CARACTERIZACIÓN DE MICROORGANISMOS

EN DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO

4,2

Anlly Lorena Rodriguez Arevalo

Carol Melisa Molina Rodríguez
Yennifer Katherine Mesa Benitez
Natalia Carolina Briceño Ladino
(Estudiantes)

Maria Camila Patiño Ramirez

(Docente)

UNIVERSIDAD MILITAR NUEVA GRANADA

MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL
FACULTAD DE INGENIERÍA
QUINTO SEMESTRE
2022
 1. INTRODUCCIÓN

En el presente informe de laboratorio, referente a la práctica realizada sobre preparación,

esterilización de medios de cultivo y siembra de microorganismos en el laboratorio, se
encontrarán una serie de fotografías, caracterizaciones y análisis de los resultados que se
obtuvieron en el laboratorio.
se tendrá o se tuvo? ( es el informe en pasado)
Para estas práctica se tendrá en cuenta el fundamento de los diferentes medios de cultivo
Gram
utilizados, el Agar TSI es usado para la diferenciación de bacilos gram negativos entéricos
basado en la fermentación de carbohidratos (sacarosa, lactosa y dextrosa) y la producción de
esto necesita conexion en la redaccion
ácido sulfhídrico.Fundamento: El agar TSI contiene tres azúcares: dextrosa, lactosa y sacarosa;
rojo de fenol para detectar la fermentación de estos carbohidratos, y sulfato ferroso para
detectar la producción de ácido sulfhídrico. La degradación o fermentación del azúcar con
formación de ácido se manifiesta por un cambio de color del indicador Rojo de fenol que vira
de anaranjado-rojizo a amarillo, o por un viraje a rojo intenso en caso de alcalinización. El
tiosulfato es reducido por algunos gérmenes a ácido sulfhídrico, el cual reacciona con la sal
férrica produciendo sulfuro de hierro (Medios de Diagnóstico Microbiológico, 2020).
El agar de patata dextrosa es un medio recomendado para la detección y enumeración de
hongos y levaduras a partir de alimentos como productos lácteos, cárnicos y frutos secos. Este
medio es selectivo ya que su alto contenido de glucosa y bajo pH favorecen el crecimiento de
los hongos y levaduras, además el extracto de patata exalta el crecimiento micelial aéreo y la
formación de pigmentos característicos sobre todo en Fusarium, Aspergillus y Penicillium
(Calidad, 2020).
El Agar Nutritivo Estándar es un medio adecuado para el cultivo y enumeración de bacterias
exigentes. La adición de sangre, fluido de ascitis o suero lo hace también adecuado para cultivar
estreptococos, neumococos y otros microorganismos. Se emplea para la enumeración y el
aislamiento de bacterias, y también como una base de alto grado para preparar medios de
cultivo especiales. Las peptonas presentes en la fórmula proporcionan nitrógeno, vitaminas,
minerales y aminoácidos esenciales para el crecimiento. El extracto de levadura es una fuente
de vitaminas, particularmente del grupo B. La dextrosa es el carbohidrato fermentable que
proporciona carbono y energía. El cloruro de sodio suministra electrolitos esenciales para el
transporte y el equilibrio osmótico. El agar bacteriológico es el agente solidificante (Condalab,
2008).
Para esta práctica se reconocieron los diferentes medios de cultivo teniendo en cuenta su
fundamento para determinar qué tipo de microorganismos crecen en cada uno de ellos, se
aprendió a caracterizar de forma macro y microscópicamente los diferentes organismos
sembrados, se recordaron diferentes técnicas esenciales para el trabajo en el laboratorio como
la técnica de Tinción de Gram para determinar el tipo de bacteria que se tiene en el cultivo y
el manejo de utensilios en el laboratorio.
2. METODOLOGÍA

a. Preparación de medios
se realizaron
Antes de iniciar la preparación de medios se hacen los cálculos de la cantidad de medio
requerido teniendo en cuenta que, generalmente en cada caja de Petri se necesitan 20
ml de medio y en los tubos 5 y 10 ml dependiendo el medio, los cálculos están hechos
para todo el grupo:

