Preparación de Medios de cultivo - Métodos de Siembra de Microorganismos Objetivos 1. Aprender la preparación y manipulación de los medios de cultivo.

Materiales: frasco con medio de cultivo deshidratado, medio líquido y sólido, matraz o erlenmeyer de 500 mililitros , balanza, probeta, espátula, papel kraft, plancha de calentamiento, varilla de vidrio, agar nutritivo y cinta indicadora de pH. Procedimiento: Para iniciar el desarrollo de la práctica debe previamente realizar un estudio atento de la teoría sobre: Medios de Cultivo y los vídeos: Preparación y medios de cultivo parte 1 y parte 2 . Preparación de medio de cultivo º Revise la etiqueta de los medios de cultivo, anote el nombre, la composición y forma de preparación. º Realice los cálculos para preparar los siguientes volúmenes de medio de cultivo tanto líquido como sólido: 325, 356 ml, 1567 ml, 131 ml y 24 ml º Prepare en un erlenmeyer 325 mililitros de agar. De acuerdo a las indicaciones de preparación se utilizan 20 gramos de medio deshidratado por litro de agua. Recuerde para el cálculo se realiza una regla de tres: 20 gr....... X gr......... 1000 ml 325ml X= (20 gr.x 325ml)/1000= 6.5 gr.

º Pese 6.5 gramos del agar deshidratado. Mida 325 mililitros de agua destilada con una probeta. De esos 325 mililitros de agua destilada coloque la mitad en un erlenmeyer previamente lavado con agua destilada, para eliminar residuos de otras sustancias. El erlenmeyer debe ser de volumen superior a la cantidad que se va a preparar. Agregue los 6.5 gramos de agar deshidratado al agua contenida en el erlenmeyer y posteriormente adicione el resto del agua destilada. Mezcle con el agitador. º A continuación lleve la preparación a disolver en la plancha de calentamiento, agite constantemente con ayuda de la varilla de vidrio hasta que ebulla para lograr la disolución total del Agar. Mida el pH con ayuda de cinta indicadora de pH. El rango de pH en este medio es de 7.0 a 7.5. Si se hace necesario la corrección del pH, añada al medio de cultivo preparado la cantidad adecuada de solución de ácido clorhídrico o de hidróxido sódico según el caso. º Tape la boca del erlenmeyer con un tapón de papel kraft y selle con cinta de enmascarar. Si las normas de preparación no indican otra cosa, la esterilización se lleva a cabo en autoclave, a 121 grados centígrados, durante 15 minutos. º Esterilizado el medio deje enfriar aproximadamente a 45°C. º Proceda a servir el medio en presencia del mechero y en cajas de Petri, previamente esterilizadas. Las burbujas de aire en la superficie de la placa se eliminan “abanicando” brevemente la superficie con la llama no luminosa de un mechero Bunsen. Deje enfriar hasta que solidifique. º A continuación realice la prueba de esterilidad que consiste en llevar los medios a incubar a 37 grados centígrados durante 12 o 24 horas. Esta prueba se evalúa por la presencia o ausencia de crecimiento posterior a la incubación. Las placas con medio de cultivo y el caldo preparado son claros e incoloros hasta con una tonalidad amarillenta.

