza a alrededor de 500 nm cuando se une a ARN.

Figura 8.3: Perfil de excitación y emisión de DAPI e ilustración de una tinción con DAPI in vitro.

La emisión de luz azul de DAPI resulta conveniente para microscopistas que deseen utilizar múltiples
marcadores fluorescentes en una sola muestra (citometría de flujo). Existe un cierto solapamiento
entre la fluorescencia producida por DAPI y las moléculas de verde - fluorescentes como la fluoresceína
y la proteína verde fluorescente (GFP), pero el efecto producido es mínimo. El uso de empalme
espectral debido a este efecto puede ser evidente cuando se realiza un análisis de imagen
extremadamente preciso. Otro uso para la microscopia de fluorescencia para DAPI es su popular uso el
marcaje de cultivos celulares con la finalidad de detectar el ADN contaminado con micoplasma o virus.
Las partículas de micoplasmas o virus marcados por DAPI en el medio de cultivo son más fáciles de
detectar.

56
PARTE I: ELISA

PROCEDIMIENTO

57
58
59
PARTE II: MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA (DAPI)

PROCEDIMIENTO

Cada mesón de trabajo deberá tener placas porta objetos y cubre objetos, palillos, solución salina. El
grupo 1: E. coli grupo 2: S. aureus Grupo 3. Enterococcus 4. Candida albicans 5. Klebsiella . Cámara de
humedad (Caja petri recubierta externamente con aluminio.)

1. Realizar un frotis con la bacteria que se desea visualizar, sobre un portaobjetos.

2. Dejar secar la placa completamente.
3. Colocar dentro de una caja petri recubierta con aluminio, un papel absorvente humedecido.
4. Apagar las luces.
5. Colocar una gota de metanol sobre la placa y dejar que se evapore.
6. Colocar una gota de la solución 1ul/ml DAPI-metanol sobre la placa portaobjetos y cubrir
con un cubreobjetos evitando la formación de burbujas
7. Incubar durante 15 min a 37 grados centígrados.
8. Retirar el cubreobjetos y secar.
9. Colocar una gota de agua destilada para lavar
10. Dejar secar
11. Observar en el microscopio de fluorescencia en el filtro DAPI (Filtro con el fondo azul) en 100x
utilizando aceite de inmersión.

PREGUNTAS

1. ¿Por qué una prueba de ELISA podría salir positiva sin realmente serlo?

2. ¿Qué son anticuerpos monoclonales?

3. ¿Cuál es el principio de la prueba DAPI?

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Notas:
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PRÁCTICA 9: CONJUGACIÓN BACTERIANA, HONGOS Y HELMINTOS

OBJETIVOS

1. Evidenciar el paso de genes de resistencia a antibióticos entre bacterias por el fenómeno de

conjugación bacteriana.
2. Comprender la importancia de este proceso biológico dentro de la evolución de los patógenos
bacterianos.
3. Diferenciar las estructuras de los hongos.
4. Observar algunos tipos de parásitos eucariotas y relacionarlos con su ciclo de transmisión.

INTRODUCCIÓN

La conjugación bacteriana es el proceso de transferencia de información genética desde una célula

donadora a otra receptora, promovido por determinados tipos de plásmidos. Los plásmidos son
moléculas circulares de ADN extracromosómico que se replican de manera independiente al
cromosoma de la célula hospedadora. Los plásmidos pueden llevar información nueva a las bacterias
como por ejemplo la resistencia a antibióticos. La transferencia horizontal de genes por medio de la
conjugación contribuye a su dispersión de forma muy eficiente, incrementando rápidamente la
variabilidad de las bacterias. La conjugación bacteriana se da por la transferencia de una copia de un
plásmido a través de una estructura de membrana conocida como pili desde la célula donadora hacia
la receptora, obteniéndose al final una célula donadora conservada y una receptora que recibió un
plásmido.

Los hongos pueden ser saprofitos o parásitos y unicelulares o filamentosos. Entre las características
distintivas de los hongos están:
1. Son eucarióticos.
2. Son no fotosintéticos.
3. Tienen pared celular formada por quitina u otros polisacáridos.
4. Se propagan por esporas sexuales y/o asexuales.

Los hongos comprenden dos grupos: mohos y levaduras. Los mohos normalmente están presentes en
el aire y son esencialmente multicelulares a diferencia de las levaduras que son unicelulares. En cuanto
a la apariencia los mohos tienen aspecto algodonoso y las levaduras una textura cremosa.
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Morfológicamente se pueden distinguir a los mohos porque tienen filamentos microscópicos
denominados hifas. Cuando una hifa se encuentra dividida se denomina hifa septada, y las que no se
llaman no septadas o aseptadas. El conjunto de hifas se denomina micelio. Por otro lado, las levaduras
no tienen hifas y cuando forman estructuras multicelulares son llamados pseudohifas.