● PDA: Se necesitan 40 cajas de Petri entonces, 40 * 20 = 800 ml y de medio

sólido 39 gramos por litro.
● AGAR NUTRITIVO: Se necesitan 40 cajas de Petri entonces, 40 * 20 = 800 ml
y de medio sólido 29 gramos por litro.
● TSI: Se necesitan 20 tubos entonces, 20 * 5 = 100 ml y de medio sólido 65
gramos por litro, es decir, 6.5 gramos en 100 ml.
● CALDO NUTRITIVO: Se necesitan 10 tubos entonces, 10 * 10 = 100 ml y de
medio sólido 8 gramos por litro, es decir, 0,8 gramos en 100 ml.

Posteriormente se mezclan en un Erlenmeyer, el medio de cultivo sólido y el agua

destilada calculada, agitando el medio hasta que se obtenga una solución homogénea y
se pone a calentar ligeramente tapado, dejando hervir, si lo requiere (para el caso de
agares). En el caso de los caldos, estos no se calientan y se sirven en los tubos de ensayo
antes de esterilizar. Posteriormente se marca adecuadamente el recipiente, colocando
cinta indicadora de esterilidad, cierre ligeramente el frasco, de igual forma, las cajas de
Petri se marcan y envuelven en paquetes de 10, se coloca cinta indicadora de esterilidad
y se esteriliza en autoclave a 121°C durante 15 minutos con una presión de vapor de 15
libras/pulgadas.

Figura 1. Marcación Cajas Petri

 Figura 2. Preparación Esterilización de Cajas Petri

Cumpliendo con el tiempo de esterilización, se deja enfriar la autoclave hasta que la

aguja del manómetro esté en máximo una libra de presión y se abre la válvula de la
autoclave para dejar escapar el vapor restante.

Figura 3. Medios de Cultivo

Retirar el recipiente que contiene el medio de cultivo con precaución, no deje el medio
en una superficie fría. Déjelo enfriar hasta una temperatura media de 42-45°C que
corresponde a la temperatura en que se puede tocar el medio sin quemarse y sirva en
cajas de Petri.

Figura 4. Preparación Medio de Cultivo

 En algunas preparaciones como en pico de flauta, se deben sacar los tubos de la
autoclave y dejarlos solidificar en una superficie inclinada. Para conservar y evitar la
contaminación de los medios de cultivo, se colocan en el refrigerador a 4°C, recubiertas
con vinipel y antes de ser usados deben aclimatarse, por lo menos durante 15 minutos.

b. Siembra de Microorganismos
En esta práctica se realiza el repique, ya que las muestras sembradas provienen de otro
cultivo microbiano al que se denominará cultivo puro, generalmente esta técnica se usa
para bacterias.
para hongos tambien ( para cualquier morg)

Figura 5. Cultivo Puro “E.coli” Figura 6. Cultivo Puro “S.aureus”

la primera vez que mencionen el morg debe estar nombre completo, luego si abrevian
Inicialmente, con la técnica de agotamiento, se toma la caja de Petri en la palma de la
mano y ligeramente inclinada; con la mano contraria, se manipula el asa de argolla
previamente esterilizada por flameado directo a la llama y con ella se recoge el material
del cultivo puro.

Figura 7. Técnica de Agotamiento

Posteriormente se realiza una estria desde un borde de la caja hacia el otro en zig zag,
luego se atraviesa horizontalmente una estría, partiendo de la primera, arrastrando los
microorganismos hacia el otro extremo de la caja y se repite el proceso, teniendo en
cuenta que al finalizar un grupo de estrías se entierra el asa en el agar con el fin de
reducir la carga microbiana, al finalizar se debe esterilizar nuevamente el asa antes de
descartarla. Al terminar el proceso se incuba la caja de Petri a 37°C por 24-48h.

Figura 8. Siembra de Bacterias

A continuación se siembran hongos por punción, es decir se toma la caja de Petri con
el cultivo puro, se esteriliza el asa micológica, después se toma una porción de la
muestra raspando la superficie de la caja donde se encuentre el hongo joven.

