CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS DE ALTA RESOLUCION (HPLC)

PRINCIPALES MECANISMOS DE INTERACCION EN CROMATOGRAFIA LIQUIDA. –

 Adsorción superficial
 Partición
 Intercambio iónico
 Exclusión Molecular
 CROMATOGRAFIA DE ADSORCION. – La fase
estacionaria es sólida. La separación se logra por las
diferencias en solubilidad (en fase móvil) y de
retención por adsorción en fase estacionaria de la
mezcla de solutos.

Silica (90%) y alumina(10 %) son las fases estacionarias más comunes. Tanto las moléculas
de solutos como de disolvente son atraídas hacia los lugares activos polares de la fase
estacionaria.
Se usan mezclas de disolventes para conseguir
el poder de elución y la selectividad adecuadas.
Normalmente un disolvente apolar (n-hexano)
unido a otro más activo (acetona, cloruro de
metilo, etc.).

 CROMATOGRAFIA DE PARTICION. – La
separación se basa en el reparto o
distribución de los solutos entre una fase
móvil líquida y otra estacionaria inmiscible,
soportada sobre un sólido inerte. La discriminación se produce por diferencias de
solubilidad. Las especies más retenidas serán las que presenten mayor afinidad
(solubilidad) por la fase estacionaria que por la fase móvil (eluyente).
Existen dos modos básicos de operación:
 Fase normal. Cuando se trabaja con fase estacionaria polar y fase móvil no
polar.
 Fase reversa. Cuando se emplea una fase estacionaria no polar y fase móvil
polar.
Inicialmente tuvo más auge la fase normal, pero en la actualidad son más comunes los
métodos cromatográficos en fase reversa dada la naturaleza hidrofílica de las muestras de
mayor interés (clínico, contaminación, alimentos).
 CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO. –
Tanto fase estacionaria como fase móvil son de naturaleza iónica. Los iones de la fase
estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente.
 R–— A+ + B+ R–— B+ + A+
R+— A– + B– R+— B– + A–

 CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION MOLECULAR. –

La fase fija está formada por partículas poliméricas o de sílice que contienen una red
uniforme de poros y llevan a cabo un fraccionamiento relacionado con el tamaño molecular.
Las moléculas de tamaño mayor son excluidas y eluyen primero, mientras que las más
pequeñas que penetran en los poros son retenidas más tiempo.
El HPLC es una de las técnicas de laboratorio más utilizada como herramienta
analítica para separar y detectar compuestos químicos.
Partes Del HPLC

Consta de:
 Sistema de suministro de disolvente
 Válvula de inyección de muestra
 Columna de alta presión
 Detector
 Ordenador para controlar el equipo y visualizar la muestra
Partes fundamentales en las que se compone un HPLC
En este tipo de estudios, los proveedores recomiendan que se filtre y se des gasifique todo
componente antes de ser introducido a un sistema de HPLC, esto con el propósito de evitar
danos futuros.

 El SOLVENTE. - El solvente es usado para crear la fase móvil.

La fase móvil es impulsada por una bomba que le da presión para desplazarla por
el sistema. Se usa un sistema de inyección para agregar la muestra al sistema.
Después de abandonar la fase estacionaria la muestra se mueve a través de un
detector. El detector envía una señal a la computadora que la convierte en un
cronograma

 LA FASE MOVIL. - Es el líquido que fluye a través del sistema cromatográfico.

Moviendo la muestra que va a ser separada a través de la fase estacionaria. Hay
diferentes líquidos que pueden ser escogidos para la fase móvil dependiendo de los
analitos que deberán ser separados.
 Xileno
 Acetona nitrilo
 Butanol
 Cloroformo
 Benceno
 agua
 etanol y acetona
¿Cómo escogemos la fase móvil?
Para esto es necesario usar un indicé de
polaridad.

 BOMBAS. - Una parte fundamental de los cromatógrafos de HPLC es la bomba.

Las bombas para HPLC deben cumplir ciertos requisitos fundamentales:
- Deben producir presiones estables hasta 6000 psi.
 - Deben mantener el flujo libre de pulsaciones.
- Deben generar intervalos de caudales de flujo (0,1 a 10 ml/min).
- Sus componentes deben ser resistentes a la corrosión.
Las bombas que se usan en HPLC se pueden clasificar según su funcionamiento y diseño
en:
 Mecánicas: recíprocantes y de desplazamiento continuo
 Neumáticas
 INYECTORES DE VALVULA. - Este sistema de inyección consiste en una válvula
de seis vías, dos de la cuales están conectadas entre si por medio de una espira
(“loop”). Esta espira es un tubo de volumen conocido, cuya misión es la de contener
la muestra antes de efectuarse la inyección. La introducción de la muestra en la
columna se lleva a cabo en dos etapas; la primera se realiza a presión atmosférica,
y consiste en cargar la muestra en la espira con ayuda de una jeringa; en la segunda,
mediante un giro de la válvula, se hace pasar el eluyente a través de la espira hacia
la columna.
 DETECTORES. - Principales detectores empleados en HPLC:
El espectro se divide en:
 infrarrojo (IR) 2,500 - 50,000 nm
 Infrarrojo cercano 800 - 2,500 nm
 Visible 400 - 800 nm
 Ultravioleta (UV) 190 - 400 nm
 LA COLUMNA. - La columna es el elemento fundamental de un cromatógrafo de
líquidos, puesto que es en ella donde tiene lugar la separación; por lo tanto, resulta
fundamental una correcta elección de la columna adecuada para cada separación,
ya que con una columna inadecuada o de mala calidad nunca se obtendrán buenos
resultados, aunque se disponga del mejor instrumental.
Las columnas más utilizadas en cromatografía de líquidos son las de relleno; estas
columnas consisten en un tubo, generalmente de acero, relleno de una fase
estacionaria adecuada al tipo separación que se
pretende llevar a cabo.

Aplicaciones:
Campos de Aplicación de HPLC
 Fármacos: Antibióticos, sedantes esteroides, analgésicos
 Bioquímica: Aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos
 Productos de alimentación: Edulcorantes artificiales, antioxidantes,
aflatoxinas, aditivos
 Productos de la industria química: Aromáticos condensados, tensoactivos,
propulsores, colorante