Actividad anticancerígena de la anandamida en células humanas de cutáneas de melanoma.

Resumen.

Los cannabinoides están implicados en el control de la proliferación celular, pero se sabe poco
sobre el papel del sistema endocannabinoide en el melanoma maligno humano. Este estudio tenía
como objetivo caracterizar la actividad antitumoral in vitro de la anandamida (AEA) en las células
de melanoma A375. La expresión del ARNm de los genes que codifican las proteínas implicadas en
el metabolismo y en el mecanismo de acción de la AEA se evaluó mediante RT-PCR. La viabilidad
celular se comprobó mediante el ensayo WST-1 y la muerte celular apoptótica se determinó
midiendo las actividades de la caspasa 3/7. Las células A375 expresan niveles elevados de los
genes de la amida hidrolasa de ácidos grasos (FAAH), la ciclooxigenasa (COX)-2, el receptor
cannabinoide 1 (CB1), el canal de cationes de potencial transitorio miembro de la subfamilia V 1
(TRPV1) y el receptor acoplado a la proteína G 55 (GPR55). La AEA indujo una citotoxicidad
dependiente de la concentración con un IC50 de 5,870,7 mM y dicho efecto se asoció a una vía
apoptótica dependiente de la caspasa. La citotoxicidad de la AEA se vio potenciada por la
inhibición de la FAAH (2 veces más, po0,05) y mitigada por la inhibición de la COX-2 o de la
lipoxigenasa (LOX) (5 y 3 veces menos, respectivamente; po0,01). El bloqueo de los receptores CB1
disminuyó parcialmente la citotoxicidad de la AEA, mientras que el antagonismo selectivo sobre el
TRPV1 apenas afectó al mecanismo de acción de la AEA. Finalmente, la metil-β-ciclodextrina, un
depletor del colesterol de membrana, revirtió completamente la citotoxicidad inducida por el
agonista selectivo GPR55, O-1602, y la AEA. En general, estos resultados demuestran que la AEA
induce citotoxicidad contra las células de melanoma humano en el rango micromolar de
concentraciones a través de un mecanismo complejo, que implica la síntesis de productos
derivados de COX-2 y LOX y la activación de CB1. La modulación de la balsa lipídica,
probablemente ligada a la activación del GPR55, también podría tener un papel.

Introducción.

1. Introducción

El sistema endocannabinoide está formado por los receptores CB1 y CB2, sus ligandos endógenos
(endocannabinoides), entre los que destacan la anandamida (AEA) y el 2-araquidonilglicerol (2-
AG), y las proteínas implicadas en la biosíntesis, el tráfico intracelular, la recaptación celular y la
degradación (Di Marzo, 2009; Hermanson y Marnett, 2011; Chicca et al., 2012).

Los endocannabinoides se sintetizan a demanda y se liberan fuera de la célula, donde activan los
receptores CB. A continuación, son absorbidos rápidamente por las células, muy probablemente a
través de un supuesto proceso mediado por un transportador transmembrana (Fowler, 2012;
Chicca et al.,2012) y son hidrolizados muy rápidamente y en su totalidad por la amida hidrolasa de
ácidos grasos (FAAH) y la monoacilglicerol lipasa (Hermanson y Marnett, 2011). Los
endocannabinoides también pueden someterse a la oxigenación, principalmente por parte de la
cicloxigenasa (COX)-2 y las lipoxigenasas (LOX), lo que lleva a la formación de prostaglandinas-
etanolamidas y ésteres de -gliceril que conservan algunas actividades biológicas (Battista et al.,
2012).

Así, la degradación de los endocannabinoides es un paso crucial en la terminación de la

señalización mediada por los cannabinoides y en la síntesis de otras moléculas bioactivas.
Los endocannabinoides regulan tanto las características principales como las emergentes del
cáncer (Guindon y Hohmann, 2011) y se han encontrado mayores niveles de endocannabinoides
en los cánceres y las lesiones premalignas que en el tejido normal (Flygare y Sander, 2008;
Petersen et al., 2005), lo que sugiere un papel del sistema endocannabinoide en la progresión del
fenotipo neoplásico. Estudios in vitro e in vivo han demostrado que los cannabinoides naturales y
sintéticos son eficaces para reducir la progresión del cáncer (Guindon y Hohmann, 2011), aunque
los efectos observados son complejos y a veces contradictorios. Por ejemplo, se han descrito
mecanismos dependientes e independientes del receptor (Guindon y Hohmann, 2011) y varias
dianas interesantes pueden explicar el efecto anticancerígeno de los cannabinoides, incluyendo el
canal de catión de la subfamilia del receptor transitorio de la subfamilia V (TRPV1), el receptor 55
acoplado a la proteína G (GPR55) y los receptores (PPAR) (Grimaldi y Capasso, 2011; Thomas et al.,
2007; O'Sullivan, 2007).