Figura 9. Cultivo Puro “Cladosporium” Figura 10. Cultivo Puro “Penicillium”

Cladosporium sp. Penicillium sp.
Luego cerca al mechero se abre la caja de Petri esteril con PDA y se entierra el asa en
el agar en diferentes puntos, preferiblemente los cuatro extremos, se lleva a incubación
a 28° C por 7 días.
Para hacer la siembra en medio líquido, se esteriliza el asa redonda y se enfría antes de
tomar la muestra de bacteria para introducirla en el tubo con caldo nutritivo y se agita,
 teniendo en cuenta que se toma el tubo cerca del mechero se destapa con una mano y
no se coloca sobre la superficie de trabajo, luego se lleva a incubación a 37°C por 24-
48h.

Figura 12. Siembra en caldo nutritivo

En la siembra en medio de cultivo en pico de flauta, se esteriliza el asa recta, tomando

un inóculo, se abre el tubo de ensayo cerca al mechero con una mano y se pica el medio
de cultivo inclinado (TSI) con el asa hasta el fondo, posteriormente se saca el asa hasta
la superficie de pico de flauta y sobre esta se hacen estrías. Llevar a incubación a 37°C
por 24-48h.

Figura 13. Siembra en TSI

c. Caracterización de los cultivos

Principalmente se hacen dos tipos de caracterización, macroscópica y microscópica, en
la primera se observan los atributos físicos como color, forma, pigmentación y textura,
por otro lado, para caracterizar microscópicamente, primero se hace tinción de Gram y
se observa en el microscopio: las bacterias en objetivo 100X, recordando poner una
gota de líquido de inmersión, y los hongo en objetivo 40X, se tiene en cuenta la forma
y el color de los microorganismos (Gram positivas: morado, Gram negativas: fucsia; en
el caso de los hongos azul y levaduras morado).
hay hongos que no tiñen de azul, denominados dematiaceos ( por ej Cladosporium

Figura 14. Tinción de Gram

Para hacer la tinción de Gram se utilizan cuatro reactivos, primero se pone una gota de
agua en la lámina, cerca al mechero se abre la caja de Petri y se raspa la colonia,
posteriormente se pasa sobre la gota de agua expandiéndose sobre la lámina, luego se
seca al lado del mechero y se fija pasando la lámina por la llama alrededor de 3 veces
rápidamente, dentro del recipiente correspondiente, se pone la lámina en el soporte,
después se agrega cristal violeta por 1 minuto, seguidamente lugol por un minuto,
alcohol acetona por 30 segundos y por último fucsina por otro minuto, sin olvidar que
al terminar el tiempo establecido para cada reactivo se debe enjuagar con agua destilada.
Antes de poner la lámina en el microscopio se debe secar cerca de la llama y cubrir con
una laminilla.

Figura 15. Tinción de Gram “E.coli” Terminada

 En el caso de los hongos, primero se pone una gota de azul de lactofenol en la lámina,
con cinta adhesiva se corta un pedazo y se toca ligeramente el hongo joven de la caja
de Petri cerca al mechero, se coloca sobre la gota del reactivo en la lámina y se limpia
los residuos, para llevarlo al microscopio.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Luego de observar los cultivos de microorganismos obtenidos que fueron pasados al
microscopio después de realizarles Tinción de Gram se lograron recoger los
siguientes resultados.
a. Bacterias
Agar Nutritivo
E.coli
La bacteria E. coli fue sembrada en el medio de cultivo Agar Nutritivo, esto se debe a
que cuenta con pocos requerimientos nutricionales para su reproducción. Su
caracterización a nivel macroscópico se dio por medio de colonias con textura lisa y
delgada, con un color hueso distintivo.
Mencionen la figura

