Efectos anticancerígenos de los n-3 EPA y DHA y sus derivados endocannabinoides sobre el

crecimiento y la invasión de células de cáncer de mama.

Resumen.

Los efectos anticancerígenos de los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga omega-3
(AGPICL), EPA y DHA pueden deberse, al menos en parte, a la conversión en sus respectivos
derivados endocannabinoides, eicosapentaenoil-etanolamina (EPEA) y docosahexaenoil-
etanolamina (DHEA). En este caso, se examinaron los efectos de la EPEA y la DHEA y de sus
compuestos madre, el EPA y el DHA, sobre la función de las células del cáncer de mama (CB). El
EPEA y la DHEA mostraron mayores efectos anticancerígenos que el EPA y el DHA en dos células de
cáncer de mama (MCF-7 y MDA-MB-231), mientras que no mostraron ningún efecto en células de
mama no malignas (MCF-10a). Ambas líneas de CB expresaban receptores CB1/2 que eran
responsables, al menos en parte, de los efectos antiproliferativos observados de los
endocannabinoides omega-3, tal y como determinaron los estudios de antagonismo de los
receptores. Además, los principales mecanismos de señalización provocados por estos ligandos CB
incluían la alteración de la fosforilación de las proteínas p38-MAPK, JNK y ERK. Tanto los LCPUFAs
como sus endocannabinoides atenuaron la expresión de proteínas señalizadoras en las células CB,
aunque en diferente medida dependiendo del tipo celular y de los efectores lipídicos. Estas
proteínas de señalización están implicadas en la apoptosis y en la atenuación de la migración y la
invasividad de las células de CB. Además, sólo el DHA redujo la migración in vitro de MDA-MB-231,
mientras que tanto los LCPUFAs como sus endocannabinoides inhibieron significativamente la
capacidad de invasión. Este hallazgo fue coherente con la reducción de la expresión de la integrina
β3 observada con todos los tratamientos y la reducción de MMP-1 y VEGF con el tratamiento con
DHA. La atenuación de la viabilidad celular, la migración y la invasión de las células malignas indica
un potencial uso terapéutico nutricional complementario de estos LCPUFAs y/o sus
endocannabinoides en el tratamiento del cáncer de mama.

Introducción.

Anteriormente demostramos que los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga n-3 (n-3
LCPUFA) pueden mejorar la apoptosis en las células de cáncer de mama (BC) y que el ácido
docosahexaenoico (DHA; 22:6n-3) puede mejorar la eficacia de los fármacos de quimioterapia
utilizados habitualmente en el tratamiento del cáncer de mama y de próstata de mama y de
próstata [1,2]. Las sugerencias de que los AGPIC n-6, que predominan en en las dietas
occidentales, pueden provocar efectos pro-cáncer, como se ha observado como en modelos
animales de cáncer [3], en lugar de los efectos anticancerígenos de los efectos anticancerígenos
atribuidos a los AGPIC n-3, sigue siendo controvertido. Por ejemplo la etanolamida del ácido
araquidónico n-6 (C20:4 n-6), la araquidoniletanolamida (anandamida), es un endocannabinoide
que activa cannabinoides CB1 y CB2, tanto cuando se administra de forma exógena como cuando
se sintetiza y libera de forma endógena [4]. A pesar de que derivar de un ácido graso n-6 in situ,
que es un supuesto ácido graso pro-cáncer la anandamida muestra muchas propiedades
anticancerígenas y antiproliferativas en varios tipos de células cancerosas [3,5].

El sistema endocannabinoide en general parece desempeñar un papel inhibidor en el inicio y la

progresión de ciertos tipos de cáncer, por ejemplo, el cáncer de próstata, colorrectal y de mama.
Los receptores CB1 y CB2 suelen estar sobreexpresados en estos tipos de tejidos/células
cancerosas.

Los agonistas de los receptores cannabinoides sintéticos y/o endógenos pueden inhibir tanto la
proliferación como la invasión de las células cancerosas y este efecto puede evitarse con
antagonistas selectivos de los receptores CB1 y/o CB2 [5,6]. La inhibición de la degradación de
estos endocannabinoides, mediante la inhibición de la amida hidrolasa de ácidos grasos (FAAH) in
vitro, dio lugar a una mayor disponibilidad para su unión a los receptores CB. La inhibición de la
FAAH atenuó la proliferación de células de cáncer colorrectal y la invasión de células de cáncer de
próstata in vitro, así como el desarrollo de lesiones precancerosas en el colon in vivo en animales
[7]. La inhibición de la migración de las células cancerosas y la invasión de los tejidos/órganos
atenuaría la metástasis del cáncer, la principal causa de mortalidad en los pacientes con cáncer, y
permitiría prolongar los períodos de tratamiento del el tumor primario. Nuestros hallazgos
anteriores y actuales sugieren que los n-3 LCPUFA y sus derivados endocannabinoides podrían ser
importantes como como modalidades de tratamiento complementario o primario en la mejora de
la metástasis del cáncer.