El sistema endocannabinoide está formado por los receptores CB1 y CB2, sus ligandos endógenos
(endocannabinoides), entre los cuales la anandamida (AEA) y el 2-araquidonilglicerol (2-AG) son
los más destacados, y las proteínas implicadas en la biosíntesis, el tráfico intracelular, la
recaptación celular y la degradación (Di Marzo, 2009; Hermanson y Marnett, 2011; Chicca et al.,
2012).

Los endocannabinoides se sintetizan a demanda y se liberan fuera de la célula donde activan los
receptores CB. A continuación, son rápidamente absorbidos por las células muy probablemente a
través de un proceso putativo mediado por un transportador transmembrana (Fowler, 2012;
Chicca et al., 2012) y son hidrolizados muy rápidamente y en su totalidad por la amida hidrolasa de
los ácidos grasos (FAAH) y la hidrolasa de ácidos grasos (FAAH) y la monoacilglicerol lipasa
(Hermanson y Marnett, 2011). Los endocannabinoides también pueden sufrir una oxigenación
principalmente por la cicloxigenasa (COX)-2 y las lipoxigenasas (LOX), lo que lleva a la formación de
prostaglandinas-etanolamidas y ésteres de que conservan algunas actividades biológicas (Battista
et al., 2012). Así, la degradación de los endocannabinoides es un paso crucial en la terminación de
la señalización mediada por cannabinoides y en la síntesis de otras moléculas bioactivas.

Los endocannabinoides regulan tanto las características principales como las emergentes del
cáncer (Guindon y Hohmann, 2011) y se encontraron mayores niveles de endocannabinoides en
los cánceres y las lesiones premalignas que en el tejido normal (Flygare y Sander, 2008; Petersen
et al., 2005) sugiriendo un papel del sistema endocannabinoide en la progresión del fenotipo
neoplásico. Estudios in vitro e in vivo han demostrado que los cannabinoides naturales y sintéticos
son eficaces para reducir la progresión del cáncer (Guindon y Hohmann, 2011), aunque los efectos
observados son complejos y a veces contradictorios. Por ejemplo, se han descrito mecanismos
dependientes del receptor y mecanismos independientes (Guindon y Hohmann, 2011) y varias
dianas interesantes pueden explicar el efecto anticancerígeno del cannabinoide. el efecto
anticancerígeno de los cannabinoides, incluyendo el canal de catión de la subfamilia del receptor
transitorio

(TRPV1), el receptor 55 acoplado a la proteína G (GPR55) y los receptores activados por el

proliferador de peroxisomas (PPAR) (Grimaldi y Capasso, 2011; Thomas et al., 2007; O'Sullivan,
2007).
El melanoma cutáneo es uno de los cánceres humanos más agresivos (Blázquez et al., 2006). Los
pacientes metastásicos tienen un mal pronóstico y generalmente son refractarios a la
quimioterapia convencional (Wolchok y Saenger, 2007). Aunque se ha observado la aparición de
una desregulación en el sistema endocannabinoide en varios cánceres de piel humanos (Casanova
et al., 2003), sólo hay pocos datos sobre el papel de los cannabinoides en el melanoma maligno
humano. Blázquez y colaboradores (2006) informaron de que los cannabinoides inhiben el
crecimiento in vivo de los melanomas que expresan receptores CB1 y CB2 al disminuir la
proliferación, la angiogénesis y la formación de metástasis, al tiempo que aumentan la apoptosis.
Aunque ya se ha demostrado la participación de varios ligandos (incluida la AEA) en la acción
anticancerígena de los cannabinoides en el melanoma (Hamtiaux et al., 2012; Kenessey et al.,
2012), el mecanismo molecular específico de acción implicado sigue sin estar claro.