Figura 16. Cultivo Bacteria “E.coli” Agar Nutritivo

Después de realizar Tinción Gram en E.coli lo que se observó en el microscopio de
acuerdo a las características microscópicas es que esta bacteria se encuentra en forma
de bacilos, presentando una Gram negativa como lo indica su tono fucsia. De acuerdo
a lo encontrado se tiene que la Bacteria E. coli se caracteriza por tener bacilos Gram
negativos rectos, con un diámetro de 0.3 a 1.5 micras. No forman esporos. Se
desarrollan en presencia o en ausencia de Oxígeno (aerobios-anaerobios facultativos).
Se desarrollan rápidamente en medios simples, no siendo exigentes desde el punto de
vista nutricional. En los medios de cultivo forman colonias lisas, convexas y circulares
de bordes definidos (Algorta, 2001).
 Figura 17. Colonias Microscópicas Cultivo “E.coli”
aumento en el micro? 100x

Staphylococcus Aureus
La bacteria S.aureus a diferencia de E.coli no tuvo crecimiento previo después de
realizar el cultivo, pues al observar la caja de petri con la siembra se evidencia que el
agar se encuentra turbio y opaco, por lo cual se llega a pensar que la caja de petri estuvo
expuesta y se contaminó antes de la siembra de la bacteria y por lo tanto, restringió el
crecimiento de esta. La contaminación microbiana debe detectarse tan pronto como sea
posible. Los métodos de detección dependen de la naturaleza del microbio. Incluyen el
uso de ensayos biológicos, PCR, fluorescencia o tinción química, microscopía óptica,
turbidimetría, mediciones de pH o visual (simple inspección). Generalmente se pueden
identificar bacterias y hongos por microscopía óptica. Su rápida tasa de crecimiento
permite su detección a simple vista a las 48 horas, los cultivos contaminados aparecen
turbios o manchados (Ibian Technologies, 2021).

Figura 18. Contaminación Medio de Cultivo Agar Nutritivo Bacteria “S.aureus”

Al observar esta anomalía en el microscopio después de pasarla por Tinción de Gram

se evidencian características microscópicas de bacilos esporulados que por sus
 particularidades son resistentes a temperaturas altas y por esa razón al esterilizar las
cajas de petri en el autoclave, dicha contaminación no pudo ser destruida. Estos bacilos
presentan Gram positiva, pues como se observó en el microscopio, cuenta con un color
morado que es distintivo a esta.
deben indicar que entonces no es S. aureus pues su morfologia son cocos Gram positivos

Figura 20. Colonias Microscópicas Bacilos Esporulados

Esta bacteria está clasificada como un coco Gram positivo que se agrupa en racimos y
acompañados de abundantes leucocitos polimorfonucleares, las colonias típicas de
S.aureus son de color amarillo debido a la fermentación manitol, mientras que las
especies de Staphylococcus coagulasa negativa producen colonias de color rojo
(Pasachova Garzón et al., 2019).

Agar TSI
E.coli
Esta bacteria fue sembrada en tipo pito de flauta en el medio agar TSI. Sus
características macroscópicas presentan una superficie alcalina y profundidad alcalina
del medio de cultivo, por lo tanto, presenta color rojo en ambos, esto se debe a que
dicha bacteria no actúa como fermentador de ningún tipo de azúcar.
 Figura 21. Cultivo Bacteria “E.coli” Agar TSI

Algunos se desarrollan en glucosa como única fuente de carbono, mientras otros

requieren el agregado de vitaminas y/o minerales en el medio de cultivo. Son
quimioorganotrofos, poseen metabolismo fermentativo y respiratorio. Son catalasa
positivos y oxidasa negativos; reducen los nitratos a nitritos. El contenido de Guanina
+ Citosina del ADN total es de 38 a 60 moles (Algorta, 2001).

Staphylococcus Aureus aureus en minuscula

Figura 22. Cultivo Bacteria “Staphylococcus Aureus” Agar TSI

Esta bacteria fue sembrada en tipo pito de flauta en el medio agar TSI, se caracterizan
por presentar een la superficie del agar una sustancia color amarillo, donde su siembra
se realizó en un agar sangre de caballo, de esta manera se le llama hemólisis, los
estafilococos patógenos fermentan el manitol y producen colonias amarillas. Los
estafilococos no patógenos no lo fermentan y producen colonias de color rosa. Este
fermenta el manitol para que de esta manera se forme una colonia amarilla sobre el agar
por la acidificación que se presenta en el medio (Antonio et al., 2010), de acuerdo a esto
se confirma que la bacteria sembrada en el TSI es Staphylococcus Aureus debido a lo
anterior como esta bacteria tiene estafilococos patógenos que producen colonias
 amarillas.