Los AGPIC n-3 y n-6 de la dieta pueden convertirse en etanolamida (NAEs) y derivados de 2-
monoacilglicéridos (2-AG) in situ [8,9]. Nuestro grupo grupo demostró por primera vez que los
niveles de derivados de etanolamida de n-3 LCPUFA, DHEA y EPEA, aumentaban en las células de
cáncer de mama y de próstata tratadas con los respectivos LCPUFAs precursores, EPA y DHA [9-
11].

También fuimos los primeros en demostrar que estas etanolamidas n-3 son verdaderos
endocannabinoides que se unen a los receptores cannabinoides CB1 y CB2 y y CB2 y provocan
efectos anticancerígenos, antiproliferativos y proapoptóticos cáncer de próstata,
independientemente del estado del receptor hormonal (positivo o negativo) de las células. Esto
incluye la demostración de sus efectos antiproliferativos en el ciclo celular y la inducción de la
apoptosis mediante citometría de flujo [10]. citometría de flujo [10].

Anteriormente planteamos la hipótesis de que los efectos antiproliferativos y anticancerígenos de

los AGPIC n-3 EPA y DHA in vitro e in vivo podrían deberse, al menos en parte, a la conversión en
sus respectivos derivados endocannabinoides de unión al receptor CB [10]. La activación del
receptor CB por ligandos específicos da lugar a la activación de la vía de la MAP quinasa mediante
la regulación de la fosforilación de p38MAPK, JNK y ERK. Esto se ha observado para los
cannabinoides, los cannabinoides sintéticos y el endocannabinoide n-6, la anandamida. Las MAP
quinasas son serina/treonina quinasas que participan en el control de la diferenciación, el
crecimiento y la proliferación celular, la muerte celular y las respuestas al estrés celular [12]. Se ha
observado la activación de la vía MAPK tras el tratamiento de células de próstata, hígado, páncreas
maligno y leucemia con Δ9-THC (Δ9 tetrahidrocannabinol), cannabidiol y WIN 55.212-2 (un
agonista CB sintético) [13-16]. La activación parece ser tanto dependiente como independiente del
receptor CB, como demuestran los estudios con antagonistas del receptor CB [15]. Este trabajo
demostró que la activación de JNK/p38MAPK en células de cáncer de hígado por WIN 55,212-2 se
asoció con la regulación al alza de factores proapoptóticos [15]. Por el contrario, se demostró que
en las células de leucemia tratadas con Δ9-THC, la inhibición, pero no la activación de la vía de
señalización ERK1/2 era independiente de p38MAPK, o JNK [14]. En células de glioma de rata C6, el
tratamiento con WIN 55.212-2 redujo el crecimiento del tumor e indujo la apoptosis, con la
correspondiente regulación a la baja de la señalización de ERK1/2 [17]. No se sabe si estas vías
también están reguladas por las las etanolamidas n-3 en las células de CB.

Para aclarar esta cuestión, determinamos el papel de los AGPIC n-3 y sus endocannabinoides en la
obtención de efectos antiproliferativos, antimigratorios y antiinvasivos en células mamarias no
malignas y en células de CB sensibles e insensibles a las hormonas. También investigamos sus
efectos sobre la regulación de la señalización MAPK y los niveles de expresión de las integrinas que
podrían ayudar a explicar sus efectos potencialmente anticancerígenos en las células de CB in
vitro.

2. Materiales y métodos

2.1. Líneas celulares

La línea celular humana de CB MCF-7 se adquirió de la Colección Europea de Cultivos Celulares

(Agencia de Protección de la Salud, Salisbury, Reino Unido) y las líneas celulares MDA-MB-231 y
MCF-10a se obtuvieron de American Type Culture Collection y LGC Standards (Middlesex, Reino
Unido), respectivamente. Las células se compraron frescas en estas instalaciones específicamente
para este estudio con el fin de garantizar su fidelidad y se mantuvieron en números de pases
inferiores a 30. Las líneas celulares MCF-7 y MDA se cultivaron en medio RPMI 1640 (Lonza,
Basilea, Suiza) que contenía un 10% (v:v) de suero fetal bovino y un 1% (v:v) de penicilina-
estreptomicina (10.000 unidades/ml de penicilina, 10 mg/ml de estreptomicina, Sigma-Aldrich,
Dorset, Reino Unido). Las células MCF-10 se cultivaron en 50:50 DMEM/Hams F12 con 5% de suero
de caballo (ambos de Thermofisher Scientific, Loughborough, Reino Unido), 20 ng/ml de factor de
crecimiento epidérmico Factor de Crecimiento Epidérmico (hEGF) 100 ng/ml de toxina del cólera y
500 ng/ ml de hidrocortisona (todos de Sigma Aldrich). Las células se cultivaron bajo condiciones
estándar de 5% de CO2 a 37ºC en una incubadora humidificada.

