INFORME 4

SIEMBRA EN AGAR INCLINADO EN TUBO DE ENSAYO

OBJETIVOS

Objetivo general

 Utilizar test bioquímicos para determinar las distintas propiedades de los agares SIM,
CITRATO, TSI Y SS.

Objetivos específicos

 Aplicar la siembra en agar inclinado para aplicar los distintos test bioquímicos.
 Observar las diferencias entre cada uno de estos medios de cultivo.
 Observar en el Agar SIM si existe motilidad en los microorganismos.

MARCO TEÓRICO

El agar, una sustancia similar a la gelatina que se extrae de las algas rojas, es usado
comúnmente para cultivar microorganismos. Se le agregan varios nutrientes para favorecer el
crecimiento bacteriano y se coloca tanto en placas planas como en tubos de ensayo. Cuando
se coloca en un tubo de ensayo, el agar está en forma líquida. Estos luego son colocados en
ángulo para que se enfríen y solidifiquen, creando una superficie inclinada, o un
agar inclinado (agar slant, en inglés).
INCLINACIÓN:
Los medios de agar inclinado se realizan llevando el agar a punto de ebullición y vertiéndolo
en un tubo de ensayo. Antes de que el agar se enfríe y solidifique, el tubo de ensayo se
coloca inclinado sobre un lado. Una vez que el agar se enfría, el tubo puede volver a
colocarse en posición vertical y el agar que se encuentra en su interior se verá inclinado.
El inóculo se siembra, con ayuda de ansa, de la siguiente manera:
En profundidad con ansa de punta: se pica con el ansa el cultivo a sembrar y se introduce
mediante punsión en el medio contenido en la parte inferior del tubo
En superficie con ansa de aro: se pica con el ansa el cultivo a sembrar y se esparce el mismo
sobre la superficie en bisel en forma de zigzag.

AGAR TSI: En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los

nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los
hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la
producción de ácido sulfhídrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+, los
cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro.
AGAR SS: En el medio de cultivo la pluripeptona y el extracto de carne aportan los
nutrientes para el desarrollo microbiano. Las sales biliares y el verde brillante inhiben el
desarrollo de una amplia variedad de bacterias Gram positivas, de la mayoría de los
coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp. La lactosa es el hidrato de carbono
fermentable. El tiosulfato de sodio permite la formación de SH2que se evidencia por la
formación de sulfuro de hierro.
AGAR SIM: Medio de cultivo en el cual la tripteína y la peptona aportan nutrientes para el
desarrollo microbiano. El triptófano es un aminoácido constituyente de muchas peptonas y
particularmente de la tripteína y puede ser metabolizado por algunas bacterias para formar
indol. En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol
producido se combina con el aldehido del reactivo de Ehrlich (Indol Reactivo ReF
B1550361) o de Kovac ś , para originar un compuesto de color rojo.
AGAR SCA: En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno
y el citrato de sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para
el desarrollo bacteria-no. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es
cofactor enzimático. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, el azul de bromotimol
es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino y el agar es el agente
solidificante. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces
de utilizar citrato como única fuente de carbono usan sales de amonio como única fuente de
nitrógeno, con la consiguiente producción de alcalinidad.
MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

Reactivos

 Alcohol al 96%
 Agar SS
 Agar SIM
 Agar SCA (Simmons Citrato Agar)
 Agar TSI
 Agua destilada

Materiales

 Mandil de laboratorio
 Guantes
 Papel aluminio
 Balanza electrónica o analítica
 Probetas
 Agitador magnético
 Medidor de pH
 Autoclave
 Mechero Bunsen o lámparas de alcohol
 Placas de Petri de vidrio
PROCEDIMIENTO

El profesor realizo la demostración para: envolver las cajas Petri y pipetas con papel
periódico, como elaborar tapones para tubos y matraces.

Preparación del material de vidrio y medios de cultivo

1. Lavar el material de vidrio y enjuagar con abundante agua dstilada.

2. Preparar en los Erlenmeyers los medios indicados anteriormente según los cálculos
indicados.
3. Calentar el medio en el reverbero con agitación constante hasta ebullición, cuidar que
no se derrame.

Esterilización de materiales y medios de cultivo

1. Los medios de cultivo y materiales se esterilizaran en autoclave de acuerdo con las

siguientes instrucciones:
a. Revisar que el agua en el autoclave este limpia y el nivel coincida con la marca en
el tubo indicador. En caso de ser necesario cambiar o añadir agua destilada.
b. Conectarla y poner la perilla de control en calentamiento a 121°C. con el uso de
guantes, acomodar los medios y materiales en la canasta de la autoclave y
colocarla dentro.
c. Dejar que el equipo se caliente hasta alcanzar los 121°C o 15lbs/in 2 de presión y
mantener estas condiciones durante 15 minutos. Revisar continuamente el
manómetro y regular el control de temperatura a valor medio o mínimo.
d. Apagar la autoclave y dejar que la presión baje al valor de cero. Abrir
cuidadosamente la tapa, desde la parte trasera para evitar que el vapor caliente
cause quemaduras.
2. Después de sacar el material, dejar enfriar y abrir los paquetes únicamente en área
aséptica (cerca del mechero).