Figura 9.1- Ilustración de las diferentes morfologías de hongos.

El término Helmintos no corresponde a una clasificación biológica, porque en realidad reúne dos grupos
muy distintos de organismos metazoos con diferencias biológicas profundas. Los helmintos son un
grupo de gusanos que la unica característica que comparten, aparte de ser gusanos y ser invertebrados,
es que son parásitos del hombre. A pesar de esto, podemos generalizar que los adultos son
macroscópicos, alargados y presentan simetría bilateral, no poseen extremidades y afectan a miles de
millones de humanos. Los tamaños de estos parásitos pueden oscilar entre milimetros y metros,
dependiendo de la especie. Los helmintos se subdividen en dos grupos a saber:
1. Platyhelmintes o gusanos planos (platelmintos)
2. Nematyhelmintes o gusanos redondos (nematodos).
Los nematodos son organismos evolutivamente que presentan estructuras corporales más avanzados,
por ejemplo, presentan un sistema digestivo completo con boca, ano y algunos órganos internos, a
diferencia de los platelmintos que no poseen ninguna de estas estructuras. En el caso de los cestodos,
una clase de platelmintos, estos absorben directamente los nutrientes por su cubierta externa.
Los nematodos están cubiertos de una capa externa gruesa y protectora, similar en función a la
epidermis humana, que se denomina cutícula. Los platelmintos por su parte, no poseen esta protección

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y tienen una capa mucho menos resistente (tegumento) que está especializada en el intercambio de
sustancias con el medio externo.

PARTE I: CONJUGACIÓN BACTERIANA

MATERIALES

 Cepa donadora ( Cepa aislada de heces humanas, Resistente a SXT, TE, AMP)
 Cepa receptora (Cepa mutada, resistente a Acido nalidíxico)
 Discos de antibióticos (Tetraciclina, Ampicilina, Trimetropin-sulfamethoxazole).
 Medio selectivo que contiene Agar nutritivo + 25ug/mlNA (diluido en NaOH 0.1N) +100ug/ml
tetraciclina (diluido en etanol absoluto)
 Cepa donadora en 100 ml de caldo nutritivo (CN), previamente incubada por 20 horas a 37ºC.
 Cepa receptora en 100 ml de caldo nutritivo (CN), previamente incubada por 20 horas a 37ºC.

PROCEDIMIENTO

1. Las cepas donadora y receptoras tienen un patrón distinto de susceptibilidad a los antibióticos.
Para comprobar esto se realiza lo siguiente:
a. Realizar un antibiograma de las cepas donadoras y la cepa receptora con discos de
antibióticos: Tetraciclina (TE), Ampicilina (AM), Trimetoprim-sulfametoxazol (SXT), y
Acido Nalidíxico (NA).
b. Sembrar las cepas donadoras y receptora en el medio selectivo (AN+25NA+TE)
2. Conjugación bacteriana
a. Verter 100 mL de la cepa receptora en los 100 mL de la cepa donadora, e incubar por
24 horas a 37ºC. NOTA: el proceso de conjugación es muy sensible al movimiento
debido a la fragilidad de las fimbrias.
b. Al día siguiente tomar 80uL de caldo nutritivo para realizar la prueba de susceptibilidad
antimicrobiana como se indica en la Práctica de Antibiogramas.
c. Tomar con un hisopo una muestra del caldo nutritivo y sembrarla en medio selectivo
(AN+NA+TE). Colocar los antibióticos SXT, AM, y TE.
d. Incubar las placas a 37°C y observar los resultados luego de 24 horas.
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RESULTADOS: Realizar un cuadro con los resultados obtenidos. No olvides mencionar las
características de las cepas donadora, receptora y conjugada.

ANTIBIÓTICOS DONADORA RECEPTORA CONJUGADA

Ampiclina
(R ≤ 13 mm; S ≥ 17 mm)
Tetraciclina
(R ≤ 11 mm; S ≥ 15 mm)
Trimetoprim-sulfametoxazol
(R ≤ 10 mm; S ≥ 16 mm)
Ácido nalídixico
(R ≤ 13 mm; S ≥ 19 mm)

Dibuje como se observa las distintas resistencias y sensibilidades a antibióticos de las siguientes cepas

Donadora Receptora Conjugada

PARTE II: HONGOS Y HELMINTOS

PROCEDIMIENTO

TINCIÓN DE LEVADURAS.- Las levaduras se pueden observar mediante una Tinción Simple con azul de
metileno.