2.2. Reactivos bioquímicos

El ácido docosahexaenoico (DHA; 22:6 n-3, >99% de pureza), y el ácido eicosapentaenoico (EPA;
20:5 n-3 >98% de pureza) se compraron a Sigma-Aldrich (Dorset, Reino Unido). La
eicosapentaenoil etanolamida (EPEA,≥98% de pureza) y la docosahexaenoil etanolamida (DHEA,
≥98% de pureza) se obtuvieron de Cayman Chemicals (distribuida por Cambridge Bioscience Ltd,
Cambridge, Reino Unido). Los ácidos grasos y las etanolamidas se disolvieron en etanol al 100% y
se almacenaron en soluciones madre de 100 mM

a -80 °C bajo nitrógeno y se diluyeron hasta alcanzar las concentraciones adecuadas en los medios
de comunicación cuando fue necesario.

2.3. Antagonistas del receptor

Se utilizaron antagonistas selectivos de CB1 (AM281) y CB2 (AM630) para bloquear la actividad de
los receptores CB. AM281 y AM630 se obtuvieron de Insight Biotechnology UK y se almacenaron a
50 mM y 3 mM y en DMSO y etanol, respectivamente. Cada antagonista se utilizó a una
concentración de 1μΜ, como se ha descrito previamente [10]. Las células se trataron con cada
antagonista sólo a esta concentración, lo que demostró que no hubo ningún efecto sobre la
viabilidad celular en ninguna de las líneas celulares de cáncer de mama líneas celulares de cáncer
de mama en estas condiciones (datos no mostrados).

2.4. Viabilidad celular

Se utilizó un ensayo estándar de reducción del colorante MTT para evaluar la citotoxicidad de los
respectivos compuestos en las células de CB. Brevemente, las células fueron En resumen, las
células se colocaron en placas de 96 pocillos con una densidad de siembra de 5 × 104 células/ml.
Las células se trataron al día siguiente con los agentes adecuados durante 24 y 48 h. A
continuación se añadió una solución de MTT (5 mg/ml en PBS) y se incubó durante 4 h.

Se retiraron los medios/el MTT y se sustituyeron por 200 µl de DMSO para disolver los cristales de
formazán del MTT. Las placas se leyeron inmediatamente a 570 nM en un lector de placas
multipocillo (DynaTech MR5000, Dynex Laboratories, Worthing, Reino Unido). Cada experimento
contenía 6 réplicas y se repitió al menos tres veces. La citotoxicidad se expresó como aumento
porcentual medio en relación con el control no expuesto ± SD. El control Los valores de control se
fijaron en un 0% de citotoxicidad. Los datos de citotoxicidad (en su caso) se ajustaron a una curva
sigmoidal y se utilizó un modelo de regresión logística para calcular el IC50, que es la
concentración de ácido graso/cannabinoide cannabinoide que causa una inhibición del 50% en
comparación con los controles no tratados.

El IC50 medio es la concentración del agente que reduce el crecimiento celular en un 50% en las
condiciones experimentales y es la media de al menos tres mediciones independientes
reproducibles y estadísticamente significativas.

Los valores de la IC50 se comunicaron con intervalos de confianza de ± 95% ( ± 95% CI). Este
análisis se realizó con GraphPad Prism (San Diego,USA)

2.5. Extracción de proteínas

Las células se homogeneizaron en un tampón de lisis (20 mM de Tris, 0,25 M de sacarosa, 10 mM

de EGTA, 2 mM de EDTA, 1 mM de ortovanadato de sodio, 25 mM de β-glicerofosfato de sodio, 50
mM de fluoruro de sodio, 0,1% (v:v) de cóctel de inhibidores de proteasas (Sig. (Sigma, Dorset,
Reino Unido), pH 7,5) y se sonicó durante 10 s a una frecuencia de 10 kHz. frecuencia de 10 kHz.
Las concentraciones de cada muestra se determinaron de proteínas Biorad DC (Biorad,
Hertfordshire, Reino Unido), de acuerdo con las según las instrucciones del fabricante.