En general, esta noción nos impulsó a caracterizar la actividad antitumoral in vitro de la AEA en las
células de melanoma humano A375 para proporcionar más información sobre el mecanismo
molecular de la acción de la AEA en este tipo específico de cáncer.

2. Material y métodos

2.1. Productos químicos

AEA (agonista del receptor CB1/CB2, agonista del TRPV1, agonista putativo del GPR55 agonista,
agonista de PPARs), ACEA (agonista selectivo del receptor CB1), JWH-133 (agonista selectivo del
receptor CB2) y AM251 (antagonista selectivo del antagonista del receptor CB1) se obtuvieron de
Tocris Bioscience (Northpoint, Reino Unido). El O1602 (agonista selectivo del GPR55) y la
capsazepina (CPZ, antagonista selectivo del TRPV1) se obtuvieron de Ascent Scientific (Cambridge,
Reino Unido). Ácido cafeico (inhibidor selectivo de LOX),

URB597 (inhibidor selectivo de FAAH), metil-β-ciclodextrina (MCD, disruptor de la balsa lipídica), y

capsaicina (agonista del TRPV1), se obtuvieron de Sigma Aldrich (Milán, Italia). El rofecoxib
(inhibidor selectivo de la COX-2 COX-2) fue cedido amablemente por el Dr. V. Calderone
(Departamento de Farmacia, Universidad de Pisa). Los compuestos se disolvieron en sus
disolventes específicos y se diluyeron en medio de cultivo estéril inmediatamente antes de su uso.
El DMSO no superó el 0,5% v/v en el medio de cultivo. en el medio de cultivo.

2.2. Cultivo celular.

La línea celular de melanoma cutáneo humano A375 se obtenida de la American Type Culture
Collection (ATCC, Rockville, MD), cultivada en medio DMEM suplementado con L-glutamina (2
mM), 10% de suero fetal bovino (FBS), 50 UI/ml penicilina y 50 μg/ml de estreptomicina (Sigma-
Aldrich, Milán, Italia) y se mantuvo a 37°C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2. En el
presente estudio se utilizaron pases celulares bajos (entre 5 y 20). presente estudio.

2.3. Caracterización por RT-PCR de las dianas de AEA.

El ARN total de las células A375 se extrajo utilizando el kit RNeasys Mini (siguiendo las
instrucciones del fabricante), se disolvió en agua libre de RNasa, se cuantificó por UV con
NanoDrop™ Lite (Thermo Fisher Scientific Inc., Wilmington, DE, USA) y se almacenó a 80 1C hasta
su uso. Se transcribió 1 μg de ARN mediante el kit de transcripción inversa QuantiTects (Qiagen,
Valencia, CA, EE.UU.). Las reacciones de PCR se realizaron con el kit HotStartTaq Master Mix
(Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.). Las secuencias de los cebadores fueron5′-
GTGAAGGTCGGAGTCAACG (F) y 5′-GGTGAAGACGGCCAGTGACTC (R) para la gliceraldehído 3-
fosfato deshidrogenasa (GAPDH); 5′-CCACTCCCGCAGCCTCCG (F) y 5′-ATCAGGCAAAACGACCAC (R)
para el receptor CB1; 5′-GGTGACAGAGATAGCCAATG (F) y 5′-GCCAATGAACAGGTATGAGG (R) para
el receptor CB2; 5′-GACTTCAAGGCTGTCTTCATCATCC(F) y 5′-CAGGAGAAGCAGGTGC (R) para el
TRPV1; 5′-CTGGAAGCTTTGGCTTTACG (F) y 5′-GTTGTGACATCCCGACAG (R) para PPARα; 5′-
TTCAGAAATGCCTTGCAGTG (F) y 5′-CACCTTTGCTGCTCCT (R) para PPARγ; 5′-
CAGTTTGCAGTCCACATCC (F) y 5′-ACGCTTCCGTACATGCTGAC (R) para GPR55; 5′-
AACTGCAGCACGAGATCGA (F) y 5′-CCCTCCGCAATCA (R) para hFAAH; 5′-
TGAAACCCACTCCAAACACA (F) y 5′-AACTGATGCGTGAAGTGCTG (R) para la COX-2.

