INTRODUCCIÓN

Los medios de cultivos son aquellas sustancias donde los microorganismos

encuentran los sustratos necesarios para realizar sus funciones metabólicas que
favorecerán su multiplicación, el crecimiento de los microorganismos se manifiesta
por la aparición de colonias sobre los medios de cultivo en un color turbio. Existen
diferentes medios de cultivo según su: consistencia, composición química, utilidad
práctica y cada uno se divide en subdivisiones con propiedades ya sea de agar,
proteínas, carbohidratos, etc.

El sistema de siembra es la transferencia de microorganismos de un ambiente a otro

con el propósito de cultivarlos, para poder conocer la identidad de un nicho
microbiano es necesario tener un cultivo puro; es importante la calidad de la
muestra por lo cual esta requiere de homogenizar, representar y asepsia. Existen
diferentes clases de siembra que permitirán reconocer las características de un
determinado individuo.

En el siguiente informe vamos a conocer acerca de los medios de cultivo y el sistema

de siembra, el objetivo de la práctica de laboratorio es identificar los pasos para
realizar una preparación de medio de cultivo, conocer los estados de agregación de
los medios de cultivos y conocer las diferentes técnicas de siembra, estableciendo las
diferencias e importancia para cada sistema. A su vez se tendrá encuentra preguntas
complementarias que ayudaran a entender mejor estos procedimientos y conceptos.
 PROCEDIMIENTOS EN EL LABORATORIO

1. Medio de cultivo.

Materiales:

-X.L.D
-Cajas de Petri
-Agua
- vaso precipitado
-Hoja de papel periódico
-Balanza
-Espátula
-Botella
-Agitador

¿Que se hizo?

-se observó los componentes que tiene el agar X.LD.

-El Ph del X.LD era de 7,4
-Se observó los gramos que se necesitaban para diluirlos en tantos litros.
-Como el profesor nos dio a preparar 200 ml, se realizó una conversión de ml
a L, luego la conversión de gramos establecidos para poder alcanzar los L que
nos habían dado.
-Luego de saber que se necesitaba 10,6 g. en un papel periódico y en la
balanza con ayuda de una espátula se iba tomando el producto y se iba
pesando.
-Se llevó ya pesado a un tarro que contenía agua y se le agrego, se tapó y se
empezó a agitar muy bien.
-Luego se llevó al agitador y se iba revolviendo muy bien, se observó hasta que
emitiera gases de vapor fuertes.
-Finalmente, en cajas Petri marcadas con el nombre, fecha y agar, se colocaba
en el extractor, se destapaba la botella ya diluida, se agregaba un poco que
quedara un tercio lleno de la caja Petri, y luego se dejaba la tapa a medio tapar,
para que este enfriara y luego se tapaba. Este no necesita de esterilización.

¿Cuál fue el resultado?

 Imagen N°1 Imagen Nº2

Se puede observar el agar listo para ser sembrado con algún microorganismo, luego
de estar solidificado.

¿Por qué el resultado?

El agar XLD o agar Xilosa Lisina Desoxicolato es un medio de cultivo sólido selectivo
y diferencial para el aislamiento de enteros patógenos, se le adicionó desoxicolato
sódico, tiosulfato de sodio y citrato amónico férrico para aumentar su selectividad.
El agar XLD está compuesto por extracto de levadura, desoxicolato de sodio, xilosa,
lisina, lactosa, sacarosa, tiosulfato sódico, citrato férrico de amonio, cloruro sódico,
rojo fenol y agar.

Atemperar antes de usar. Como es un medio no esterilizado se recomienda

prepararlo cercano a la fecha de su uso.

El pH final del medio debe quedar en 7,4 ± 0,2. El color del medio preparado es rojo
naranja, traslúcido, sin precipitado.

Si se cuenta con el agar base Xilosa Lisina (XL) se le puede agregar desoxicolato de
sodio, tiosulfato de sodio y citrato amónico de hierro. De esta manera se obtiene la
fórmula del agar XLD.

En el laboratorio de realizaron otros medios de cultivo ya sean agares o caldos nutritivos.

El docente preparo el agar chocolate y agar sangre.

2. Laboratorio “Sistema de siembra”

Materiales:
-Marcador
-Mechero
-Mechera
-Caldo nutritivo cepa #1
-Cepa #2 Agar nutritivo solido
-Asa
-Cajas Petri con: Agar sangre x2, A.S.M, E.M.B y A.C.K
-Portaobjetos
-Microscopio
-Papel de cocina

¿Que se hizo?

*PORTAOBJETOS.