2.6. Determinación de la migración y la invasión

Las células MCF-7, menos agresivas, se consideraron demasiado poco invasivas, por lo que sólo se
determinó la migración e invasión de las células MDA-MB-231 mediante un ensayo de migración e
invasión disponible en el mercado (CytoSelect™, Cell Biolabs Inc, USA). La migración celular se
determinó con suero (quimioatrayente) en la parte inferior de la cámara la cámara, mientras que
la cámara superior contenía células resuspendidas en medio sin suero. Las células se trataron con
LCPUFAs n-3 o sus etanolamidas durante 24 horas antes de evaluar la migración a través de la
membrana de policarbonato (tamaño de poro 8uM) insertada en los pozos entre la cámara
superior y la inferior. Las células que fueron capaces de atravesar la membrana de membrana de
policarbonato hacia los quimioatrayentes se tiñeron y cuantificados mediante un lector de placas a
560 nm. Se utilizaron concentraciones se utilizaron concentraciones que permitían observar los
efectos fisiológicos experimentos anteriores), pero se indujo una muerte celular limitada (un
máximo del 10-15% de muerte celular). Esto garantizaría que los efectos observados se debían a
causas de antiinvasión/migración de la invasión y la migración, en lugar de una simple reducción
del número de células.

La capacidad de invasión de las células MDA-MB-231 se determinó de forma de manera similar a la

migración, salvo que la membrana de policarbonato se de policarbonato estaba recubierta de una
matriz de membrana basal sintética que las células degradar para poder moverse (invadir) hacia la
cámara inferior.

2.7. Análisis de Western blot

Las células se trataron durante 24 h con la concentración IC50 de cada compuesto. Se electroforizó
un total de 25-30 µg de proteína a través de de poliacrilamida al 4-20% (Invitrogen, Paisley, Reino
Unido) durante 1-2 h y las proteínas separadas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa
(Biorad, Hertfordshire, Reino Unido), y a continuación se bloquearon con leche desnatada al 5%
(p:v) en solución salina tamponada con tris (TBS) con 0,1% (v:v) de Tween 20 (solución TBST) a
temperatura ambiente y se incubaron individualmente, con una dilución 1:100 dilución de
anticuerpo anti-FAAH, 1:100 CB1, 1:200 CB2, 1:200 ERK 1:200 p-ERK, 1:200 JNK, 1:200 p-JNK,
(Insight Biotechnology, UK),

1:200 p38 y pp38 (Abcam, Reino Unido), 1:100 Integrina β3 y VEGF (Santa Cruz, USA), 1:100 MMP-
1 (Abcam, UK) a 4 °C durante la noche. La β-actina (1:20.000) se utilizó como control de carga
interno para normalizar entre carriles durante la densitometría (Abcam, Reino Unido). Se utilizaron
anticuerpos secundarios secundarios adecuados (Insight Biotechnology, Reino Unido) contra el
ratón, el conejo (1:5000) o la cabra (1:10.000). cabra (1:10.000) se incubaron a temperatura
ambiente durante 1 hora. se visualizaron con el kit de detección quimioluminiscente ECL+plus
(Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, Reino Unido), de acuerdo con las instrucciones del
fabricante y un fosforímetro Fluor S (Biorad, Hertfordshire, Reino Unido). Los experimentos se
repitieron con proteínas aisladas de al menos tres extracciones independientes.

2.8. Análisis de datos

Se utilizó la prueba t de Student no emparejada para comparar las medias entre dos tratamientos.
La prueba de Levene se utilizó para evaluar la igualdad de varianza. También se utilizó el ANOVA
de una vía con análisis post-hoc (corrección de Bonferonni o prueba de Dunnett en su caso). Un
valor de p ≤ 0,05 se consideró significativo. Para el análisis se utilizó el programa SPSS Statistics,
versión 20 (IBM).

3.5. Efecto de los LCPUFA n-3/etanolamidas n-3 en la modulación de las vías de señalización mapk

en las células de cáncer de mama

En las células MCF-7 BCE (Fig. 5A), los niveles de proteína p38 MAPK se redujeron con todos los
tratamientos, es decir, EPA, EPEA, DHA y DHEA (p < 0,01, p < 0,01, P < 0,01 y p < 0,001
respectivamente). La p38 MAPK fosforilada también se redujo con todos los tratamientos, aunque
esto sólo fue significativo para el EPEA, el DHA y la DHEA (todos p < 0,01). La expresión de la ERK
no se vio afectada por los AGPIC n-3 ni por sus etanolamidas, a excepción de la disminución
provocada por el tratamiento con DHEA (p < 0,05). La ERK fosforilada disminuyó significativamente
con el DHA y la DHEA (p < 0,05, p < 0,01 respectivamente). No hubo un efecto significativo sobre la
expresión de JNK con ninguno de los tratamientos, salvo una pequeña reducción con el
tratamiento con EPEA (p < 0,05). Sin embargo, hubo reducciones significativas en la expresión de
pJNK fosforilada con los tratamientos de EPEA, DHA y DHEA (p < 0,05, p < 0,05 y p < 0,01
respectivamente), pero esta reducción no fue significativa para el tratamiento de EPA.