Caldo Nutritivo

Figura 23. Cultivo Bacteria “E. coli” Caldo nutritivo.

En el caldo nutritivo se realizó el cultivo de la bacteria E.coli donde en uno de los

tubos se notaba una nata blanca y el líquido no tenía gran turbidez. En los cultivos
líquidos no tiene lugar la formación de colonias, por lo tanto, no sirven como técnica
de aislamiento. La utilización de medios de cultivo líquidos permite la obtención de una
población microbiana grande, con un elevado número de microorganismos, para ser
utilizados posteriormente. En estos cultivos se examinará la existencia de
enturbiamiento más o menos intenso, la formación de una película o velo sobre la
superficie, la aparición de sedimento en el fondo del tubo (Lim, 2020).

b. Hongos
Agar PDA
Penicillium sp.
El hongo Penicilliumsp-como pudimos observar, cuenta con características
macroscópicas particulares, pues en el cultivo obtenido presenta un color grisáceo y
una textura aterciopelada, además, su reproducción durante 8 días fue la más avanzada
frente a otros cultivos de hongos, pues gracias a su constitución su temperatura óptima
de crecimiento está entre los 20 a 30ºC. Entonces podría decirse que a temperatura
ambiente su crecimiento será óptimo y de mayor rapidez frente a otros hongos .
 Figura 24 . Cultivo Hongo “Penicillium” Agar PDA

Al realizar Tinción con azul de lactofenol y observar en el microscopio, se evidencio la

presencia de hifas hialinas y conidióforos que la mayoría de las veces forman un tipo
de pincel que hace parte de sus características microscópicas.
Macroscópicamente las colonias son normalmente de crecimiento rápido; al principio
de color blanco y con el tiempo adquieren color azul, azul verdoso, verde, gris oliva o
tonos rosados, con reverso amarillo cremoso. La textura puede ser plana, filamentosa,
aterciopelada o algodonosa dependiendo de la especie; además puede presentar gotas
de exudado. Microscópicamente presenta hifas hialinas Septadas. Los conidióforos
tienen ramas secundarias, denominadas métulas. Estas son de forma cilíndrica, con
paredes lisas y portan de 3 a 6 fiálides en forma de matraz; de las cuales surgen largas
cadenas sin ramificar de esporas o conidios formando el penacho o pincel característico
del género (spp, 1971).

Figura 25 . Colonias Microscópicas Cultivo “Penicillium”

Cladosporium no entiendo que el hongo tenga un conjunto de mohos

El hongo Cladosporium cuenta con conjuntos de mohos interiores y exteriores bastante
comunes. En este cultivo no se presentó una tasa de crecimiento alta, esto se debe a la
contaminación del medio y del cultivo de dicho hongo provocada por penicillium al
momento de realizar la siembra, pues Cladosporium cuenta con una temperatura óptima
de crecimiento menor a Penicillium por lo tanto su crecimiento fue menor. Sin embargo
se logró obtener una colonia que no estaba contaminada donde se observó su color
verde grisáceo acompañado de pliegues de color blanco tipo venosos y una textura
atercipelada general de la colonia.

Figura 26 . Cultivo Hongo”Cladosporium” Agar PDA

.

Cladosporium microscópicamente cuenta con hifas finas que sostienen cadenas

ramificadas de conidios unicelulares capaces de formar una red celular alargada y
cilíndrica envuelta en una pared celular y de esta manera presentar su forma de pincel.
De esta manera el Cladosporium macroscópicamente forma colonias que se forman a
partir del crecimiento de una línea celular en este caso crecieron de manera
aterciopelada y pliegues radiales que tienden a oscurecerse así como ocurrió en nuestro
cultivo a pesar de la contaminación que se presentó (Instituto Nacional de Seguridad e
Higiene en el Trabajo, 2014).
 Figura 27 . Colonias Microscópicas Cultivo “Cladosporium”