1. Realizar un frotis (de igual manera que en la Tinción Gram).

2. Cubrir con azul de metileno por 1 minuto.
3. Lavar la placa.

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 4. Secar.
5. Observar al microscopio con aumento 1000X.

CULTIVO DE HONGOS.- El medio de cultivo que utilizaremos para el crecimiento de mohos y levaduras
es el Sabouraud. Este medio tiene un pH bajo, los nutrientes necesarios y está suplementado con
Gentamicina (40 mg por litro).

Con anterioridad se dispondrá en el laboratorio de cajas con cultivos de hongos. Los hongos se cultivan
a temperatura ambiente.

IDENTIFICACION POR EL METODO DE LA CINTA ADHESIVA.

1. Depositar una gota de colorante de azul de algodón de lactofenol en una placa portaobjetos.
2. Tomar un pedazo de 2 cm de cinta adhesiva y colóquelo en una pinza de manera que la parte
adhesiva de la cinta se proyecte hacia afuera.
3. Apoyar la parte adhesiva de la cinta contra una colonia de hongos y luego colocar la cinta sobre
la gota de colorante.
4. Observar al microscopio con objetivos de 10X y 40X y compare las estructuras con las del
manual de laboratorio.

IDENTIFICACION DE LOS HONGOS POR EL METODO DE LA CINTA ADHESIVA

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 Figura 9.2- Descripción y esquema de las diferentes morfologías de hongos.

Nota: La parte de Hongos y Mohos de esta práctica fue tomada el Manual de Laboratorio de
Microbiología Aplicada (Instructora Dra. Sonia Zapata M.)

OBSERVACIÓN DE PLACAS DE PARÁSITOS

CICLOS DE LOS PARÁSITOS OBSERVADOS

Fasciola hepática

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Taenia

Trichinella spiralis

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Trypanosoma

Figura 9.3- Ilustración de los ciclos de vida de diferentes parásitos.

Notas:
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 HONGOS Y PARÁSITOS

Morfología macroscópica Morfología microscópica Género y Especie

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PRÁCTICA 10: HEMAGLUTINACIÓN VIRAL

OBJETIVOS

1. Evidenciar el paso de hemaglutinación viral en la producción de vacunas a través de embriones

de aves.

INTRODUCCIÓN

Los virus de la familia Paramyxoviridae (paramixovirus), son responsables de distintas enfermedades

humanas, como el sarampión y las paperas; dos de los virus se sabe que provocan neumonía en los
humanos: el virus sincitial respiratorio (VSR) y el de la parainfluenza. También son responsables de
enfermedades en animales como la enfermedad de Newcastle en aves.

La enfermedad de Newcastle es una enfermedad de baja capacidad zoonósica altamente contagiosa

entre las aves domésticas y silvestres. La enfermedad de Newcastle fue descubierta en Newcastle,
Inglaterra en 1926 (Doyle).

El Virus de la enfermedad Newcastle (NDV), pertenece a la familia Paramyxoviridae, subfamilia

paramyxoviridae, género Avulavirus. Es un virus de ARN de cadena simple sentido negativo. La
transmisión ocurre por exposición a heces y otras excreciones de aves infectadas, y a través del
contacto con alimento, agua, equipamiento y ropa contaminados.

Dos proteínas del virus de la enfermedad de Newcastle se insertan la envoltura viral, la proteína
hemaglutinina / neuraminidasa (HN) y la proteína de fusión (F). Estas dos proteínas son importantes
para determinar la virulencia del virus y cómo el virus infecta las células del hospedador.

La proteína HN tiene dos dominios importantes:

1. La sección hemaglutinina, que es una proteína de unión a los receptores en el exterior de la

membrana de las células del hospedador (incluyendo los glóbulos rojos). La fijación del virus a los
glóbulos rojos es una propiedad importante utilizada en el laboratorio para detectar la presencia del
virus y detectar anticuerpos contra el virus.

2. La sección de neuraminidasa es el sitio activo de una enzima que ayuda a la liberación del virus desde
la membrana de las células huésped. La actividad de esta enzima afecta el tiempo que tarda el virus en
lisar los glóbulos rojos.

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La proteína de fusión une la envoltura del virus con la membrana de la célula del hospedador. Esto
permite la penetración de la célula del hospedador y la liberación del genoma viral.