En las células MDA-MB-231 se observaron tendencias generales similares a las anteriores, con la
excepción de la expresión de p38 MAPK, que aumentó ligeramente con el tratamiento con EPA (p
= 0,055) y no se vio afectada por el tratamiento con EPEA (Fig. 5B). El tratamiento con DHA y
DHEA, sin embargo, redujo significativamente la expresión de p38 MAPK (ambos p < 0,01). La p38
MAPK fosforilada se redujo significativamente con el EPA y la DHEA (p < 0,01 respectivamente)
pero no con el EPEA o el DHA. La expresión de ERK se redujo significativamente sólo con el DHA (p
< 0,05) y de forma no significativa con el EPA y el EPEA, pero no fue modificada por la DHEA. La
ERK fosforilada se redujo con todos los tratamientos, pero de forma significativa con EPA, EPEA y
DHEA (p < 0,05, p < 0,01 y p < 0,001 respectivamente), y la reducción con DHA se acercó a la
significación (p = 0,051). La expresión de JNK no cambió significativamente con ningún
tratamiento, mientras que el DHA y la DHEA redujeron significativamente la JNK fosforilada (p <
0,05).

3.6. Atenuación de la migración e invasión de las células MDA-MB-231 in vitro

Los cambios provocados por los AGPICL n-3 y sus etanolamidas en la expresión de proteínas de
señalización en las células MDA-MB-231, en particular la reducción de la expresión de p38,
sugieren que el potencial de migración e invasión de estas células puede ser modulado. Las células
MCF-7 no son invasivas y, por tanto, no se estudiaron. Utilizando un kit comercial de ensayo de
migración de migración comercial, demostramos que sólo el DHA era capaz de atenuar
gravemente la migración de estas células (p < 0,001), ya que los demás tratamientos no tuvieron
efecto (Fig. 6B). Por el contrario, todos los tratamientos redujeron notablemente redujeron la
capacidad de invasión de estas células en torno al 60% (p < 0,01 y p < 0,001) (Fig. 6A).

3.7. Reducción de la expresión de proteínas relacionadas con la migración y la invasión.

(MMP) y las proteínas del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) están implicadas en el
aumento de la migración y la invasión de las células malignas en los tejidos circundantes. Los
análisis de Western blot de los niveles de estas proteínas expresadas en las células MDA-MD-231
tras el tratamiento con los LCPUFA n-3 o sus etanolamidas, mostraron una reducción significativa
de la expresión de la integrina β3 provocada por todos los tratamientos (p < 0,01) (Fig. 6C).

Curiosamente, sólo el DHA provocó una reducción de la expresión de proteínas MMP-1 (p < 0,05) y
VEGF (p < 0,01) en las células.

4. Discusión

En el presente estudio hemos demostrado que EPEA y DHEA tenían mayores efectos
antiproliferativos que sus ácidos grasos precursores en dos líneas celulares de cáncer de mama in
vitro (MCF-7 y MDA-MB-231).
Es importante destacar que estos endocannabinoides no afectaron al crecimiento de las células no
malignas MCF-10a, incluso a concentraciones altas y no fisiológicas. Rovito et al. también
informaron de que la EPEA y la DHEA reducían la viabilidad de las células MCF-7 BC [19], un efecto
que reflejaba nuestros hallazgos anteriores con células de cáncer de próstata [10] y apoyaba los
hallazgos actuales con células MCF-7. Sin embargo, Rovito et al. no investigaron los efectos de los
endocannabinoides sobre la viabilidad de la línea celular MBA-MD-231, agresivamente invasiva,
como se muestra aquí, ni determinaron los efectos importantes de estos endocannabinoides o de
sus ácidos grasos parentales sobre la migración y la invasividad de las células MDA-MB-231.
Nuestra observación y la de Rovito y cols., [19] de que los endocannabinoides n-3 no influyeron en
el crecimiento celular de las células MCF10a no malignas, sugirió una especificidad hacia las células
cancerosas únicamente; una consideración importante si estos tratamientos in vitro se van a
trasladar a terapias nutricionales clínicas in vivo. Más recientemente, Gaston et al. [20], también
han descrito los efectos de la adición de EPA y AA a las células MCF-7 BC y a las células de
glioblastoma humano T98G.

Sus resultados coinciden con los de nuestro estudio anterior, que muestra que la suplementación
con EPA redujo el crecimiento celular de las células MCF-7, pero no investigaron los efectos de
EPEA o D investigaron los efectos del EPEA o del DHA/DHEA. También mostraron que la
suplementación con AA no alteraba significativamente los niveles de AEA en las células MCF-7 de
acuerdo con nuestros estudios anteriores [11], pero no evaluaron los efectos efectos sobre la
invasión u otras vías de señalización. La expresión de receptores CB glicosilados y no glicosilados
en las células BC (Fig. 3) contrasta con nuestras observaciones anteriores en células de cáncer de
próstata de próstata, donde se detectó CB2 glicosilado, pero no CB1 glicosilado, tanto en las
células líneas celulares de próstata sensibles e insensibles a las hormonas [10]. La importancia
fisiológica de estas diferencias en la distribución del receptor CB1/2 y el papel de las formas
glicosiladas en la CB de los receptores receptores per se no está claro en la actualidad y justifica la
realización de más estudios.