Las muestras de ADNc se incubaron durante 15 minutos a 95 1C para activar la la polimerasa y, a

continuación, se amplificaron durante el número adecuado de ciclos (30 ciclos para GAPDH; 35
ciclos para CB1, CB2, TRPV1, GPR55 y FAAH y 36 ciclos para PPARα/γ y COX-2) durante 1 minuto a
95 1C, 1 minuto a la temperatura de recocido específica para cada objetivo AEA (55 1C para
GAPDH, CB2, GPR55 y COX-2; 56 1C para PPARα/γ y FAAH; 59,7 1C para CB1; y 69 1C para TRPV1),
1 minuto a 72 1C, más paso de elongación a 72 1C durante 10 min. Se utilizó GAPDH como gen de
mantenimiento. Los cebadores se diseñaron con el programa informático Oligo-Primer Analysis
Software 5.0, sintetizados por Sigma-Aldrich (Milán, Italia) y su especificidad se verificó con el
software Blast (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/tools/primer-blast/). La identidad de los productos
de la PCR se confirmada por secuenciación.

2.4. Ensayo de viabilidad celular

La viabilidad celular se midió mediante un método basado en la escisión del 4-(3-(4-yodofenil)-2-

(4-nitrofenil)-2H-5-tetrazolio)-1,3- disulfonato de benceno (WST-1) a formazán por la actividad
deshidrogenasa mitocondrial siguiendo las instrucciones del fabricante (reactivo de proliferación
celular WST-1; Roche, Mannheim, Alemania). Brevemente, se sembraron células (5X10^3/pozo) en
una placa de 96 pocillos en un medio con FBS al 10%; después de 24 h, se sustituyó el medio
completo por un medio con FBS al 1%. Para ello, cada compuesto se disolvió en su disolvente
específico y luego se diluyó en medio con bajo contenido de suero hasta obtener las
concentraciones a ensayar. Se prepararon soluciones madre frescas el día del experimento. Todos
los compuestos se probaron en un rango de concentración de 0,1-100 mM y sus efectos se
evaluaron después de 48 h, en presencia o ausencia de los siguientes inhibidores/antagonistas
específicos URB597, rofecoxib, ácido cafeico, AM251 y CPZ. Cada compuesto se añadió 2 h antes
del tratamiento con AEA. Tras la exposición al fármaco, se añadió WST-1 y se midió la absorbancia
a 450 nm utilizando un lector de microplacasVictor2

™ (Wallac, PerkinElmer, Waltham, Estados Unidos). Los valores de densidad óptica de las células
tratadas con vehículo se consideraron como el 100% de la viabilidad celular.

2.5. Ensayo de actividad de caspasas

Las actividades de la caspasa 3/7 se analizaron con el kit Apo-ONE Homogeneous Caspase 3/7
Assay (Promega, Milán, Italia), según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se
sembraron en placas de 96 pocillos (5X10^3/pocillo) en presencia de AEA a 10 μM durante 24 h.
Después de la lisis celular, se añadió el sustrato del ensayo de caspasas 3/7 (Z-DEVD) 2-Rhodamine
110 y se midió la fluorescencia a longitudes de onda de excitación y emisión de 485 y 530 nm,
respectivamente. Los valores se expresaron como la relación entre las señales fluorescentes
generadas en las células tratadas y las producidas en los controles.

Cada valor se obtuvo a partir de tres experimentos independientes realizados por triplicado.

2.6. Análisis estadístico

Los resultados se expresaron como % de viabilidad celular frente a las células tratadas con
vehículo. Los datos se presentaron como valores medios de IC507 y error estándar de la media
(S.E.M.) de tres experimentos independientes. Las comparaciones estadísticas entre grupos se
realizaron mediante la prueba t de Student para datos emparejados utilizando el software
GraphPad Instat. La significación se asumió a p<0,05.

3. Resultados

3.1. Expresión génica de las dianas de la AEA en las células A375

Se evaluó la expresión de genes que codifican proteínas proteínas implicadas en el metabolismo

de la AEA y su mecanismo de acción mediante RT-PCR. En nuestras condiciones experimentales,
las células A375 se caracterizaron por los ARNm asociados a FAAH, COX-2, receptor CB1 GPR55 y
TRPV1. La COX-1 se expresó a niveles muy bajos (datos no mostrados), mientras que estas células
no expresan los receptores CB2 y PPAR α/γ (Fig. 1).