Levadura

Figura 28 . Cultivo Hongo “Levadura” Contaminado en Agar PDA

Para esta práctica la levadura utilizada fue Saccharomyces cerevisiae el cual es un

hongo unicelular que presenta un sistema genético que, a diferencia de la mayoría de
los otros microorganismos, presenta dos fases biológicas estables: haploide y diploide.
En la siembra de este hongo se presentó contaminación lo que impidió el crecimiento
de nuestra levadura, esto se puede presentar por las cajas de petri utilizadas en algún
proceso anterior a este, en el que no se haya realizado un lavado adecuado y quedaron
contaminados o que al realizar el proceso de siembra de la levadura se encontraban
partículas en el ambiente que alteraron e impidieron el crecimiento de la levadura
(Gonzalez & Valenzuela, n.d.).
 Figura 29 . Colonias Microscópicas Cultivo “Levadura”

4. CONCLUSIONES

● De acuerdo a los resultados que se obtuvieron en nuestra práctica se determinó que se

cumplieron los objetivos planteados, ya que se utilizaron los tres tipos de medios de
cultivo identificando el crecimiento y el tipo de organismo que es afín con cada uno de
los medios.
● Según lo que se realizó en la práctica se logró identificar el tipo de bacterias sembradas
recordando la tinción de Gram que nos sirvieron para identificar y reconocer las
colonias de manera microscópica clasificándolas como Gram positivas y Gram
negativas.
Penicillium sp.
● El penicillium es uno de los hongos con mayor factor contaminante, pues de acuerdo al
resultado de la siembra de cultivos se evidencio que por sus propiedades fisicoquímicas
esté a temperatura ambiente cuenta con crecimiento óptimo, apto para ser un
contaminante fuerte del medio que lo rodea.
● El autoclave no fue suficiente para esterilizar algunos medios de cultivo como se
evidencia en la levadura dado que el microorganismo resistió y con condiciones
adecuadas se reprodujo efectivamente.
errores de que?
● Los microorganismos no siempre se reproducen eficientemente, por errores de paralaje
o en la esterilización y manipulación de los materiales se puede producir otro
microorganismo totalmente diferente al de muestreo.
5. BIBLIOGRAFÍA

Algorta, G. (2001). Bacilos Gram Negativos No Exigentes. Material Didáctico, 1–14.

http://www.higiene.edu.uy/cefa/Libro2002/Cap 22.pdf

Antonio, J., Nieto, S., & Ramos, S. V. (2010). Editores: Emilia Cercenado y Rafael
Cantón Coordinador: Germán Bou Arévalo Autores: Ana Fernández Olmos Celia
García de la Fuente. Eimc.

Calidad, C. De. (2020). PDA ( Potato Dextrose Agar ) Acid PDA ( Potato Dextrose
Agar ) Acid. 2–3.

Condalab. (2008). Agar Nutritivo Estándar I. 2–3.

Gonzalez, A., & Valenzuela, L. (n.d.). Libros. Retrieved February 25, 2022, from
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Ibian Technologies. (2021). Como combatir la contaminación microbiana en los

cultivos - IBIAN Technologies. Iviantech.Com. https://www.ibiantech.com/como-
combatir-la-contaminacion-microbiana-en-los-cultivos/

Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo. (2014). Fichas de agentes

biológicos: Cladosporium spp. DataBio, 14, 1–4.
http://www.insht.es/RiesgosBiologicos/Contenidos/Fichas de agentes
biologicos/Fichas/Hongos/Cladosporium spp.pdf

Lim, S. (2020). Microbiología General Trabajo Práctico No 2 Identificación De De

Microorganismos. 1–28.

Medios de Diagnostico Microbiológico. (2020). SERIES DE IDENTIFICACIÓN

BIOQUÍMICA (UREA,CITRATO, LISINA, SIM Y TSI). Versión.
www.mdmcientifica.com

Pasachova Garzón, J., Ramirez Martinez, S., & Muñoz Molina, L. (2019).
Staphylococcus aureus: generalidades, mecanismos de patogenicidad y
colonización celular. NOVA, 17(32), 25–38.
https://doi.org/10.22490/24629448.3631

spp, P. (1971). Fichas de agentes biológicos.