Los signos de infección con NDV varían grandemente dependiendo de factores tales como la cepa del
virus y la salud, edad y especie del hospedero. Los signos pueden ser respiratorios (jadeo, tos),
nerviosos (depresión, inapetencia, decaimiento, parálisis), hinchazón de los ojos y el cuello, diarrea,
desfiguración, producción de huevos reducida y con cáscara áspera y fina).

Figura 10.1. Esquema de un virus de la enfermedad de Newcastle.

El método más conveniente para la propagación del virus de la enfermedad de Newcastle in vitro es
mediante la inoculación de la cavidad alantoidea de embriones de pollo.
Las cepas víricas de Newcastle podrán crecer en las células que recubren la cavidad alantoidea. El virus
se introduce en estas células, donde se multiplicarán, a medida que se lisan las células, el virus será
liberado al fluido alantoideo. A continuación, las cepas virulentas del virus invadirán las células más allá
del revestimiento de la cavidad alantoidea y matarán al embrión. El tiempo necesario para que esto
ocurra es la base de los "Ensayos de Tiempo de Muerte Medio", que es un indicativo del nivel de
virulencia.

La inoculación de la cavidad alantoidea de embriones de pollo es una técnica utilizada en los siguientes
procedimientos:
1. Producción de vacunas contra la enfermedad de Newcastle.
2. Determinación del título de infectividad de una suspensión viral de la enfermedad de Newcastle.
3. Aislamiento del virus de la enfermedad de Newcastle de especímenes de campo para diagnóstico de
laboratorio.

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PARTE I: INOCULACIÓN DE LA CAVIDAD ALANTOIDEA

Materiales:

• Huevos: embriones de pollo de 9 días o 10 días de edad.

• Punzón (aguja) para la cáscara de huevo.
• Algodón.
• Etanol al 70%.
• Jeringa de 1 mL.
• Agujas de insulina (calibre 25, 16 mm).
• Cera de vela fundida para sellar el sitio de inoculación.
• Inóculo viral (vacuna del virus) Debe estar libre de contaminación microbiana.
• Bandeja de desechos.

PROCEDIMIENTO

Se coloca el huevo en un ovoscopio para poder marcar el sitio de inoculación (Figura 10.2).

1. Use algodón y alcohol al 70 % para frotar el extremo de los huevos que se van a inocular. Deje que
el alcohol se evapore.
2. Limpie el punzón de la cáscara de huevo con un etanol 70 %. Coloque el algodón usado en la bandeja
de desechos.
3. Perfore un agujero en el sitio marcado de la inoculación.
4. Con una aguja de insulina tome 0,1 ml del inóculo de virus.
6. Mantenga la aguja y la jeringa verticales, introduzca la aguja a través del agujero en la cáscara del
huevo. La aguja tendrá que penetrar aproximadamente 16 mm en el huevo para llegar a la cavidad
alantoidea.
7. Inyectar 0,1 mL de inóculo en el huevo.
8. Retirar la aguja del huevo.
9. Sellar el agujero en la cáscara con cera derretida.
10. Deseche las agujas y jeringas usadas.
11. Colocar los huevos inoculados en la incubadora a 37ºC por tres días Compruebe la temperatura y
la humedad de la incubadora.

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 Figura 10.2. Inoculación de embrión de pollo en cavidad alantoidea

Figura 10.3. Punzón de cáscara de huevo

Descripción: Una aguja (calibre 20 es adecuado). Tapón de caucho. Inserte la aguja en el tapón de goma
de modo que sólo 1 mm de la punta se muestra. Utilice y guarde cuidadosamente ya que la punta de
la aguja será muy afilada.

PARTE II: HEMAGLUTINACIÓN VIRAL

La hemaglutinación viral es la aglutinación de los hematíes o glóbulos rojos debido a la presencia de

antígenos virales llamados hemaglutininas presentes en algunos virus como los paramixovirus o los
ortomixovirus. Estos antígenos se unen a polisacáridos en la superficie de los glóbulos rojos y cuando
están en alta cantidad producen la aglutinación de los glóbulos rojos. Esta técnica se una para detectar
rápidamente la presencia de virus en fluidos.

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PROCEDIMIENTO

1. Tomar una muestra de líquido alantoideo con virus de Newcastle previamente inoculado.
2. Colocar una gota del líquido alantoideo en un portaobjeto.
3. Colocar al lado de la gota de líquido alantoideo una gota de sangre.
4. Mezclar ambas gotas.
5. Esperar un tiempo hasta comprobar la hemaglutinación de la sangre.
6. Para el control negativo realizar el mismo procedimiento anterior con una gota de sangre y una
gota de agua destilada.

A B
Figura 10.4. Pruebas de hemaglutinación. A-Prueba Negativa. B-Prueba Positiva

Notas:
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