Las concentraciones IC50 de endocannabinoides requeridas para inhibir la proliferación de células

de CB en este estudio parecen algo más altas que los niveles de otros endocannabinoides que se
han medido in vivo, en suero [21]. Un estudio realizado por Rovito et al. [19] en células de CB
sugirió que la potencia del DHAE y el EPEA puede aumentar alrededor de un orden de magnitud
con el aumento del tiempo de incubación (de 24 h a 96 h), lo que sugiere que la duración del
tratamiento puede ser un factor importante. Sin embargo, en el presente estudio, mientras que se
observó que la potencia de la EPEA aumentaba a las 48 h, no observamos ningún cambio con la
DHEA. Es probable que la concentración fisiológica de endocannabinoides en el lugar de formación
sea extremadamente difícil de determinar con precisión. Además, dado que la DHEA y el EPEA se
sintetizan a partir del DHA y el EPA de la dieta, los niveles in vivo de las omega3-etanolamidas
(DHAE y EPEA) dependerán probablemente de los niveles de omega3 PUFA en la dieta de un
individuo. Esta área relativa a la conversión de los PUFAs en endocannabinoides y cómo se
relacionan con los niveles circulatorios de estos compuestos, ciertamente requiere una mayor
investigación.

La FAAH es la principal enzima que cataboliza, y por tanto regula, la concentración de

endocannabinoides in situ. Nuestra detección de FAAH en las células MCF-7 (sensibles a las
hormonas), pero no en las MDA-MB-231 (insensibles a las hormonas), coincide con nuestros
hallazgos en células de próstata con un estado de sensibilidad hormonal similar [10]. Esto parece
ser diferente en las células de cáncer de colon, ya que un estudio de Wasilewski et al. [22]
demostró que la inhibición de la FAAH con un inhibidor selectivo (PF-3845) disminuía la viabilidad,
la migración y la capacidad de invasión de la línea celular Colo-205. Por el contrario, la eficacia
similar de los endocannabinoides en la inhibición de la proliferación de ambos tipos celulares de
CB observada en nuestro estudio, independientemente de su alta o baja expresión de FAAH,
sugirió que la enzima quizás no era importante en este proceso o que siempre había suficientes
endocannabinoides en nuestro sistema in vitro, independientemente de la actividad de FAAH.
Claramente que es necesario seguir trabajando en esta área.

La activación de los receptores CB1 y CB2 por parte de los endocannabinoides en las células de BC
en este estudio mostró tanto similitudes como diferencias con lo encontrado previamente en las
células de cáncer de próstata [10]. Si un derivado funciona como ligando de CB1 o CB2, entonces
la inhibición de los receptores con potentes antagonistas debería disminuir su potencia de unión al
receptor. Esto se ha observado en los efectos de la anandamida (AEA) sobre la muerte celular en
otras líneas celulares [23-25]. Sin embargo, Kuc et al. [26] observaron que el bloqueo de los
receptores CB1, CB2 y TRPV-1 en los queratinocitos JWF2, que sobreexpresan COX-2, no inhibió la
muerte celular mediada por la AEA, lo que sugiere que estos receptores no estaban implicados en
la señalización apoptótica en las células JWF2. Este último estudio, sin embargo, sólo analizó una
línea celular y una etanolamida n-6, mientras que nuestro estudio anterior en células de cáncer de
próstata con endocannabinoides n-3 mostró que el bloqueo de CB1 o CB2 con antagonistas sí
atenuaba sus efectos antiproliferativos [10].