3.2. Efectos citotóxicos y pro-apoptóticos de la AEA

La AEA indujo una disminución dependiente de la concentración de la viabilidad celular con un

valor medio de IC50 de 13,570,3 μM. Dicho efecto se potenció cuando, tras las primeras 24 h, se
sustituyó el medio de cultivo por otro que contenía AEA (IC50 de 5,870,7 μM; po0,05), de acuerdo
con la presencia de mecanismos de degradación intracelular (Fig. 2A). Para dilucidar aún más el
mecanismo molecular de la muerte celular, investigamos si la caspasa-3 y/o la caspasa-7, dos
enzimas implicadas en la fase efectora de la apoptosis eran una diana de la AEA. La activación de la
caspasa (370,5 veces, en comparación con el control con el control; po0,05) se observó después de
incubar las células A375 con AEA a 10 μM durante 24 h (Fig. 2B).

3.3. Efecto del metabolismo celular en la citotoxicidad de la AEA

Los experimentos con AEA se repitieron en presencia de URB597 (inhibidor selectivo de FAAH),
rofecoxib (inhibidor selectivo de COX-2) o ácido cafeico (inhibidor selectivo de la LOX). Las curvas
de concentración-respuesta de concentración-respuesta para cada uno de los inhibidores
utilizados en nuestro entorno experimental. En los experimentos de combinación, seleccionamos
seleccionamos una concentración de inhibidor (es decir, 1 μM) que, según los informes, bloquea
actividades enzimáticas (Piomelli et al., 2006; Chan et al., 1999; Shureiqi et al., 2000) que, en
nuestras condiciones experimentales, no afectó a la viabilidad de las células A375 (10572,9%,
99,571,2% y 103,571%, respectivamente, en comparación con los controles). URB597 produjo un
desplazamiento hacia la izquierda de la curva de concentración-respuesta con una disminución
significativa (po0,05) de 2 veces en el valor IC50 de AEA (Fig. 3A, Tabla 1). Cabe destacar que el
pretratamiento con rofecoxib y ácido cafeico provocó un aumento de 5 y 3 veces (po0,05) en el
valor del IC50 de la AEA. 3 veces (po0,01) en el valor medio de la IC50 de AEA de 5,87 0,7 a
27,172,8 y a 18,770,3 mM, respectivamente (Fig. 3B y C).

El tratamiento simultáneo con rofecoxib y URB597 provocó un desplazamiento a la derecha de la

curva concentración-respuesta de AEA con un valor medio de IC50 correspondiente de 21,970,5
mM (Tabla 1).

3.4. Papel de los receptores CB en la citotoxicidad de la AEA

AM251 a 0,5 μM durante 24 h no afectó a la viabilidad celular (100+0,82%, en comparación con el

control), mientras que la coincubación del antagonista CB1 selectivo con AEA dio lugar a un
desplazamiento significativo (p<0,01) hacia la derecha de la curva concentración-respuesta de AEA
con el correspondiente aumento de la IC50 de 5,870,7 μM a 10,970,6 μM (Fig. 4A, Tabla 1). En
consonancia con estos hallazgos, el agonista CB1 selectivo, ACEA, indujo citotoxicidad con una
IC50 de 18,970,5 μM (Fig. 4B, Tabla 1), confirmando así una posible contribución de este subtipo
de receptor al mecanismo de acción de la AEA. De acuerdo con los datos de la RT-PCR que
demuestran la ausencia de receptores CB2 en las células A375, el tratamiento con el agonista
selectivo CB2, JWH133, hasta 100 mM no afectó a la viabilidad de las células A375 A375 (Fig. 4C).

3.5. Papel del TRPV1 en la citotoxicidad de la AEA

El pretratamiento con capsazepina (antagonista selectivo del TRPV1) a 0,1 μM no cambió

sustancialmente el perfil de citotoxicidad de la AEA (Fig. 4D). Cabe destacar que dicha
concentración pudo bloquear el receptor vanilloide vanilloide sin afectar a la viabilidad de las
células A375 en sí (99,972,2%, en comparación con el control). en comparación con el control).
Además, el agonista selectivo del TRPV1 capsaicina, indujo una disminución significativa de la
viabilidad de las células A375 sólo a concentraciones Z50 μM (Fig. 4E).

