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TALLER DE QUÍMICA ANALÍTICA INSTRUMENTAL

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA HPLC

1. Defina cromatografía en general.

2. Cuáles son los métodos cromatográficos, defina cada uno de ellos.
3. Defina elución y eluyente.
4. Que es un cromatograma para que se usa en cromatografía, dibuje uno y explique
cómo interpretarlo.
5. Defina: Tiempo muerto, Tiempo de retención.
6. Defina velocidad de flujo volumétrico y velocidad lineal, como las relaciono en
cromatografía.
7. Que es y cómo se calcula el factor de retención.
8. Que es y cómo se calcula el factor de selectividad.
9. Describa la relación entre el ensanchamiento de banda y la eficiencia de una columna.
10. Como se determina de manera cuantitativa la eficiencia de la columna.
11. Como se determina el número de platos teóricos?
12. Que variables afectan la eficiencia de la columna? Explique como la afecta y en que
unidades se expresan esas variables.
13. Que es y cómo se determina la resolución de una columna.
14. Defina cromatografía líquida
15. Como se clasifica los tipos de cromatografía líquida de alta resolución según el
mecanismo de separación o el tipo de fase estacionaria.
16. Consulte el diagrama de bloques de los componentes de un equipo HPLC, identifique
cada una de sus partes.

17. Consulte las aplicaciones de la HPLC según el peso molecular y la polaridad del
analito.
Campos de Aplicación de HPLC
 Fármacos: Antibióticos, sedantes esteroides, analgésicos
 Bioquímica: Aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos
 Productos de alimentación: Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos
 Productos de la industria química: Aromáticos condensados, tensoactivos, propulsores,
colorantes
 Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB
 Química forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcóticos
 Medicina clínica: Ácidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina, estrógenos.
Algunas aplicaciones importantes de la HPLC preparativa
 Separación y purificación de metabolitos
 Separación y purificación de los metabolitos de las drogas procedentes de muestras de
orina
 Purificación y separación de enantiómeros
 Purificación de compuestos naturales
 Purificación y caracterización de enzimas y proteínas

18. Que detectores existen en HPLC, que aplicaciones tiene cada uno de ellos.

ULTRAVIOLETA (UV)
Detectores (UV) ultravioletas son rentables y populares y son ampliamente utilizados en
industria. Este tipo de detector responde a las sustancias que absorben la luz. El detector UV
se utiliza principalmente en Ciencias Biomédicas y farmacéuticas para separar e identificar los
componentes activos principales de una mezcla. Detectores de UV son las más versátiles, tiene
la mejor sensibilidad y linealidad. Detectores de UV no pueden utilizarse para las pruebas de
sustancias que son bajas en cromóforos (incoloros o prácticamente incoloros) como no
absorben la luz en la gama baja.

Fluorescencia
La fluorescencia es el más sensible detector HPLC, usado casi exclusivamente en la
cromatografía líquida (LC). Se trata de un detector específico que detecta solamente las
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sustancias que emiten luz. Este detector es popular para análisis de trazas en ciencias
ambientales. Ya que es muy sensible, su respuesta solo es lineal en un rango de concentración
relativamente limitada. Como no hay muchos elementos que fluorescencia (someterse a
fluorescencia o ser fluorescente), los científicos necesitan sintetizar las muestras para hacerlas
detectables.

Espectrometría de masas
El detector de espectrometría de masas acompañado con HPLC se llama HPLC-MS y forma
uno de los mejores tandems analíticas. HPLC-MS es el detector más de gran alcance,
particularmente relevante para la ciencia médica y ampliamente utilizado en laboratorios
farmacéuticos de investigación y desarrollo. El principal beneficio de HPLC-MS es que es
capaz de analizar y proporcionar identidad molecular de una amplia gama de componentes.

Detección del índice de refracción (RI)

El detector de índice de refracción (RI) utiliza un monocromador y es uno de los menos
sensibles detectores de LC. Este detector es extremadamente útil para la detección de estos
compuestos no iónicos, no absorben la luz ultravioleta y fluorescencia no.Las muestras
examinadas con este detector son azúcar, alcohol, ácidos y polímeros .

19. Para los siguientes tipos de cromatografía HPLC: Reparto (Fase Normal, Fase
Reversa), Adsorción, Intercambio iónico, Exclusión Molecular, Afinidad y quiral. Realice:
a. Definición
b. Qué tipo de empaquetamiento tienen las columnas.
c. Que fase móvil y estacionario se usa.
d. Aplicaciones de este tipo de cromatografía.

CROMATOGRAFÍA DE REPARTO
la cromatografía de reparto, en la cual la fase estacionaria es un líquido retenido sobre un
soporte sólido y la separación se debe a la diferente distribución del analito entre la fase móvil y
la fase estacionaria:

Cromatografía de reparto en fase normal: la fase móvil es un disolvente apolar o poco polar
(como el hexano o el isopropiléter) y la fase estacionaria presenta elevada polaridad (el grupo
R es polar).
Cromatografía de reparto en fase inversa: la fase móvil es un disolvente relativamente polar
(disoluciones acuosas con etanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano) y la fase estacionaria es
apolar (el grupo R es un n-octilo, C8, o n-octadecilo, C18). La longitud de la cadena del grupo
alquilo influye en la eficacia de la separación, pues a mayor longitud mayores serán el tiempo
de retención y el tamaño de partícula capaz de retener.

Cromatografía quiral

Usada para separar compuestos quirales. Para esta se requieren fases estacionarias quirales o
aditivos quirales de fase móvil. El agente de resolución quiral (fase estacionaria o aditivo) forma
complejos de manera preferente con uno de los enantiómeros.
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Cromatografía de afinidad (AFC)

De entre todas las técnicas cromatográficas, la Cromatografía de Afinidad (AFC) ofrece

la mayor especificidad y selectividad para el aislamiento y purificación de
biomoléculas. Esta técnica se basa en interacciones bioespecíficas gracias a las cuales la
columna de AFC absorbe únicamente de la muestra los componentes que presentan
afinidad con los ligandos acoplados al soporte cromatográfico. Cuando el compuesto
retenido es eluido, se consiguen niveles de pureza extraordinarios, gracias a la elevada
selectividad de estas interacciones de afinidad