Vertido de los medios en cajas Petri y solidificación

Enfriar los medios de cultivo de los matraces hasta una temperatura aproximada de 45-50° C,
que coincide con la posibilidad de sostener el matraz en la palma de la mano sin quemarse.
Limpiar la mesa con solución de alcohol al 70% (v/v), encender mecheros y colocarlos a una
distancia de 30cm. Verter entre 10 y 15ml de cada uno de los medios en tres cajas Petri en
esta zona aséptica. Dejar que los medios solidifiquen.

Prueba de esterilidad de materiales

1. Abrir una caja Petri de AST y AS, así como un tubo de CST durante 10 minutos en
zonas no asépticas (patio, aulas, comedor) y etiq uetarlas.
2. Abrir una caja Petri de AST Y AS, así como un tubo de CST durante 10 minutos en
zona aséptica (cerca del mechero) y etiquetarlas.
3. Etiquetar una caja Petri de AST y AS, así
4. como un tubo de CST como control.
5. Colocar los tubos y las cajas Petri en una incubadora ajustada a 37° C durante 24-48
horas. Las cajas Petri se colocaran con la tapa hacia abajo.
6. Revisar los tubos y cajas Petri para detectar la presencia de contaminantes, por la
aparición de turbidez, nata superficial y/o depósito de material en el fondo de los
tubos con medio líquido, así como la formación de colonias microbianas en la
superficie de los medios sólidos.

RESULTADOS OBSERVADOS

AGAR TSI:
 Si la bacteria fermenta la glucosa, acidificará el medio haciendo virar a amarillo el
indicador en el fondo del tubo, mientras que si no es fermentadora de glucosa, el
medio permanecerá de color rojo.
 Si la bacteria fermenta lactosa o sacarosa, acidifica el medio en su agar la superficie
se volverá de color amarillo, mientras que si no lo es, la superficie del medio
continuará de color rojo.
 Si produce ácido sulfhídrico (debido a la reducción de las sales de hierro), se
presentará un ennegrecimiento del tubo. La producción de sulfhídrico y el
consiguiente ennegrecimiento pueden impedir ver la fermentación de la glucosa
(fondo amarillo), pero este hecho implica directamente que la bacteria es
fermentadora de glucosa. Si aparece rotura o desplazamiento del medio, significa que
la bacteria es productora de gas.

AGAR SS:

 Las colonias fermentadoras de lactosa producirán ácidos y cambiará el color del

medio a rosa.
 Como Shigella y Salmonella no utilizan este azúcar forman colonias transparentes.
El tiosulfato es la fuente de azufre para la producción de ácido sulfhídrico de las
 bacterias sulfato-reductoras. Este ácido reacciona con la sal de hierro y se forma
sulfuro de hierro de color negro.
 Las colonias de Salmonella se observan transparentes con un precipitado negro en el
centro.

AGAR CITRATO:

 Una reacción positiva se indica mediante el crecimiento con un color azul intenso en
el agar inclinado. Una reacción negativa se demuestra por la falta de crecimiento o
trazas de crecimiento sin cambio de color (el medio retiene un color verde oscuro).
AGAR SIM:

 La motilidad se pone de manifiesto por la turbidez difusa del medio de cultivo

alrededor del canal de la picadura. La no motilidad se caracteriza por el crecimiento
producido exclusivamente a lo largo de la línea de inoculación. La producción de H2S
se reconoce por el ennegrecimiento de la zona de crecimiento o del medio debido a la
presencia del tiosulfato sódico.

CONCLUSIONES

 AGAR TSI: La fermentación de la lactosa y sacarosa se observa en la superficie y de

la glucosa en el fondo.
 AGAR SS: Salmonella, Shigella crecen adecuadamente en el medio de cultivo, y
producen colonias transparentes.

 AGAR CITRATO: El crecimiento en este medio se vio en el indicador de verde a

azul, que indican que el microorganismo es capaz de utilizar el citrato como
única fuente de carbono.
 AGAR SIM: El desarrollo de microorganismos anaerobios facultativos en este medio
se manifiesta a través de la turbidez.
 Al realizar la tinción se pudo observar que la muestra era de Salmonella ya que
estaban presentes puntos negros.

RECOMENDACIONES

 Usar guantes y tapa boca para evitar contaminaciones.

 Esterilizar el área antes de iniciar el trabajo.
 No colocar materiales sobre el mesón de trabajo.
 Trabajar con el área estéril.
ANEXOS INFORME 4
ANEXOS INFORME 3
BIBLIOGRAFÍA
 BARRETO, Miriam. 1994. Manual Práctico de Microbiología General. Canoabo
 CARPENTER, Philip. 1969. Microbiología. 2da Edición. Editorial Interamericana,
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 GRASSINI, Luis. 1967. Microbiología Agraria. UCV-Facultad de Agronomía.
Caracas-Venezuela.
 BLAIR, J. 1970. Manual Clínico de Microbiología. Bethesda. AMER-Soc-
Microbiológica.