Este estudio sugirió que el efecto era complejo y posiblemente dependía del tipo de célula, los
niveles relativos de los receptores CB, el tipo de ligando endocannabinoide utilizado y la integridad
de las importantes vías de señalización molecular presentes. En contraste con el trabajo de Kuc et
al., el bloqueo del receptor CB1 en el presente estudio disminuyó significativamente la eficacia del
DHA y el EPEA en las células MCF-7 y también del EPEA, el DHA y la DHEA en las células MDA-MB-
231, lo que sugiere que estos compuestos ejercen al menos algunos de sus efectos
antiproliferativos y anticancerígenos a través del receptor CB1. Del mismo modo, la inhibición de
CB2 afectó significativamente a la acción de EPA y EPEA en ambas líneas celulares, demostrando
de nuevo que EPA y EPEA pueden ejercer algunos de sus efectos a través de CB2 en estas células.
De estos resultados se desprende que el EPA/EPEA son mejores ligandos del receptor CB2 y el
DHA/DHEA del receptor CB1. Este intrigante efecto diferencial de los dos principales LCPUFA n-3 y
sus derivados NAE justifica una mayor investigación. En nuestro estudio anterior con líneas
celulares de próstata se encontraron efectos diferenciales similares de los dos NAE n-3.
Curiosamente, se descubrió que el bloqueo del receptor CB2 potenciaba la actividad de la DHEA,
reduciendo la CL50 tanto en las células MCF-7 como en las MDA-MB-231. Este efecto también fue
evidente en las células MDA-MB-231 con el ácido graso principal, el DHA, pero no con el EPA. Estos
resultados pueden no ser inesperados, ya que se ha informado de que los efectos
antiproliferativos inducidos por la anandamida en algunas líneas celulares de cáncer pueden ser
potenciados por antagonistas selectivos CB1 o CB2 [27,28]. En este caso, como se ha propuesto
para la anandamida, el bloqueo de los receptores cannabinoides en presencia de la DHEA puede
aumentar la capacidad de la DHEA para inhibir la proliferación de las células cancerosas a través de
uno o más mecanismos independientes de los receptores cannabinoides (revisado en [29]). De
hecho, es necesario establecer hasta qué punto la DHEA se dirige a receptores que no son CB1 ni
CB2, en particular a los canales de cationes V1 de receptores transitorios (TRPV1). Estos canales
pueden ser activados tanto por la anandamida como por los PUFAs omega-3 y Maccarrone et al.
(26) demostraron que la activación del receptor cannabinoide puede prevenir la aparente
apoptosis mediada por TRPV1 inducida por la anandamida [30]. En consecuencia, es concebible
que al bloquear los receptores cannabinoides CB se reduzca la protección mediada por los
receptores cannabinoides de las células MCF-7 y MDA, aumentando así la capacidad de la DHEA
para inducir la apoptosis a través de receptores como el TRPV1, que se ha demostrado que se
expresa en estas células [31]. Curiosamente, mientras que el DHA es un potente agonista del
TRPV1, el EPA inhibe la activación de este canal catiónico por varios agonistas [32] y esto puede
explicar, al menos en parte, la disminución de la CL50 observada con DHA/DHEA pero no con
EPA/EPEA en las células BC. Sin embargo, el motivo por el que este efecto se produce
específicamente con el antagonista del receptor CB2 y no con el antagonista del receptor CB1
requiere más investigación.

Muchos estudios que investigan el papel de los cannabinoides y de los endocannabinoides n-6 en
la inhibición de la proliferación de las células cancerosas sugieren la participación de la familia de
transductores de señales de la MAP quinasa [14, 15, 33–36)]. Nuestros hallazgos demostraron, en
general, que tanto los AGPICL n-3 y sus respectivos endocannabinoides n-3 también pueden
provocar cambios en la señalización de la MAPK, disminuyendo la expresión de la MAPK p38 y los
niveles de activados (fosforilados) de p38 MAPK (pp38) en las células de BC. En general, tanto la
p38 no fosforilada como la fosforilada se redujeron, aunque más la p38 fosforilada. En el caso del
tratamiento con EPA fosforilada (activada) se redujo significativamente, aunque la aunque los
niveles de p38 no fosforilada aumentaron. La activación de la p38 MAPK por parte de los
cannabinoides se ha descrito anteriormente [16,17,34-37] y normalmente se piensa que esta
activación conduce a un aumento de la apoptosis, pero aquí mostramos una regulación a la baja
tanto de la p38 MAPK total como de la pp38 activada por los AGPIC n-3 y sus endocannabinoides
en ambas células de BC, un hallazgo que se correlaciona con la disminución de la viabilidad celular
de estas células. Es sabido que la p38 MAPK puede desempeñar un papel doble en la regulación de
la muerte celular mediando la supervivencia celular o la muerte celular a través de diferentes
mecanismos, incluyendo la apoptosis. Las funciones específicas de las p38 MAPK en la inhibición
del de crecimiento y apoptosis parecen depender de los estímulos, el tipo de célula tipo de célula
y/o de las isoformas enzimáticas presentes (revisado en [38]).

En el presente estudio no determinamos esto último.

Nuestras observaciones de una reducción de ERK y pERK por algunos, pero no todos los LCPUFA n-
3 y endocannabinoides n-3, especialmente en las células MDA-MB231, se correlacionan con los
hallazgos de Ellert-Miklaszewska et al. demostraron la inactivación (reducción de la fosforilación)
de ERK tras tratamiento de células de glioma con el agonista cannabinoide sintético WIN 55.212-2,
y relacionaron esta inactivación con una mayor apoptosis a través de la activación de la proteína
pro-apoptótica Bad [39]. En nuestro estudio, la DHEA en redujo significativamente la ERK
fosforilada, aunque la ERK ERK no fosforilada no cambió. Otros estudios también han demostrado
inactivación de ERK en respuesta a los cannabinoides y a los agonistas agonistas del receptor CB2
[40]. Los resultados de la reducción de la activación de la ERK concuerdan con los efectos
proapoptóticos de la inhibición de la vía de la ERK, como se indica en los estudios de los estudios
anteriores, y no con los efectos proapoptóticos de la activación de la vía como sugieren algunos
autores (véase más arriba). En la revisión de Cagnol y Chambard, 2009, se sugirió que pueden
surgir diferentes efectos de la de la activación o inactivación de la ERK dependiendo de la
localización de la de la activación, y la presencia o ausencia de especies reactivas de oxígeno [41].