-Encender el mechero, colocar el portaobjetos adelante del mechero, dividir el

mechero y escribir 1 y 2. Con el asa pasarlo al mechero, esterilizarlo muy
bien, luego por los borden del tubo de ensayo del caldo nutritivo bajar
lentamente el asa y coger un poco de la muestra, luego suspenderla en forma
circular en el portaobjetos en el #1.
-fijar al calor suavemente y volver a esterilizar el asa
-Coger la cepa #2 y con el asa esterilizada, pasarlo suave por donde no
observemos microorganismos, luego coger un poco de la muestra. Colocarla
en el #2 del portaobjetos en forma de espiral y fijar al calor.
-Apagar el mechero
-Realizar Tinción de Gram
Primero se le agrega cristal violeta 1 minuto, lugol 1 minuto, alcohol acetona
30 segundos y safranina 20 segundos. Lavar cuando se le vaya agregar cada
componente.
-Observar al microscopio al 40x y 100x.

*AGAR SANGRE

-Encender el mechero, colocar las cajas Petri delante del mechero, escribir
en las cajas Petri: fecha, nombre del equipo, Agar 1 y 2. Luego esterilizar el
asa muy bien. En el agar sangre#1, destapar el caldo nutritivo, bajar el asa
por los bordes del tubo, coger un poco de muestra y con la caja Petri realizar
un sistema se siembra clásico, que esta subdivido en 4 partes y tapar.
-Coger el asa, esterilizarlo muy bien, coger el agar sangre #2, coger la
muestra de la caja Petri, coger cuidadosamente una muestra con el asa, y
realizar una siembra clásica en el agar sangre, como lo hicimos
anteriormente. Tapar

*S.M (Agar salado de mannitol)

-Encender el mechero, colocar la caja Petri delante del mechero, escribir en

la caja Petri: fecha, nombre del equipo, dividir en 1 y 2 la caja Petri con un
marcador. Esterilizar el asa con el mechero, luego con la cepa #1 en el lugar
que marcamos #1, con el asa coger una muestra del caldo nutritivo y
colocarla en zigzag en ese lugar.
-Esterilizamos el asa, luego con la cepa #2, cogemos una pequeña muestra
con el asa y realizamos un extendido en el lugar que dice #2 de la caja Petri.
-cerramos

*M.C.K (Agar macconkey)

-Encender el mechero, colocar la caja Petri delante del mechero, escribir en

la caja Petri: fecha, nombre del equipo, dividir en 1 y 2 la caja Petri con un
marcador. Esterilizar el asa con el mechero, luego con la cepa #1 en el lugar
que marcamos #1, con el asa coger una muestra del caldo nutritivo y
colocarla en zigzag en ese lugar.
-Esterilizamos el asa, luego con la cepa #2, cogemos una pequeña muestra
con el asa y realizamos un extendido en el lugar que dice #2 de la caja Petri.
-cerramos
-Apagamos el mechero

*E.M.B (Eosina azul de metileno)

-Encender el mechero, colocar la caja Petri delante del mechero, escribir en

la caja Petri: fecha, nombre del equipo, dividir en 1 y 2 la caja Petri con un
marcador. Esterilizar el asa con el mechero, luego con la cepa #1 en el lugar
que marcamos #1, con el asa coger una muestra del caldo nutritivo y
colocarla en zigzag en ese lugar.
-Esterilizamos el asa, luego con la cepa #2, cogemos una pequeña muestra
con el asa y realizamos un extendido en el lugar que dice #2 de la caja Petri.
-cerramos
-Apagar el mechero
Luego cogimos las 5 cajas Petri y envolvimos con papel vinipel, para ser
guardada en la nevera.

¿Cuál fue el resultado?

Luego de 24 horas pasadas, fuimos de nuevo al laboratorio a observar que

obtuvimos en las muestras.

Al destapar el vinipel y observar a la luz los resultados de cada agar, se puede

decir que en el agar sangre de la cepa#1 no sirvió, ya que se encontraba
contaminada, lo mismo del agar S.M por lo cual fue suministrada por el
docente.

-En ambos agar sangre se observó:

Agar sangre #1: Staphylococcus

Agar sangre #2: Escherichia Coli

S.M: se observaron las Gram +, estas bacterias se muestran de color amarillo

y a su vez tornan el medio amarillo.

E.M.B. (eosina y azul de metileno): Las colonias de E. Coli en agar tienen un

centro grande de color oscuro e incluso negro, y tienen brillo verde metálico
cuando se observan con luz refleja.
Cuando la eosina y el azul de metileno se mezclan con la lactosa se produce
el brillo metálico.
M.C.K (Agar macconki): Se observaron las colonias rosas y su medio externo
de un color rosado muy fuerte.

