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TRABAJO PRÁCTICO N° 2:
- 2018 -
Universidad Nacional de Misiones
Cátedra de Bromatología y Nutrición
BIOQUÍMICA Y FARMACIA
OBJETIVOS
INTRODUCCIÓN
La reacción que ofrece recién admitida al papel tornasol es anfótera. Las bacterias
lácticas desarrollan la fermentación láctica, lo que hace que las leches comerciales tengan
reacción ácida.
Constituye la leche una emulsión natural, formada principalmente por agua, materia
grasa, micelas de caseína, lactosa y sales minerales, además de pequeñas cantidades de
albúmina, colesterolina, lecitina, etc. y los gases oxígeno, nitrógeno y anhídrido carbónico.
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así una emulsión más estable (duradera en el tiempo), de la cual, no se separa la capa de
crema. La leche sometida a este procedimiento recibe el nombre de leche homogeneizada.
Por acción de los gérmenes que existen no sólo en la leche, sino también en el
ambiente, el azúcar de la leche se va transformando en ácido láctico disminuyendo el pH del
producto, lo cual facilita la agrupación de los glóbulos de grasa y de las micelas de caseína.
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- Densidad
- Materia Grasa
- Sólidos totales
- Acidez
- Índice crioscópico
- Contenido de Proteínas
Pasteurización
- Ensayo de la fosfatasa
- Ensayo de la peroxidasa
Esterilización
- Ensayo de turbidez
- Contenido de Lactosa
- Cenizas
- Investigación de antibióticos
- Aflatoxina M1
- Composición de ácidos grasos
- Investigación de lípidos de origen vegetal
- Presencia de metales pesados
- Presencia de pesticidas
- Presencia de nitritos y nitratos y otros conservantes
- Examen microbiológico
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En caso de tener que medir algún volumen exacto para alguna determinación la
leche debe estar a una temperatura entre los 15-20 °C antes de medir dicha porción.
Observación: Como la leche se altera rápidamente por acción del tiempo, conviene
proceder pronto a su análisis y si esto no fuera posible, se le añade un agente conservador.
Los agentes conservadores utilizados con mayor frecuencia en el laboratorio son dicromato
potásico (se añade aproximadamente 1 g por litro de leche), cloruro mercúrico* (se añade
0,03 g por litro de leche) y formol (se añaden 40 gotas por litro de leche).
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Si bien los procedimientos para la determinación del contenido de grasa en leche son
numerosos, se describirán los que dan buenos resultados y son más prácticos.
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Reactivos:
1) NH4OH (δ=0,91)
2) Etanol 96°
3) Éter etílico (libre de peróxidos)
4) Éter de petróleo (punto de ebullición inferior a 65°C)
5) Agua destilada
Procedimiento:
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b) Método de Gerber
Este método volumétrico muy difundido en el control de rutina de la leche y
productos lácteos en general, consiste en la separación de la materia grasa por
solución en ácido sulfúrico de todos los otros componentes de la leche, seguida
de centrifugación en tubos especialmente calibrados.
El método emplea también alcohol amílico que ayuda a romper la emulsión de
las grasas y previene la carbonización de las mismas.
Reactivos:
1) H2SO4 para Gerber (δ= 1,813 - 1,817 a 20 °C, aproximadamente 90%)
2) Alcohol amílico puro (δ= 0,809 - 0,813 a 20 °C, libre de grasas comprobado
por un ensayo en blanco)
Procedimiento:
1) Medir con pipeta 10 mL de H2SO4 para Gerber y colocarlos en el butirómetro,
evitando mojar las paredes internas del cuello.
2) Agregar suavemente con pipeta aforada 11 mL de leche, cuidando que forme
un estrato encima del ácido y no se mezcle con él.
3) Agregar 1ml de alcohol amílico inmediatamente.
4) Tapar el butirómetro con el tapón de caucho correspondiente y agitar en
forma efectiva pero con mucha precaución (tener en cuenta que la
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*Para proteger las manos del calor conviene tomar el butirómetro con un trapo
o repasador, sujetando con el dedo pulgar el tapón de goma de manera firme.
Los tres líquidos se mezclarán tras voltear varias veces el butirómetro. En algunos
casos se forman coágulos persistentes que se eliminan agitando fuertemente,
aunque siempre con precaución, un tiempo prudencial.
Nota 1: Siendo dificultosa la separación de los pequeños glóbulos de grasa en las
leches “homogeneizadas”, se recomienda volver a centrifugar después de
calentar en el baño a 65-70 °C, procediendo así hasta que la lectura alcance un
máximo constante.
Nota2: Se recomienda la realización de este ensayo por duplicado simultáneo
sirviendo, cada butirómetro, como contrapeso para el equilibrio de la centrífuga.