3.6. Papel de la balsa lipídica/GPR55 en la citotoxicidad de la AEA

Utilizamos O-1602, un agonista selectivo de GPR55, para evaluar el papel de la activación de

GPR55 en la citotoxicidad de AEA. O-1602 ejerció un efecto citotóxico en las células A375 con un
IC50 de 17,572,6 mM (Fig. 5A, Tabla 1). La metil-β-ciclodextrina (MCD), un depletor del colesterol
de membrana se probó en las células A375 a 100 mM, una concentración suficiente para destruir
las balsas lipídicas de la membrana sin afectar a la viabilidad viabilidad celular (109,371,8%, en
comparación con el control). La MCD revirtió completamente

invirtió la citotoxicidad inducida por O-1602 en las células A375 (Fig. 5B).

Cabe destacar que en las células tratadas con AEA, la MCD también restauró completamente la
viabilidad celular a niveles comparables a los de los controles (Fig. 5B), sugiriendo un posible papel
de las balsas lipídicas y del GPR55 en el mecanismo molecular de la acción de la AEA. mecanismo
molecular de la acción de la AEA.

4. Discusión

Nuestros hallazgos demostraron, en primer lugar, que la AEA ejerce un efecto citotóxico contra las
células de melanoma humano mediante la activación de una vía apoptótica dependiente de la
caspasa en el rango micromolar de concentraciones. Esto está en consonancia con las pruebas que
demuestran que, en muchos tipos de células, los cannabinoides inducen la muerte celular
apoptótica a niveles suprafisiológicos (Siegmund y Schwabe, 2008; Fogli et al., 2006). También
demostramos una contribución de las vías COX-2 y LOX al mecanismo molecular de la acción de la
AEA. En particular, demostramos que el gen COX-2 está altamente expresado en las células de
melanoma humano A375. La inhibición selectiva de la COX-2 mediante rofecoxib no afectó per se
a la viabilidad celular, lo que sugiere la ausencia de un papel significativo de los metabolitos del
ácido araquidónico en la proliferación de las células A375; sin embargo, observamos una marcada
disminución de la citotoxicidad de la AEA en presencia de rofecoxib. De acuerdo con las pruebas
que demuestran que la COX-2 puede oxidar la AEA generando prostaglandinas E2-etanolamidas
citotóxicas (Van Dross, 2009), estos resultados sugieren un papel clave del metabolismo de la COX-
2 en la citotoxicidad de la AEA, en las células A375. Además, las pruebas que demuestran que la
resistencia a la citotoxicidad de la AEA en queratinocitos con bajos niveles basales de COX-2 puede
revertirse mediante la sobreexpresión de la COX-2 (Van Dross, 2009), sugieren un papel potencial
de la COX-2 en la predicción de la citotoxicidad de la AEA tanto en células cancerosas como
normales.

Cabe destacar que nuestros estudios combinados demostraron que también las lipoxigenasas
pueden contribuir a la citotoxicidad de la AEA en las células de melanoma humano. Aunque el
papel biológico preciso de estos subproductos debe ser dilucidado, recientemente se ha
demostrado el metabolismo de la AEA en eoxamidas por la 15-lipoxigenasa-1 en células de linfoma
de Hodgkin (Forsell et al., 2012).

Una vez dentro de la célula, la AEA se degrada principalmente a través de la FAAH a ácido
araquidónico y etanolamina (Alpini y DeMorrow, 2009; Zheng et al., 2008; Kuc et al., 2012). En
consonancia con esta noción, nuestros hallazgos demostraron que la inhibición selectiva de la
FAAH mediante URB597 potenció la citotoxicidad de la AEA en las células A375. Cabe destacar que
URB597 per se no afectó a la viabilidad de las células, lo que sugiere que la AEA producida de
forma endógena no parece desempeñar un papel en la viabilidad de las células. AEA producida
endógenamente no parece desempeñar un papel significativo en la citotoxicidad general inducida
por la AEA. citotoxicidad inducida por la AEA exógena. El desplazamiento hacia la derecha de la
curva curva de concentración-respuesta de la AEA, en presencia de la inhibición simultánea de la
FAAH y la COX-2, se caracterizó por un IC50 ligeramente inferior al observado en presencia de
rofecoxib solo. Estos resultados, aunque confirman el papel opuesto de las dos enzimas,
subrayaron la importancia de la vía de la COX-2 en la citotoxicidad de la AEA en las células de
melanoma humano.