(Los agares estaban divididos en dos, por lo cual dependiendo del agar
inhibía el crecimiento de la bacteria, ya sea en el 1 o 2)

Ejemplo:

¿Por qué el resultado?

El agar sangre:
Aporta muchos factores de enriquecimiento. Se usa también para ver la
capacidad hemolítica de los microorganismos patógenos (que es un factor de
Virulencia). Observando los halos hemolíticos alrededor de las colonias se
determina el tipo de hemólisis que posee.

-Estafilococos
El crecimiento de las colonias bacterianas son visibles casi sobre todos los
medios de cultivo, en especial en agar sangre. Son bacterias en forma de coco
Gram positivas producen catalasa, son aerobios facultativos
-Escherichia coli
Son colonias medianas, convexas, de color blanco, forma circular, bordes
redondeados, es el grupo mas grande de enterobacteriaceae, el grupo más
grande los bacilos gram negativos.

S.M
Es un medio de cultivo que se utiliza normalmente en microbiología. Permite el
crecimiento de bacterias Gram-positivas mientras inhibe el crecimiento de
Gram-negativas.
Coagulasa-positivo Staphylococcus producen colonias amarillas con zonas
amarillas, mientras que coagulasa-negativo Staphylococcus producen colonias
rojas o ligeramente rosadas sin cambio alguno al medio. Si un organismo es
capaz de fermentar el manitol, un subproducto ácido es creado que hace que
el rojo de fenol cambie a amarillo

M.C.K:
Es un medio de cultivo selectivo y diferencial para bacterias diseñado para
aislar selectivamente bacilos Gram negativos y entéricos (encontrados
normalmente en el tracto intestinal) y diferenciarlos sobre la base de la
fermentación de la lactosa.1 El cristal violeta y las sales biliares inhiben el
crecimiento de organismos Gram positivos, lo que permite la selección y el
aislamiento de bacterias gramnegativos.

E.M.B:
Es un medio de cultivo selectivo y diferencial: inhibe el crecimiento de bacterias
Gram positivas y algunas Gram negativas y muestra si las Gram negativas que
crecen son o no fermentadoras de lactosa. Esto lo realiza gracias a la eosina
y el azul de metileno
 TRABAJO COMPLEMENTARIO

-Medios de cultivo:

1. Realizar el diagrama de flujo de la presente practica

Preparación de medio de cultivo

Observar el PH, componentes y Si es necesario, realizar las

gramos que se utilizan en un litro de conversiones pertinentes
agua del agar para los litros a utilizar de
agua con el agar o los
Espátula, papel periódico, gramos a utilizar de
Alistar los materiales extras a utilizar acuerdo al agua dada.
balanza, vaso precipitado,
para la preparación.
cajas Petri, calentador, tubos
de ensayo, autoclave, tubo
de ensayo
Medir en una probeta el volumen del
agua necesario, según los cálculos.

Pesar los gramos de agar en un En una balanza

papel periódico

Alcanzar punto de Homogenizar el medio agitándolo

ebullición, sin hervir. constantemente, colocarlo en el
calentador.

Si es necesario colocarlo en la Si no es necesario,

autoclave hasta una T. 121ºc por un saltar a servir.
tiempo de 15 a 20 minutos.

Dejar enfriar y guardar en la Servir en cajas de Petri o en los En el extractor

nevera. tubos de ensayo.

2. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de la utilización de los medios

sólidos y líquidos?

Ventajas: 1. Aislamiento de bacterias desde una muestra o material patógeno

(secreción purulenta, orina, órgano, fecas, etc.) o de un alimento (leche, carne,
etc.)
 2. Estudio morfológico de las colonias.
3. Conservación de cepas identificadas (colección de cepas microbianas o
cepario).
4. Clasificación y tipificación de bacterias por estudio de sus propiedades
bioquímicas en medios diferenciales.
5. Obtención de toxinas o investigación de sus características.
6. Cultivo y cosecha de bacterias para la elaboración de productos biológicos

Desventajas:
En el medio líquido, la muestra solo puede ser utilizada una vez, ya que si
utiliza dos veces, se vuelve turbia de una vez el caldo por sus entes
contaminantes.

3. ¿Qué significa U.F.C y cuál es su importancia en la industria de

alimentos?
Unidades Formadoras de Colonias" (ufc) se miden en (UFC por mililitro).
Los laboratorios se ven en la necesidad de aplicar distintas técnicas para el
aislamiento y conteo de microorganismos presentes en los alimentos, para
poder conocer acerca de las enfermedades transmitidas por alimentos.
Los criterios microbiológicos ofrecen a la industria alimentaria y a los
organismos reguladores las directrices para controlar los sistemas de
Elaboración de alimentos. Como criterios microbiológicos se pueden utilizar:
Microorganismos indicadores de contaminación
La presencia de microorganismos patógenos específicos
La detección de una toxina específica producida por un patógeno.

