Ortiz Mar Kevin Alejandro Análisis Instrumental Grupo 2551 Equipo 1

Cuestionario de Práctica 4. Cromatografía de líquidos de alta

resolución (CLAR)
1. ¿Cuál es el fundamento de la Cromatografía de Líquidos de Alta
Resolución?

Esta técnica se basa en la interacción de los analitos contenidos en una fase

móvil al pasar dentro de una fase estacionaria (columna). Es decir,
dependiendo de las propiedades del analito, este saldrá de una columna en
determinados tiempos, debido a que las moléculas de la muestra interaccionan
con la columna que puede ser polar o apolar, y cada uno de los componentes
de esta muestra, tendrá una absorbancia diferente al ser analizados por el
detector que puede ser de UV-Vis, diode array o fluorescencia.

2. Definir brevemente los conceptos de cromatografía de líquidos en

fase normal y en fase reversa

Ambas técnicas sirven como métodos de separación, identificación y

cuantificación, sin embargo en fase normal, la fase estacionaria tendrá que ser
una columna de material polar y la fase móvil deberá contener disolventes no
polares. Caso contrario, en fase inversa la columna deberá ser de un material
no polar y las fases móviles tendrán que ser disolventes polares. Esta última
técnica es la más utilizada en estos días, debido a que es menos contaminante.

3. Mencionar tres tipos de disolventes usados como fase móvil y tres

tipos de fases estacionarias usados en cromatografía de líquidos
de fase normal y fase reversa

En fase normal se utilizan columnas de sílica, alúmina o fluorescína como fase

estacionaria, mientras que para fase móvil se utilizan disolventes no polares
como benceno, tolueno o hexano.

En fase inversa para fase estacionaria podemos emplear columnas C8, C18 y
de fenil, en el caso de su fase móvil se utilizan disolventes como acetonitrilo,
metanol, etanol, agua, etc.

4. Mencionar los métodos de cuantificación más utilizados para las

determinaciones cuantitativas por HPLC y describir brevemente
cada uno de ellos.

Se puede utilizar correlación directa entre las áreas de un pico de

concentraciones conocidas y el área del pico de nuestra muestra de interés, o
en su defecto curva de calibración.
 5. En un diagrama indica las partes de un cromatógrafo de líquidos y
describe su función.

El solvente sirve como fase móvil, la bomba succiona el solvente hacia la

válvula potenciadora del solvente, que irá a una presión constante en un flujo
constante, esta llega hacia el inyector, que dentro tiene una válvula que
cambia, para recibir inicialmente la muestra que entra dentro de un loop,
desecha una parte y posteriormente vuelve a cambiar para que entre la fase
móvil empujando a la muestra hacia la columna en la cual por diferencia de
polaridad, los componentes de la muestra interactuarán con la columna,
saliendo en tiempos diferentes y teniendo diferentes concentraciones.
Posteriormente llegan al detector en el cual se analiza (por UV-Vis, diode-array
o fluorescencia) la muestra, ahí el líquido sale hacia los desechos y el detector
envía una señal al software de HPLC, en el cual se verá un cromatograma y
podremos analizar los datos obtenidos.

6. Mencionar los tipos de detectores que pueden acoplarse a un

cromatógrafo de líquidos y describir el fundamento de cada uno de
ellos.

Se puede acoplar un detector de UV-Vis, el cual hará uso de radiación

electromagnética (luz) de las regiones visible y ultravioleta (UV) del espectro
electromagnético, es decir, una longitud de onda entre 380nm y 780nm
mediante una lámpara de Tungsteno. Esta radiación será absorbida por las
moléculas que se encuentren en el líquido, lo que causará transiciones
electrónicas que serán cuantificadas.

En el caso del detector de arreglo de diodos (o diode array) una lámpara de

deuterio envía un haz de radiación que atraviesa la columna cromatográfica,
posteriormente es dispersado por medio de una red de difracción fija, siendo
recogidas simultáneamente todas las longitudes de onda dispersadas mediante
una matriz de fotodiodos.
Por último el detector de fluorescencia hace uso de un haz de luz,
(comúnmente de luz ultravioleta), que excita a los electrones en ciertas
moléculas o átomos y causa la emisión de luz visible que posteriormente será
medido con un fluorómetro.

7. Describe que tipo de muestras pueden ser analizadas.

En esta técnica se pueden analizar muestras líquidas o disoluciones, como

fármacos, ácidos nucleícos, proteínas y otros líquidos purificados (como orina o
jugos), entre otros analitos.

8. ¿Qué parámetros cromatográficos se pueden utilizar para realizar

una identificación de un analito?

El área de un pico conocido de concentración conocida y el tiempo en que está

retenido.

9. ¿Qué parámetros cromatográficos se pueden utilizar para realizar

una cuantificación de un analito?

Factor de asimetría, de cola, eficiencia, resolución, selectividad, tiempo de

retención y tiempo muerto.

10. ¿Qué es un cromatograma?

Es la representación de la respuesta o señal del sistema de detección continuo

o discontinuo en función del tiempo, volumen del eluyente o distancia en el
lecho cromatográfico.

11. ¿Qué parámetros cromatográficos ayudan para evaluar la eficacia

de una separación cromatográfica? Describa cada uno.

La altura del plato y el número de platos teóricos.

12. En los siguientes cromatogramas (figura A del ejemplo 1 y 2)

identifica cada analito considerando que se inyecto una mezcla de
estándares y el estándar interno e indica que analito(s) no se
encuentra presente(s) en la muestra (figura B del ejemplo 1 y 2).

En el ejemplo 1 figura B no se encuentra la sucrosa.

Para el ejemplo 2. Figura B no se encuentra fucosa, galactosa y manosa. Sin

embargo, también se encuentra recorrida la curva de celobiosa, por lo que
podría ser otro analito.