Nuestros hallazgos de una reducción general de la pJNK activa, pero no de la JNK, en particular con
el tratamiento con DHA y DHEA en ambos tipos de células, pueden considerarse inhibidores de la
proliferación/apoptosis celular [42,43]. Sin embargo, la activación de JNK también puede actuar
como un "arma de doble filo" que tiene efectos tanto pro como antiapoptóticos, quizás
dependiendo de la duración de la activación [42,43]. La activación de CB1 se acopló a la activación
de JNK, lo que apoya nuestra sugerencia de que la DHEA actúa principalmente a través de CB1.
Nuestros resultados contrastan con las observaciones de que la muerte celular inducida por la
anandamida requería la activación de p38 y JNK en las células de la médula PC12 [37,43]. En
cambio, observamos efectos antiproliferativos cuando la fosforilación de JNK estaba disminuida, lo
que sugiere que pJNK estaba apoyando un papel proliferativo; podría ser que la
activación/inactivación de las otras MAPKs, como se ha descrito anteriormente, fueran los factores
más dominantes.

La metástasis de los tumores, en la que las células tumorales migran desde el tumor primario e
invaden los tejidos circundantes, es uno de los principales factores causantes de las elevadas tasas
de mortalidad registradas en varios tipos de cáncer. Impedir la dispersión de las células tumorales
malignas por todo el cuerpo supondría un enorme beneficio clínico en la lucha contra el cáncer en
sí. Durante el proceso metastásico, las células cancerosas circulantes se adhieren a la matriz
extracelular (MEC) de diferentes tejidos y órganos, facilitada por diversas moléculas de adhesión
(por ejemplo, integrinas) expresadas en la superficie de la mayoría de las células y, en particular,
en las células endoteliales vasculares. A continuación, la MEC en el lugar de adhesión es degradada
por varias metaloproteinasas de matriz de zinc (MMP), permitiendo así que las células malignas
entren en los tejidos/órganos e inicien nuevos tumores [44]. La activación de la vía MAPK también
está implicada positivamente en el proceso metastásico y nuestros hallazgos de que los n-3
LCPUFA y sus endocannabinoides atenúan esta vía sugieren que estos lípidos podrían reducir la
migración e invasión de las células MDA-MB231 BC. Demostramos claramente que tanto los AGPIC
n-3 como sus respectivos endocannabinoides redujeron significativamente el potencial invasivo de
estas células de CB in vitro, mientras que sólo el DHA redujo su potencial migratorio. Estos efectos
también se reflejaron en la expresión significativamente reducida de una proteína de molécula de
adhesión de integrina en estas células. El DHA fue también el único lípido que atenuó tanto la
MMP-1 como el VEGF en estas células. Esto contrasta con los hallazgos de McCabe et al., que
demostraron que el DHA no atenuaba la expresión de MMP-2 en las células Caki-1, aunque
reducía su capacidad de invasión, de forma similar a nuestros hallazgos [45]. Mohammadpour y
otros [46] demostraron recientemente que el agonista selectivo del receptor CB1 (araquidonil-2'-
cloroetilamida) presentaba un potencial antiinvasivo en las células MDA-MB-231 y en las células
madre derivadas de ellas, mientras que el AM251 (antagonista selectivo del CB1) mostraba los
efectos opuestos. Estos autores no determinaron los efectos de los endocannabinoides n-3 sobre
la invasividad de sus células.

En resumen, hemos demostrado que tanto los LCPUFAs n-3 como sus etanolamidas pueden
atenuar la viabilidad celular de las células de CB sensibles a las hormonas y y la invasividad de las
células MDA-MB231 insensibles a las hormonas. La migración celular sólo fue atenuada por el
DHA. Estos cambios en Estos cambios en la función fueron mediados, al menos en parte, por los
receptores CB1/2 y se reflejados en la atenuación de las vías MAPK p38, ERK y JNK.

Estos resultados apoyan nuestra hipótesis de que los efectos de los AGPIC en las células de CB las
células BC están mediados, al menos en parte, por sus endocannabinoides.

Sin embargo, se necesitan más estudios para determinar si se producen hallazgos similares in vivo
y para comprender el papel exacto que desempeñan los endocannabinoides omega-3 en los
conocidos beneficios para la salud de los LCPUFAs omega-3, incluyendo sus efectos pro-
cardiovasculares y anticancerígenos.