º Observar el crecimiento obtenido. º Realice movimientos de rotación con el asa para emulsionar con el caldo las paredes del tubo. Introduzca el asa en tubo sin tocar las paredes y tome un poco de colonia del cultivo. enfriar. flamee la boca del tubo. rejilla con el fin de lograr un cultivo puro. Posteriormente lleve los tubos con caldo a esterilizar en autoclave. retire la tapa del tubo. Siembra de Microorganismos Materiales y equipos: Asas Cepa Tubos Tubos Cajas Mechero Cinta Fósforos Agar Cajas Incubadora bacteriológicas microorganismo nutritivo inclinado nutritivo bunsen enmascarar fundido estériles con pura con con de agar de de nutritivo petri caldo agar nutritivo Procedimiento Para iniciar el desarrollo de la práctica debe previamente realizar un estudio atento de la teoría sobre: Sistemas de siembra y los vídeos: Métodos de siembra parte 1. Si no hay crecimiento el caldo queda transparente Siembra de medio líquido a sólido º Proceda en la misma forma que en la siembra anterior pero con el asa de argolla. destapelo. Dispense el caldo directamente en los tubos con tapa rosca. Tome el tubo de caldo nutritivo estéril en el cual va a colocar la muestra. • Para crear • Esterilice un ambiente un asa de esterilidad encienda el mechero recta a la llama de un y trabaje mechero siempre y al lado déjela de el. flamee nuevamente la boca del tubo. parte 2 y parte 3 Siembra de medio sólido a medio líquido • Marque correctamente los tubos con el número del grupo. No olvide que cuando se va a esterilizar medios directamente en los tubos estos no deben tener la tapa ajustada. • Tome el tubo que contiene la muestra a sembrar. Finalmente tenga en cuenta que para preparar Agar inclinado en tubo. tápelo y déjelo en una gradilla. Si la siembra es en tubo recuerde hacer punción y estría. Realice la preparación de la misma manera. . Retire el asa. agotamiento. º Incube los tubos a 37ºC por 24 horas. solo cambia el momento en que se pone a solidificar ya que los tubos deben colocarse sobre una pipeta para lograr que se forme el pico de agar inclinado. sistema de siembra utilizado y la fecha.º Prepare caldo nutritivo para tal fin solamente se emplean 8 gramos de Agar deshidratado por litro de agua. flamee la boca del tubo y tape. flameando la boca el tubo con el mechero e introduzca el asa con la muestra obtenida. º Esterilice el asa en el mechero después de usarla. Si es en caja puede utilizar diferentes sistemas como estría.

Esterilice el asa. tome las dos ultimas estrías y siga estriando hasta el numero 3. Siembra por estrías Marque la caja en 6 puntos. en forma de L y L invertida. Esto garantiza una distribución homogénea de las bacterias en todo el agar para facilitar su posterior recuento. realice estrías hasta el numero 2. Por punción: Introduzca el inoculo con el asa recta hasta el fondo del medio con un solo movimiento y teniendo cuidado de hacer el mismo trayecto de entrada que de salida. Coloque la muestra en el punto numero uno. Siembra en profundidad Marque la caja de petri estéril con el número de grupo. Esterilice el asa y gire la caja hasta el numero 2. luego frote toda la superficie del agar. Le evaluación del crecimiento en las placas de agar se hace a través de la observación de colonias en la superficie . márquelos con el número de grupo. Abra ligeramente la caja de Petri cerca del mechero. la fecha y siembra en profundidad. tenga cuidado de no tocar las estrías ya hechas. Siembra masiva Tome un hisopo estéril e introdúzcalo en el tubo que contiene la muestra a sembrar. transfiera 1 ml de éste cultivo a la base de la caja de petri estéril. agotamiento y rejilla con el fin de lograr un cultivo puro. Siembra en rejilla Realice una estría que atraviese el centro del agar. Coloque la muestra a sembrar en el numero 1. Por estría: Extienda el inoculo sobre el agar inclinado deslizando suavemente el asa por la superficie en forma de zigzag.Siembra de medio sólido a sólido º Proceda de la misma forma que en la siembra anterior pero utilizando el asa recta. y por último en forma de 8. º Envuelva las cajas de Petri y los tubos con cinta de enmascarar. Luego incube 37º c por 48 horas. marque la base de la caja de petri con los números 1. 2 y 3. º Vierta un poco de agar nutritivo en la caja de Petri. la fecha.0% y se emplean para obtener colonias aisladas. Los medios sólidos contienen agar en proporción de 1. Las placas de agar se pueden inocular mediante varios métodos: como estrías. Voltee el agar en ángulo de 90 grados y realice estría hasta cubrir todo el agar. realice estrías hasta la mitad de la caja. Descarte la pipeta en el frasco de boca ancha con clorox. Evalué la presencia de crecimiento en el agar por la formación de una película o por el crecimiento de colonias en la superficie. Gire la caja y termine de estriar. tome las dos ultimas estrías y extiéndalas hasta el numero 4 y así sucesivamente hasta llegar al numero 6. Luego realice estrías en ángulo recto con respecto a la estría inicial. tape la caja y luego realice movimientos suaves sobre el mesón. tome las dos ultimas estrías y extiéndalas hasta el numero 3. en el sentido de las agujas del reloj. No olvide flamear la boca del tubo antes y después de la siembra. Siembra en agar inclinado Esta se realiza por punción y por estría. º Abra un tubo con cultivo de bacterias y con ayuda de una pipeta de Pasteur plástica.5 a 2. Siembra por agotamiento Tome una placa de agar. . luego al contrario.

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