4. ¿Cuál es el origen, la función química e importancia del Agar en la

preparación de los medios de cultivo?

El agar, cuyo nombre completo es agar-agar, fue descubierto por el japonés

Minora Tarazaemon, quien notó que una sopa de alga en un clima frío se
solidificó en una noche. Por esta razón, en Japón el agar es llamado Kanten o
“cielo congelado”. A partir de este momento el agar comenzó a ser usado por
los europeos en la industria de los alimentos. No fue hasta 1881 que se
comenzó a usar el agar como un agente solidificante en el cultivo de
microorganismos. Walther Hesse, el asistente de Robert Koch, fue quien
sugirió el uso de agar para los cultivos, sin embargo, esto no puede atribuírsele
solo a él, ya que de hecho fue su esposa, Fannie, quien tuvo la idea de usar el
agar en el laboratorio.
Importancia
Uso Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de numerosos
microorganismos. Al ser suplementado con sangre ovina, permite el
crecimiento de microorganismos nutricionalmente exigentes y la clara
visualización de reacciones de hemólisis
 Función química
El agar sangre es un medio enriquecido porque lleva como aditivo principal 5
-10% de sangre sobre una base de agar. Ambos compuestos contienen
muchos nutrientes y esta propiedad permite que en él puedan crecer la
mayoría de las bacterias cultivables. Ese crecimiento ocurre sin restricción;
por este motivo es no selectivo

5. ¿Cuáles son los macronutrientes y micronutrientes que son necesarios

como requerimientos nutricionales para el crecimiento de los
microorganismos?

Macronutrientes: sales como cloruro de sodio y magnesio, sulfatos y sales de

calcio. Pueden aparecer en concentraciones de hasta 30 g/L cuando se trata
de especies marinas y hasta de 100 g/L en micro algas halófilas. Estos
macronutrientes no se consumen en la generación de biomasa o se incorporan
en muy pequeña medida. Su objetivo principal es mantener la presión
osmótica y el equilibrio de electrolitos.

- Micronutrientes: Son elementos que actúan como cofactores de enzimas y

aparecen en muy pequeñas cantidades, a veces de microgramos por litro. Si
se ponen en exceso pueden actuar como un veneno, como es el caso del
cobre, que es un conocido alguicida.

Además del agua, carbono, oxigeno, Nitrógeno, Fosforo.

6. ¿Cuáles son los medios de cultivo más empleados en la agroindustria?

Justifique
Medio agua peptonada, Medio Rothe, Medio agar brucella modificado, Medio
chapman, Medio agar chocolate, Medio citrato de Simmons, Medio Clark y
lubs, Medio cled, Medio de hugh-leifson, Medio levine, Agar nutritivo, Agar
sangre.
Ya que estos medios permiten ya sea: aislar o cultivar microorganismos para
observación, para buscar y diferenciar bacilos entéricos, para usar citrato
como fuente de carbón, para el crecimiento de diferentes microorganismos
que ayudan al proceso alimenticio o de aguas.

-Sistema de Siembra:

1. ¿Qué diferencia existe entre los procedimientos de siembra y replique?

En la siembra se incorpora a un medio de cultivo de una muestra (inoculo)
con un propósito cuantitativo o cualitativo. Solo se injerta en un solo lugar
 En los repiques se utilizan para crecer el microorganismo en un medio de
cultivo para conocer su metabolismo, producción de pigmentos. Se pasan
de un lado a otro para seguir conservando el individuo
Esta población no puede ser mantenida por mucho tiempo en un ambiente
cerrado sin renovación de nutrientes ni eliminación de sus productos de
desecho.

2. ¿Qué ventajas tiene la siembra en medios solidos sobre la siembra en

medios líquidos?

Medios Sólidos: se utilizan para obtener bacterias aisladas por la formación

de colonias sobre la superficie del medio de cultivo y para el estudio de la
morfología de las colonias, lo que no permiten los medios líquidos.
En los medios líquidos no se puede sustituir por los medios sólidos, en el
medio solido tiene sustancias de sostén variadas.

3. Escriba tres posibles causas de contaminación de un cultivo

-Al sacar muestra con el asa, este no sea muy bien esterilizado y tenga
residuos contaminantes (utensilios)
-Mala manipulación
-Atmosfera

4. ¿Qué es un cultivo microbiano?