Nuestros resultados obtenidos en presencia del antagonista selectivo de CB1, AM251, indican que
la activación del receptor CB1 puede contribuir al mecanismo de acción de la AEA. Sin embargo, el
agonista selectivo del receptor CB1, ACEA, se caracterizó por una IC50 superior a la de la AEA, lo
que sugiere que la activación del receptor CB1 por sí misma, no explica completamente la
citotoxicidad de la AEA en las células A375. En nuestras condiciones experimentales, pudimos
descartar la contribución del receptor CB2 al mecanismo de acción de la AEA, porque las células
A375 no expresaban este subtipo de receptor y el agonista selectivo del receptor CB2, JWH133, no
mostró una citotoxicidad significativa hasta 100 μM. La aparente discrepancia con los datos de
Blázquez y colaboradores (2006), que informaron de la presencia de ARNm del receptor CB2 en las
células A375, puede atribuirse a una diferencia clonal nada sorprendente.
El receptor GPR55 se ha descrito recientemente como un actor destacado en la dinámica de las
células cancerosas (Henstridge, 2012) y un posible objetivo de la acción de la AEA (Ross, 2008).
Dado que el cannabidiol, es decir la única molécula utilizada como antagonista del receptor
GPR55, no era adecuada en nuestro modelo debido a su naturaleza pleiotrópica (se comporta
también como antagonista del receptor CB1, agonista inverso del receptor CB2, inhibidor de la
captación de AEA y agonista débil del TRPV1) (Booz, 2011), probamos el efecto del agonista
selectivo del GPR55, O-1602 (inactivo en los receptores CB1 y CB2) en la viabilidad de las células
A375. Cabe destacar que el O-1602 mostró una reducción dependiente de la concentración en la
viabilidad de las células A375.

Dado que se ha informado de que la AEA era capaz de inducir citotoxicidad en células de
colangiocarcinoma a través de la activación de GPR55, mediante un mecanismo dependiente de la
integridad de las balsas lipídicas (Huang et al., 2011), investigamos esta cuestión en nuestro
sistema modelo utilizando el disruptor de la balsa lipídica, metil-β-ciclodextrina. En estas
condiciones experimentales, el efecto citotóxico inducido por O-1602 o AEA de O-1602 o de la
AEA, lo que sugiere un posible papel de la GPR55 en el mecanismo molecular de la acción de la
AEA. el mecanismo molecular de la acción de la AEA. Sin embargo, la falta de antagonistas del
GPR55 disponibles en el mercado y las pruebas que demuestran la capacidad de la AEA para
inducir la muerte celular independiente de la GPR55 a través de un mecanismo de mecanismo de
balsa lipídica (Zheng et al., 2008), sugieren que se necesitan más experimentos para comprender
claramente la relación precisa entre la AEA, la GPR55 y las balsas lipídicas en las células A375.

La AEA también se describió como un agonista del receptor selectivo vanilloide TRPV1, del que se
ha informado que media las acciones citotóxicas de la AEA en algunas células cancerosas a través
de la elevación de la concentración de Ca2þ intracelular (Grimaldi y Capasso, 2011; Thomas et al.,
2007). Sin embargo, nuestros experimentos con ligandos selectivos del TRPV1 sugieren que este
subtipo de receptor no contribuyó sustancialmente a la citotoxicidad inducida por la AEA en las
células A375.

Varias líneas de evidencia indican que la AEA también puede actuar como agonista de PPARα/γ
(Battista et al., 2012; O'Sullivan y Kendall, 2010; Pistis y Melis, 2010); sin embargo, estos subtipos
de receptores no se expresados en las células A375.

En conclusión, nuestro estudio demuestra que la AEA puede inducir citotoxicidad en células de
melanoma humano mediante la activación de una vía dependiente de caspasas. El efecto
citotóxico global de la AEA se produce en en el rango micromolar de concentraciones y parece
estar mediada por subproductos de la AEA derivados del metabolismo de la COX-2 y la LOX.
Además, la modulación de las balsas de lípidos, probablemente vinculada a la activación de la
GPR55, también podría ser un factor determinante. la activación de GPR55, podría tener también
un papel.