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En la práctica, hay que saber que antes de cada uso, el pH-metro debe ser calibrado.
Para ello se utilizan soluciones tampón de pH conocido (pH 7 y pH 4). La medida
potenciométrica del pH de la leche presenta un inconveniente. Como hemos mencionado
con anterioridad, la leche es una emulsión de glóbulos de grasa dispersos en una solución
acuosa. La grasa láctea puede depositarse sobre el electrodo del equipo, aislándolo del
medio y haciendo que no se registre ninguna respuesta. Por este motivo, es importante
diluir la leche con suficiente agua destilada para evitar la formación de la película grasa.
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Procedimiento:
Dejar estabilizar y calibrar el pH-metro de acuerdo a las instrucciones del aparato (para la
calibración usar soluciones buffer pH 7 y 4). Los electrodos deben mantenerse sumergidos en agua
destilada y lavarse cuidadosamente, antes y después de cada uso, con agua destilada (secar el
exceso con papel tissue, cuidando no frotar el electrodo).
Reactivos:
Procedimiento:
El punto final de la valoración ácido base también puede ser evaluado utilizando un
medidor digital de pH (medición potenciométrica). En este caso, previo a la titulación
diluir la muestra de leche con agua destilada (50:50) para evitar la formación de una
capa grasa en el electrodo que impida realizar la medición.
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Cálculos:
Nota 2: Para expresar la acidez en grados Dornic (°D) (forma común en la industria
láctea), se multiplica el resultado en % ácido láctico por 100.
El método crioscópico es el método más rápido y más exacto para detectar la adición
de agua a la leche. Este método se basa en el hecho que, a condiciones normales de presión,
el agua pura se congela a los 0 °C. Si al agua pura le agregamos algún soluto, el punto de
congelación de esa solución será inferior a los 0°C. La diferencia entre los puntos de
congelación de la solución y el solvente puro se denomina descenso crioscópico y es
directamente proporcional a la concentración de soluto en la solución.
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Constituye una prueba química que indica, dentro de ciertos límites, el grado de
contaminación de la leche y sus condiciones para la conservación. El ensayo puede
considerarse como complementario del examen microbiológico o sustitutivo del mismo en
primera instancia, siendo más rápido que el recuento en placa y sus resultados más
reproducibles.
Reactivos:
Procedimiento:
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a) Ensayo de la Fosfatasa
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Reactivos:
Procedimiento:
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b) Ensayo de la Peroxidasa
La enzima peroxidasa, por ser más termorresistente que la fosfatasa alcalina (se
inactiva a temperaturas superiores a los 80 °C), permanece activa tras los procesos de
pasteurización del tipo LTLT (Low Temperature Long Time). Cuando la leche es pasteurizada
mediante procesos de alta temperatura, la enzima se inactiva no apareciendo color tras 30 s
de la reacción con bencidina.
Reactivos:
Procedimiento:
Resultados:
Si luego de precipitar las proteínas de la leche por adición de sulfato de amonio hasta
saturación, el sobrenadante presenta turbidez visible al calentarse, la esterilización fue
deficiente.
Reactivos:
1) Sulfato de amonio
Procedimiento:
Resultados:
Nota 1: Esta determinación no es útil para leches UHT ya que puede dar falsos
positivos (leve turbidez).
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Para evitar este fenómeno se añaden a la leche diferentes sustancias, siendo las más
corrientes: el bicarbonato y el carbonato de sodio, el ácido bórico, el ácido salicílico, el ácido
benzoico, el aldehído fórmico, el agua oxigenada, etc.
Todas estas adiciones están prohibidas en la leche destinada a consumo público pues
de los estudios realizados sobre el tema se dedujo que los antisépticos químicos si bien
impiden la fermentación láctica o la retardan, dando a la leche un aspecto análogo al de la
leche fresca, no impide la propagación y desarrollo de otros gérmenes.
Ensayo de Hehner
Reactivos:
H2SO4 90-94 % con vestigios de Cl3Fe
Procedimiento:
Se diluyen 10 mL de leche con igual volumen de agua en un tubo de ensayo
ancho. Luego, con una pipeta se deja deslizar por las paredes lentamente y
evitando la mezcla el reactivo. Se realiza esto de manera que se formen 2 capas y
en la superficie de contacto de las mismas se producirá una coloración violeta
(con apariencia exterior de anillo) si existe formaldehído en la leche.
Nota 1: También se suele detectar la presencia de formaldehído en la leche
realizando el método para grasas de Gerber utilizando H2SO4 con trazas de Cl3Fe.
Nota 2: La coloración violeta no aparece ante grandes cantidades de
formaldehído.
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BIBLIOGRAFÍA RECOMEDADA
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