Son aquellos sistemas más importantes para la identificación de
microorganismos observando su crecimiento en sustancias alimenticias
artificiales preparadas en el laboratorio químico.

5. ¿Qué es un cultivo mixto?

Contiene más de una especie de microorganismos

6. ¿Qué es un cultivo puro?

Aquellos cultivos llamados axenicos, que significa que solo tiene un tipo de
microorganismo

7. ¿Qué es un cultivo contaminado?

Es cuando aparece un germen extraño fuera de la línea de siembra

8. ¿Qué es un inoculo microbiano?

Es una preparación solida o liquida la cual contiene una gran cantidad de
microorganismos.

9. Describa las características morfológicas de las colonias de los

siguientes géneros microbianos:
 -Escherichia: Bacilo gram negativo, no forma esporas, tiene flagelos
periticos, no es porulado, tiñe color rosado en la tinción gram, motil,
fermentadora, puede presentar plásmido o sobrevivir sin él, catalasa positivo
-Lactobacillus: son pleomorfos, nunca presentan ramificaciones, suelen esta
en parejas, cadenas, empalizadas o aislados, algunos tienen flagelos, son
gram positivos, aeróbicos o anaeróbicos
-Estafilococos: Su agrupación es en racimo. Son esféricos de 1mm de
diámetro, no son móviles ni esporulados, son gram positivo (inicio-meseta) o
gram negativo (decline-muerte), algunas contienen capsulas
-Clostridium: Bacilo delgado, esporas redondas, apariencia de palillos de
tambor, es gris, translúcida, borde irregular, pequeño halo de hemolisis,
bacilos gram positivos.
-salmonella: Son bacilos cortos, gram negativos, aerobios que no producen
pigmentos sobre los medios de cultivo, la mayoría fermenta la glucosa y otros
azúcares sencillos con la producción de ácido y gas

10. ¿Se obtendría el mismo resultado si cuantificáramos las bacterias de

una muestra por turbidimetria o por diluciones seriadas? ¿Por qué?
Si, ya que será una muestra tubidimetrica o por diluciones seriadas se utiliza
el mismo método, aunque casi no tiene utilidad en la microbiología. Recuento
de viables, Recuento totales, Medida del número de células, medida de la
masa muscular

11. Se sembraron dos placas de medios de cultivo a partir de las diluciones

1/10000 y 1/100000. Tras la incubación de las placas a 37ºc, no apareció
ninguna colonia. ¿Significa esto que no había ninguna bacteria en la
muestra problema? Explique este resultado.

12. Se toma 2.5 gramos de tierra y se resuspenden en solución salina estéril

hasta un volumen final de 50ml. A continuación se hacen diluciones
decimales y se siembran 0,2mL de cada una sobre un medio adecuado.
Tras la incubación en la placa de la dilución 1/1000000 crecen 200
colonias, calcule el numero probable de UFC por gramo de tierra y el
RTG de la resuspension.

13. ¿Desde su punto de vista cual es la importancia de aplicar

correctamente las técnicas de siembra para el futuro desempeño de su
profesión?

Si una muestra es tomada de un lugar a otro adecuadamente, se podrá

obtener un resultado perfecto que ayudara a conocer acerca del
microorganismo que se encuentre en ese cultivo. Para mi profesión es
importante puesto que si queremos resultados, debemos hacerlo de la
manera correcta además podríamos hacer una investigación con los
estudiantes, donde se genere prácticas de laboratorio y de conversación
sobre los microorganismos que se encuentran en su casa y como se pueden
sembrar y observar. Y si ingreso por parte de la docencia me gustaría realizar
artículos investigativos acerca de los errores comunes que ocurren en las
técnicas de siembra o los microorganismos mas comunes observados en
nuestro ambiente.
 CONCLUSIONES

- Dependiendo de la bacteria sea Gram positiva o Gram negativa, así mismo

cuando se realice los cultivos de agares inhibirá en unos y en otros sí. Por su
afinidad al colorante especifico.

- Se trabajó con dos grupos de bacterias como lo son la escherichia coli y los
estafilococos.

- Posiblemente algo contamino o al hacerlo no estaba muy bien con el caldo

nutritivo, por ende al plasmarlo en los agares, este se contamino y no creció
lo que debía crecer.

- Se tomaron anotaciones del control de calidad de las dos cepas, donde se

escribió control físico-químico y su control microbiológico

- Para poder identificar si el cultivo dio un crecimiento de gram +, se realiza la

prueba de catalaza.

-
 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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L_GUIA_DE_PRACTICA_N_MATERIALES_Y_EQUIPOS_DE_USO_M%C3
%81S_FRECUENTE_EN_MICROBIOLOGIA